侵染唐菖蒲和百合3种病毒的多重RT-PCR检测方法

本文针对侵染百合和唐菖蒲的南芥菜花叶病毒、百合无症病毒和菜豆黄花叶病毒,建立了同时检测3种病毒的多重RT-PCR检测方法.该方法根据上述3种病毒保守的衣壳蛋白基因序列,设计特异性引物,优化了反应条件.通过对9种不同寄主和6种病毒的检测,验证该检测方法具有很高的特异性、稳定性,其灵敏度为植物总RNA稀释101～102倍.特别是,该方法缩短了检测周期,适合于植物病毒快速检测工作的需要.     

南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒的单抗制备及其检测应用

 用与牛血清白蛋白偶联的南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）衣壳蛋白的C端12个氨基酸多肽为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、筛选、克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗SRBSDV和水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）单克隆抗体（MAb）的杂交瘤细胞株3F1、5G1。3F1、5G1单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6,抗体类型及亚类均为IgG1, kappa链。 Western blot分析表明,2株单克隆抗体均与SRBSDV和RBSDV的外壳蛋白亚基有特异反应。利用单克隆抗体3F1建立的dot-ELISA检测方法能准确、特异、灵敏地检测田间稻飞虱及水稻样品中的SRBSDV和RBSDV。SRBSDV和RBSDV单克隆抗体的制备及检测方法的建立为水稻黑条矮缩病的诊断、预测预报及科学防控提供了技术支撑。     

植物抗病毒的遗传工程

植物抗病毒道传工程中利用病毒衣壳蛋白基因、弱毒株系的完整基因组、病毒反义RNA序列和RNA随体序列等方法获得作物抗病毒转基因植物,本文列举了这些方法的最新应用实例。     

植物病毒分子检测方法概述

植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成. CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据.广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍.     

双重RT-PCR同步检测马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒

根据马铃薯A病毒全基因序列和马铃薯卷叶病毒衣壳蛋白区序列分别设计PVA和PLRV的特异性引物,应用双重RT-PCR同步检测马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒,分别得到300bp和222bp大小的扩增片段.试验从反转录、PCR等方面对双重RT-PCR同步检测2种病毒进行了探索和优化.结果表明反转录反应中dNTPs浓度、2种病毒下游引物浓度比例以及PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR同时检测PVA和PLRV有较大的影响.     

一套适合烤烟3种RNA病毒的RT-PCR检测方法

烤烟是贵州省的重要经济作物,但是烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY) 3种RNA病毒在贵州烤烟产区造成巨大损失。3种病毒引起的症状相似性造成了田间诊断的困难。针对贵州烟区的样品,开发了一套包含了靶向3种病毒外壳蛋白基因特异性片段的RT-PCR检测方法。3对引物涵盖的基因片段长度分别为:TMV-120 bp,CMV-240 bp,PVY-660 bp,退火温度均为55°C。通过1次PCR反应,就可以根据扩增条带的大小判断病毒的种类,还可以检测复合侵染的样品中2种病毒与3种病毒混合DNA的种类。该方法非常适合基层检测站点快速和高效地检测大批量烟叶样品,指导后续防控工作的开展。     

实时荧光RT-PCR检测辣椒轻斑驳病毒的初步研究

本研究选取辣椒轻斑驳病毒PMMoV、烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV和马铃薯Y病毒PVY作为试验材料,根据PMMoV衣壳蛋白(CP)RNA的序列特异性位点,设计出Taqman荧光探针及其引物,采用实时荧光RT-PCR技术对PMMoV进行快速检测,同时与ELISA方法进行了灵敏度比较,结果表明：该方法具有较高的灵敏度及较强的特异性,PMMoV检测结果为阳性,TMV、CMV和PVY均无荧光信号,为阴性,灵敏度是传统的ELISA方法的100倍,而且大大缩短了检测时间。该方法快速、准确、灵敏、简便、安全,具有实际应用价值,适用于植物病毒病害的快速检测。     

利用RNA介导的抗病性获得抗2种病毒的转基因烟草

 RNA介导的病毒抗性(RMVR)是近年发展起来的一种新的植物抗病毒基因工程策略,具有抗病性强、抗性持久、生物安全性高等特点。利用该策略培育多抗病毒植株具有广阔的应用前景和重要的实践意义。本研究将非翻译的马铃薯X病毒的衣壳蛋白(PVX-CP)基因和非翻译的马铃薯Y病毒的衣壳蛋白(PVY-CP)基因组成嵌合基因,构建植物表达载体pROKXY,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,获得6株对PVX和PVY的混合侵染表现为免疫的转基因植株。分子分析表明,这种抗性为RNA介导的病毒抗性。这一研究结果为利用RMVR进行植物多抗病毒育种提供了重要数据和资料。     

miRNA在植物病毒基因组中的靶基因预测及分析

microRNA(miRNA)是一类长约22nt的内源性的非编码小RNA,在植物的生长发育和胁迫响应中起重要调控作用。本文通过生物信息学的方法,在miRBase中下载了12种植物的miRNA序列;在DPVweb和VIDE病毒数据库中查找侵染这些植物的病毒,并在NCBI数据库中搜索其基因组序列,共获得173种病毒的基因组序列。用psRNATarget在线软件预测植物miRNA在植物病毒中的靶基因,发现植物miRNA可能参与调控包括聚合蛋白、衣壳蛋白、逆转录酶、复制相关基因、通读蛋白、依赖RNA的RNA聚合酶等多种植物病毒基因的表达。     

中国水仙上一种球形病毒的研究Ⅱ.病毒提纯及其生化特性

 繁殖于昆诺阿藜(Chenopodium quinoa)、千日红(Gompherena globosa)及番杏(Tetragonia.expansa)上的病毒分离物,经PEG6000沉淀结合差速离心浓缩后,用Sepharose 4B柱层析法进行分离纯化,获得保持侵染活性的病毒纯化物;而且表明,用昆诺阿藜繁殖病毒,效果最优。紫外扫描测定,纯化病毒的最高吸收波长为258nm,最低吸收波长为244nm,A260/A280为1.515。分析超速离心测定,病毒粒体为单一沉降组分,S20.w约73S。SDS-PAGE结果表明,病毒衣壳蛋白亚基由一条分子量为27.88×10³±2.99×10³daltons的多肽组成。根据紫外吸收估计,病毒粒体中核酸含量约12-15%;RNaseA酶解及变性处理病毒核酸后琼脂糖变性电泳结果说明,病毒基因组为一条ssRNA。根据该病毒的生物学特性及生化特性,初步确认为一种新的病毒分离物,并定名为中国水仙条纹病毒(Chinese Narcissus Strip Virus,ChNSV),其密码程式为R/1:*/12-15:S/S:S/*。     

新疆哈密瓜病毒类型及分布

 1981-1984年对新疆主要瓜产区的病毒发生情况进行了调查,可归纳为6个病毒类型。除1类型尚需进一步鉴定外,其他5类型分别属于黄瓜花叶病毒(CMV)、西瓜花叶病毒二号(WMV-2)、南瓜花叶病毒(SqMV)、烟草坏死病毒(TNV)和甜瓜叶脉坏死病毒(MVNV)。在大流行的1983年WMV-2和CMV,WMV-2和SqMV,CMV和SqMV以及WMV-2、SqMV和CMV的混合侵染率比1982年为高。各类型病毒的侵染率在不同地区也有较大的变化。     

新疆哈密瓜病毒病的免疫电子显微镜诊断

 研究了免疫电镜技术在新疆哈密瓜病毒病诊断中的应用。预先用黄瓜花叶病毒(CMV)、西瓜花叶病毒-2(WMV-2)和南瓜花叶病毒(SqMV)的抗血清处理的电镜载网可以分别捕获到大量的CMV、WMV-2和SqMV的病毒粒子。不同抗血清处理的电镜载网对病毒粒子的捕获具有严格的专一性。抗血清处理过的电镜载网可以贮存于4℃冰箱中达1个月之久仍然具有良好的捕获病毒粒子的能力。一个样品的全部检测程序可以在约30分钟内完成。这些结果肯定了免疫电镜技术在检测CMV、WMV-2和SqMV时是有效的,并为进一步研究新疆哈密瓜病毒病的流行规律提供了迅速、准确的手段。     

新疆、甘肃甜瓜病毒病的鉴定及防治

对甘肃、新疆两省(区)186个厚皮甜瓜病毒病标样的鉴定结果表明,病毒种类有黄瓜花叶病毒(CMV)、西瓜花叶病毒2号(WMV-2)和南瓜花叶病毒(SqMV)。其中WMV-2是主要病毒种类。不同地区或同一地区不同年份各个病毒的消长有较大的变化。桃蚜(Myzus persicae)、豆蚜(Aphis craccivora)及麦二叉蚜(Schizaphis graminum)可传播WMV-2,其中桃蚜的传毒效率最高。棉蚜(Aphis gossypii)可传CMV。种广可传带SqMV,其带毒率为7.6%。对1300个甜瓜品种及材料的抗病性试验结果没有发现任何免疫和抗病类型,但白兰瓜类型较哈密瓜类型抗病,薄皮甜瓜较厚皮甜瓜抗病,其中中国梨瓜龙田一号发病很轻。覆盖银灰膜、喷高脂膜及种植高粱隔离诱杀带等综合防治措施可使发病率减少82.0%,增产15.7—40.5%。     

新疆哈密瓜上两种病毒的血清学特性

铜绿金龟(虫甲)是北京地区的一种重要害虫,一年发生一代,以3龄幼虫在土壤51～75厘米深层越冬。成虫每年6～9月出现,成虫有较强的趋光性,一日内以19:30′～21:00′活动最盛。成虫食性杂,每一雌虫一生可产卵30～40粒。产卵期为4～5天。在9种含水量(0.3、2、4、6、8、10、15、20和25%)土壤与5种温度(10、17、25、30、37℃)组合下,试验结果卵在温度25℃与8～15%含水量土壤内孵化率最高。卵的发育起点温度是9.14±1.15℃,发育有效积温为178.05日度。幼虫季节性垂直分布与10厘米土温变化有关,秋季当10厘米土温低于10℃,幼虫向土壤深层迁移,春季当10厘米土温高于6℃幼虫向土壤表层迁移。每年4～5月及8～9月幼虫10厘米作物外进行为害,这时亦导防治的有利时机。     

西瓜花叶病毒2号南瓜分离物的鉴定及其外壳蛋白基因序列分析

 利用电镜和酶联免疫吸附测定法(ELISA)在黑龙江省采集的南瓜病样中检测到西瓜花叶病毒2号(WMV-2)。再利用免疫PCR (IC-PCR)和反转录PCR (RT-PCR)方法,扩增获得其外壳蛋白(CP)基因片段,并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明,该分离物CP基因全长为852个核苷酸,编码由284个氨基酸组成的31.8 kDa蛋白。与国外已报道的WMV-2 CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.2%~94.0%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.5%~98.1%。与国内2个分离物相比,和山西分离物核苷酸和氨基酸的同源性都达到98.5%,和郑州分离物核苷酸和氨基酸的同源性分别为91.5%和95.0%。     

利用RT-PCR方法检测甜瓜种子中南瓜花叶病毒

通过设计特异性引物SQCPF/SQCPR,扩增南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)CP基因的保守序列,进行RT-PCR,对扩增得到的特异性片段进行序列测定,测序结果显示扩增产物序列与GenBank中登录的SqMV外壳蛋白基因存在87%～96%的一致性;建立了适用于检测甜瓜种子中南瓜花叶病毒的RT-PCR结合ELISA方法,通过在酶联板的反应孔中直接进行反转录合成cDNA,能扩增到预期大小的DNA条带,且检测灵敏度高于DAS-ELISA方法10倍以上。用建立的RT-PCR结合ELISA方法检测进境甜瓜种子携带的SqMV,在42份样品中检出4份阳性样品。     

侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及RT-PCR扩增外壳蛋白基因研究

 从杭州市郊区及本校附近菜园地表现严重花叶症状的花椰菜上分离到一种线状病毒,接种6科31种鉴别寄主,能侵染5科22种植物。病组织超薄切片可见风轮状内含体和片层聚集状内含体。感病的芥菜叶片,用0.5mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.5)匀浆后汁液加4% PEG-8000沉淀3h,5%~40%甘油梯度离心纯化病毒,可获得较高的产量。提纯的病毒均为一弯曲的线状颗粒,长度740nm左右。病毒提纯液于264nm处有一吸收峰,为典型的核蛋白紫外吸收。TuMV-H分离株抗血清包被的铜网能大量吸附病毒颗粒。用特异的PCR引物扩增其外壳蛋白基因,可得-0.9Kb的片段。     

西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

 利用RT-PCR从新疆昌吉地区表现花叶、疱斑、扭曲等症状的南瓜病株上检测到西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物(简称WMV-2-XJ-CJ),并测定了该分离物外壳蛋白(CP)基因序列。序列分析表明,新疆昌吉分离物CP基因全长850个核苷酸,编码197个氨基酸。与国内外报道的12个WMV-2CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.6%~98.3%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.7%~99.3%。新疆昌吉分离物在CP N'端可变区明显不同于国内外报道的核苷酸序列。WMV-2新疆昌吉分离物与日本和郑州分离物较其它国家和地区的分离物多出6个核苷酸,但其核苷酸及其推导的氨基酸序列差异较大。新疆昌吉分离物外壳蛋白有2个氨基酸残基明显不同于其它分离物,其中蚜传株系的特征结构域DAG突变为DAE。     

The partial characterization of melon vein-banding mosaic virus, a newly recognized virus infecting cucurbits in Taiwan

A potyvirus (designated as no. 656) causing mosaic or vein-banding symptoms on melons was isolated and characterized. The virus was mechanically transmitted to 14 herbaceous plant species, and induced mosaic symptoms in most cucurbitaceous plants. Aphis gossypii transmitted the virus non-persistently, and flexuous filamentous virus particles c. 755 nm in length were consistently observed in extracts of the infected pumpkin leaf tissues. Pinwheel and tubular inclusions were observed in the cytoplasm of infected zucchini leaf tissues. The virus was purified from infected pumpkin leaves by isopycnic centrifugation (Cs₂SO₄). The molecular weights of purified capsid and cylindrical inclusion proteins as estimated by SDS-PAGE were 32·5 and 73 KD_a, respectively. In SDS-immunodiffusion tests, antiserum to virus particles from isolate 656 was serologically unrelated to ZYMV, WMV-2, PRV-W and a type W variant of PRV, but antiserum to its cylindrical inclusion protein did produce spur precipitin bands between homologous and WMV-2 antigen wells. However, neither WMV-2 virus particle nor cylindrical inclusion antisera reacted with this virus. Furthermore, this virus was not serologically related to BCMV, BYMV, CYVV, SMV, WMV-M or ZYFV. Based on test results and symptomatology, this virus appears to be a new potyvirus, for which the name melon vein-banding mosaic virus (MVbMV) is proposed.     

转基因甜瓜植株的获得及其抗病性

甜瓜（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）子叶外植体能被含双元载体的根瘤农杆菌菌不妨功体内含１个ＮＰＴ－Ⅱ基因（新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因）,以供选择卡妹妹纱抗性的转化甜 １个ＷＭＶ－２ ＣＰ基因（西瓜花叶病毒２号外壳蛋白基因）。卡那霉素抗性植株经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交试验表明,外源的ＷＭＶ－２ ＣＰ基因确已通过农杆菌介导的转化途径导入甜瓜细胞。目前转基因甜瓜已开花结果。攻毒试验表明,与对照相比,转基因