苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基因鉴定、克隆及杀虫活性分析

苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、cry2Ab和一种新的cry1类基因,SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达,在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins,ICPs)基因,并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段(1.95kb)插入表达载体pET-21b,转化EscherichiacoliRosetta(DE3)菌株,表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性,LC50分别为100.74μg/mL和29.87μg/mL,进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。     

苏云金芽孢杆菌cry9Aa基因的克隆、表达及活性分析

为了解决目前广泛使用的cry1A类基因的抗性问题,获得对鳞翅目害虫高效杀虫基因,从菌株SC5D2和T03C001中鉴定并克隆到了2个新型cry9Aa基因,被Bt国际命名委员会分别正式命名为cry9Aa3和cry9Aa4,并进一步对其编码的蛋白进行活性测定。结果显示,2个基因对小菜蛾、玉米螟均具有较高的杀虫活性,其中对小菜蛾的LC50分别为1.83μg/mL和1.90μg/mL,对玉米螟的LC50分别为6.93μg/mL和1.06μg/mL。同时,两种Cry9Aa蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾都具有较高的杀虫活性,LC50分别为1.74μg/mL和1.39μg/mL,与敏感小菜蛾杀虫活性测定数据相当,表明Cry9Aa与Cry1Ac没有交互抗性。     

苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基区鉴定、克隆及杀虫活性分析

苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、crygAb和一种新的cry1类基因，SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达，在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins，ICPs）基因，并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段（1．95kb）插入表达载体pET-21b，转化Escherichia coli Rosetta（DE3）菌株，表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性，LC60分别为100．74μg／mL和29．87μg/mL，进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。     

二化螟Cry1Ac汰选品系对不同Bt蛋白的敏感性

为明确靶标害虫对Bt蛋白的抗性及对不同类型Bt蛋白的交互抗性,采用生物测定法进行了二化螟Chilo suppressalis(Walker)敏感品系和Cry1Ac汰选品系在Cry1Ac毒饲料上的时间-死亡率反应、对不同Bt杀虫蛋白的敏感性及不同Bt蛋白复配组合对二化螟毒力效果的研究。结果表明,二化螟Cry1Ac汰选品系已对36.67μg/mL(LC_(50))的Cry1Ac杀虫蛋白产生了一定的适应性,但对308.69μg/mL(LC90)的Cry1Ac蛋白反应仍较敏感。Cry1Ac敏感品系和汰选品系对Cry1Ab蛋白的LC_(50)分别为1.40μg/mL和3.86μg/mL,二者差异显著,但对Cry1Ca(1.63μg/mL和1.73μg/mL)或Cry2Aa(127.48μg/mL和144.50μg/mL)的LC_(50)差异不显著,即Cry1Ac汰选品系与Cry1Ab存在明显的交互抗性,但与Cry1Ca和Cry2Aa不存在交互抗性。在不同Bt蛋白复配组合中(1∶1复配),Cry1Ab+Cry1Ca、Cry1Ab+Cry2Aa和Cry1Ca+Cry2Aa增效作用最为显著。表明抗虫基因cry1Ca和cry2Aa可作为双价转基因抗虫水稻研发的候选基因。     

Cry2Ab杀虫蛋白对小地老虎幼虫致死效果及体内酶活性的影响

为治理小地老虎的危害,研究了Bt杀虫蛋白对小地老虎幼虫的控制作用.室内生物测定结果表明,Cry2Ab杀虫蛋白对小地老虎初孵幼虫的致死效果高于Cry1Ac杀虫蛋白.取食含有Cry2Ab杀虫蛋白人工饲料的小地老虎幼虫体内的中肠总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性高于对照,当人工饲料中Cry2Ab杀虫蛋白含量达到12μg/g时,小地老虎幼虫中肠氨肽酶活性显著升高;而取食含有Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料的小地老虎幼虫中肠蛋白酶活性无显著变化.此外,小地老虎幼虫取食含有Cry2Ab杀虫蛋白的人工饲料后,体内谷胱甘肽-S-转移酶活性显著升高,而取食合有Cry1Ac杀虫蛋白的人工饲料后其变化不明显.     

Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的最小活性区研究

为了确定Cry9Aa3蛋白对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)的最小活性区,根据NCBI BLAST比对结果与SWISS-MODEL同源建模结果,设计了12对截短引物,以cry9Aa3全长序列为模板,扩增出了12种不同截短片段,与pEB载体重组后的阳性克隆,转入大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Rosetta(DE3)诱导表达,提取蛋白。对小菜蛾和亚洲玉米螟的生物学活性测定,发现截短蛋白Cry9Aa3-45~700、Cry9Aa3-1~654,对小菜蛾和亚洲玉米螟有较高的活性,其中截短蛋白Cry9Aa3-45~700对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为5.27、7.56μg/g,截短蛋白Cry9Aa3-1~654对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为7.76、7.79μg/g,与阳性对照无显著差异,而截短蛋白Cry9Aa3-1~653和Cry9Aa3-46~700(LC50200μg/g)对幼虫几乎丧失生物学活性。这说明Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的杀虫活性区相同,最小活性区位于45I和654P之间。     

水稻螟虫对4种Bt杀虫蛋白的敏感性测定

采用人工饲料喂毒法和浸叶喂毒法测定了二化螟、大螟和稻纵卷叶螟初孵幼虫对4种Bt杀虫蛋白的敏感性。二化螟对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C和Cry2A的LC50分别为1.739、2.6452、.794 ng/mg和15.965 ng/mg;大螟依次为2.455、10.046、11.803 ng/mg和35.359 ng/mg;稻纵卷叶螟依次为4.000、1.611、69.031μg/mL和12.708μg/mL。作者就不同水稻螟虫对不同Cry蛋白的敏感性差异及其在转基因抗虫作物中的应用作了讨论。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ie新基因的克隆、表达与生物活性测定

为获得新的鳞翅目害虫杀虫基因,根据已知cry1I类基因编码区设计简并引物,采用直接克隆法,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BN23-5质粒DNA为模板进行扩增,并对得到的基因进行鉴定和分析。结果表明:克隆得到一个完整的cry1Ie基因,全长2 160 bp,由719个氨基酸组成,该氨基酸序列与已知的4种Cry1Ie蛋白不同,与Cry1Ie2和Cry1Ie3的氨基酸序列同源性最高,为95.4%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为Cry1Ie5(登录号为KJ710646)。将该基因插入表达载体p ET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温诱导成功表达,SDS-PAGE电泳验证其大小为81 k D,与预测的分子量相符合。生物活性测定表明,Cry1Ie5表达的包涵体蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟具有杀虫活性,LC_(50)分别为0.43μg/m L和48.39μg/m L;对棉铃虫的致死率不高,但能明显抑制其生长;对甜菜夜蛾没有杀虫活性。     

Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟生长发育和种群增长的影响

以含不同浓度的Cry1Ac毒蛋白的人工饲料(不加毒蛋白为对照)饲喂亚洲玉米螟幼虫,采用实验种群生命表的方法,测定了Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟的控害作用。结果显示,含2 000.0ng/g Cry1Ac毒蛋白的人工饲料处理该虫第5天的幼虫存活率为0;200.0、20.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理第10、15天的幼虫存活率、化蛹率、成蛾率、净增长率和种群增长指数均显著低于对照,且高浓度处理显著低于低浓度处理;200.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理的世代平均周期和种群加倍时间显著长于其它处理;而200.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理的周限增长率显著小于2.0、0.2 ng/g处理。表明微量的Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟的种群增长有显著影响,且随着浓度的增加控制作用增强。     

Cry1Ab杀虫蛋白对淡足侧沟茧蜂生长发育的影响

以黏虫［〖WTBX〗Mythimna separata〖WTBZ〗 (Walker)］为寄主,研究了亚致死浓度的Bt杀虫蛋白Cry1Ab对淡足侧沟茧蜂［〖WTBX〗Microplitis pallidipes 〖WTBZ〗(Szepligeti)］生长发育的影响。结果表明,当寄主从淡足侧沟茧蜂寄生后开始取食含Cry1Ab杀虫蛋白浓度为1、2、4 μg/g和 8 μg/g的饲料时,淡足侧沟茧蜂卵 幼虫发育历期比以对照黏虫为寄主的显著延长,茧（蛹）重和成虫体重显著下降,但对茧历期及成虫寿命没有显著影响。淡足侧沟茧蜂的卵 幼虫发育历期随着寄主取食Cry1Ab杀虫蛋白浓度的增加而显著延长,茧重和成虫体重则随Bt蛋白浓度的上升而显著下降。因此,尽管Cry1Ab杀虫蛋白对淡足侧沟茧蜂的生长发育具有一定程度的负面影响,但其仍可以在取食Bt毒蛋白的黏虫上完成整个世代发育。     

Inheritance of resistance to Bt canola in a field-derived population of Plutella xylostella

Crops expressing Bacillus thuringiensis (Bt) insecticidal Cry proteins are grown on millions of hectares. Recommendations to delay resistance are based on a high expression/refugia strategy that aims to kill resistant heterozygotes and enable some susceptible insects to survive. Leaf-dip bioassays on F1 crosses of Malaysian populations of diamondback moth (Plutella xylostella (L)) showed that CrylAc resistance was not fully recessive. The survival of ca 50% of heterozygotes on Bt canola (Brassica napus L) leaves expressing low concentrations of CrylAc agreed with a non-fully-recessive model for resistance. Extrapolations based on log dose-logit mortality regressions for heterozygotes using leaf-dip bioassays showed that a relatively high level of expression, of ca 2000 ng CrylAc mg(-1) total leaf protein, would be required to give 90% mortality to heterozygotes. If high enough levels of expression of Bt toxin to kill heterozygotes cannot be achieved and maintained under field conditions, the effectiveness of the high-dose/refugia strategy would be reduced.     

坡柳种子中坡柳皂苷A的分离鉴定及其对小菜蛾的拒食活性

采用小孔树脂、凝胶SephadexLH-20、反相色谱ODS及制备型高效液相色谱 (Pre-HPLC) 等分离技术,从坡柳Dodonaea viscosa (Linn.) Jacq. Enum. 种子乙醇提取物中分离获得1个活性化合物。通过质谱及核磁共振等波谱技术,鉴定其为新的齐墩果烷型三萜皂苷类化合物21-epoxyangeloyl-15,16,28-tirhydroxy-22-(2-methylbutanoyl)-Olean-12-en-3-(O-α-L-arabinofuranosyl-(1→3)-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronide,命名为坡柳皂苷A,英文名dodoneaviscoside A。生物活性测定结果表明,其对小菜蛾Plutella xylostella (L.) 3龄幼虫具有较好的非选择性拒食活性,24 h拒食中浓度 (AFC₅₀) 为207.4 μg/mL。值得进一步研究。     

Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾的杀虫活性研究

利用2种苏云金芽胞杆菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其组合,分别对Cry1Ac抗性种群小菜蛾幼虫进行生物活性测定。结果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8对2种目标试虫均有高毒力,LC50分别为0.2175、0.6706μg/mL;Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。2种蛋白混配的结果也表现出高毒力,LC50为0.4375μg/mL,没有显著的协同增效作用,也不存在拮抗。敏感与抗性小菜蛾种群生测结果统计分析比较,结果表明这2种蛋白及其组合与Cry1Ac并无交互抗性。     

印楝素A和印楝素B生物活性比较

对印楝素A和印楝素B的生物活性进行了研究。在3μg/mL的剂量下处理后24 h,印楝素A和印楝素B对小菜蛾3龄幼虫的拒食率分别为85.3%和80.4%;在5μg/mL的剂量下处理后24 h,对棉铃虫3龄幼虫的拒食率分别为94.9%和80.2%。处理后72 h,印楝素A和印楝素B对斜纹夜蛾3龄幼虫的LC₅₀分别为1.0μg/mL和3.3μg/mL。印楝素A和印楝素B在3μg/mL的剂量下处理后72 h,小菜蛾3龄幼虫的死亡率分别为90.42%和84.11%;在5μg/mL的剂量下处理后72 h,棉铃虫3龄幼虫的死亡率分别为99.1%和100.0%;在0.5μg/mL的剂量下处理后72 h,斜纹夜蛾4龄幼虫体重降低率分别为57.5%和72.73%;在0.8μg/mL的剂量下处理后72 h,棉铃虫3龄幼虫体重降低率分别为84.1%和80.9%。     

Cry1Ac杀虫蛋白对甜菜夜蛾飞行能力的影响

转Bt基因作物上害虫取食Bt杀虫蛋白后存活并羽化的成虫飞行能力对于其飞离Bt作物,寻找庇护所中敏感个体进行交配、产卵,从而稀释抗性基因频率,实现“高剂量/庇护所”抗性治理策略具有重要意义。本文对取食含不同浓度Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料的初羽化（未取食补充营养）甜菜夜蛾飞行能力进行了测试,结果表明,幼虫取食含25、50、100 μg/g和200 μg/g Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料存活并羽化的成虫飞行距离、飞行速度和飞行时间均差异显著（p<0.05）。取食含较低浓度Cry1Ac杀虫蛋白（25 μg/g和50 μg/g）的人工饲料有促进成虫飞行的倾向,尽管与取食不含Cry1Ac杀虫蛋白的对照相比,成虫飞行距离、飞行速度和飞行时间均未达到显著增加的水平,但强飞行个体比例明显增加。随着饲料中Cry1Ac杀虫蛋白浓度的升高,羽化的成虫飞行能力显著下降。雄蛾飞行能力下降的程度比雌蛾更加明显。这些数据为转Bt基因作物上迁飞性害虫的种群动态规律及其潜在的抗性治理策略提供了科学依据。     

低浓度Bt杀虫蛋白连续刺激对甜菜夜蛾飞翔力的影响

以人工饲料中添加低浓度的Cry1Ac杀虫蛋白(0、5、10、20μg/g)饲养甜菜夜蛾5个世代,探讨低浓度杀虫蛋白连续刺激对该虫处女蛾与产卵蛾飞行速度、飞行时间与飞行距离的影响。结果表明,甜菜夜蛾对低浓度Bt毒素的响应经过了敏感期、逐步适应期到最终适应甚至反弹几个阶段:在F1代,对照组的飞行距离显著长于最高浓度处理组。F2、F3代,低浓度处理(5~10μg/g)后的甜菜夜蛾飞行力开始增强,高浓度杀虫蛋白处理组(20μg/g)的飞行力仍低于对照,不同处理在飞行时间与飞行距离上差异显著。在F4代,处女蛾的飞行力开始回升,特别是低浓度处理(5μg/g)的飞行时间和飞行距离显著高于对照,也显著或极显著高于其他2个浓度处理,各处理在飞行时间和飞行距离上达到显著差异。到了F5代,所有处理的飞行力均大于对照,其飞行速度、飞行时间与飞行距离3个指标在各处理间均达到显著差异。研究同时发现,无论是处女蛾,还是产卵雌蛾,对低浓度Cry1Ac杀虫蛋白的响应基本一致。文章认为,阐述毒蛋白对昆虫飞行的影响需要研究多个世代。     

透骨草杀虫活性成分分离鉴定及其生物活性研究

采用柱层析分离、高效液相色谱切分和生物活性追踪法,从透骨草Phryma leptostachya L.石油醚提取物中分离出2个具有杀虫活性的化合物(B1和B2),采用质谱、核磁共振氢谱和碳谱,并结合相关文献对其结构进行鉴定,发现其分别为双氧木脂素A 和E。首次以粘虫Mythimna separata、槐尺蠖Semiothisa cinerearia、小菜蛾Plutella xylostella、小地老虎Agrotis ypsilon和家蝇Musca domestica为试虫,测定了这2个化合物的杀虫活性。结果表明:化合物 B1和B2 对3龄粘虫24 h的胃毒致死中浓度(LC50值)分别为34.9和52.8 μg/mL,24 h触杀致死中量(LD50值)分别为0.09和0.26 μg/头;对3龄槐尺蠖24 h的胃毒LC50值分别为66.1和1 675 μg/mL,触杀LD50值分别为0.049和1.33 μg/头;对家蝇成虫24 h的胃毒LC50值分别为39.2和969 μg/mL,触杀LD50值分别为0.047和1.12 μg/头。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1D新基因的克隆与特性

为扩充鳞翅目害虫杀虫基因资源，本研究从苏云金芽胞杆菌BN23-5中克隆得到一个新的cry基因，并对其进行鉴定和分析。该基因为一个完整的cry1D基因，全长3501 bp，编码1166个氨基酸残基。该氨基酸序列是一个新的Cry氨基酸序列，与Cry1Db1的同源性最高，为86%，命名为Cry1Dd1（登录号为KJ728844）。将该基因插入穿梭表达载体pSTK中，转入BT无晶体突变株HD73^-中进行表达。结果表明，cry1Dd1基因能在BT无晶体突变株中表达，并形成菱形伴孢晶体。SDS-PAGE验证其分子量为132.2 kD，与预测的大小相符。生物活性测定表明，Cry1Dd1晶体蛋白对小菜蛾的幼虫具有杀虫活性，LC₅₀为13.1 μg/mL；能明显抑制甜菜夜蛾幼虫的生长；但对棉铃虫幼虫没有杀虫活性。对cry1Dd1基因序列进行分析，cry1Dd1包含8个block保守区域，这和目前其他的cry基因相似；Cry1Dd1蛋白的活性区域为N端的37~593位氨基酸残基。     

沉默cadherin基因对小菜蛾敏感性的影响

钙粘蛋白(cadherin)是许多鳞翅目昆虫中苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素的受体。利用RNAi技术对小菜蛾中肠cadherin基因进行沉默处理,明确了cadherin基因沉默对小菜蛾对Cry1Ac毒素敏感性的影响。结果表明,注射目标dsRNA后的第1天至第5天,Cry1Ac敏感及抗性小菜蛾品系cadherin的基因表达量均显著减少,尤以第2天的减少量最为明显;Cry1Ac毒力测定结果表明,沉默cadherin基因能在一定程度上提高幼虫的成活率,即可使小菜蛾对Cry1Ac毒素的敏感性降低。研究初步表明,cadherin基因的功能与小菜蛾对Cry1Ac毒素的抗性有关。