根结线虫拮抗放线菌的筛选及菌株HA10002的鉴定与活性物质分析

为了筛选获得对根结线虫具有拮抗能力的强活性放线菌菌株,并从菌株中发现新的杀线虫活性化合物,从海南东寨港红树林采集海泥样品9份,从五指山原始森林等地采集土壤样品51份,用平板稀释法对海泥和土壤样品进行分离;以南方根结线虫2龄幼虫为靶标线虫,采用24孔细胞培养板液体线虫法进行初筛和复筛;根据形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列对复筛出的活性菌株进行鉴定;菌株发酵液经溶媒萃取、硅胶柱层析、Sephadex LH 20凝胶过滤和制备薄层板层析,采用活性跟踪法从中分离纯化杀线虫活性化合物;化合物经光谱及波谱分析和文献对照,进行结构鉴定。从60份样品中分离得到356株菌落形态有差异的放线菌。初筛得到16株对根结线虫校正死亡率在80%以上的菌株,复筛获得3株线虫校正死亡率在95%以上的菌株,其中分离自海泥样品中的菌株HA10002抗线虫活性最强,发酵原液的校正死亡率达100%。HA10002经鉴定为白浅灰链霉菌,从其发酵液中分离获得2个活性化合物,其中A26 3为Nocardamine,A22 1的结构正在进一步鉴定中。上述结果表明,筛选出的放线菌HA10002能合成2种以上杀根结线虫的活性代谢产物,是一株遗传稳定且具有开发潜力的活性菌株。     

食线虫真菌的筛选及菌株DF09002的鉴定与产酶特性分析

从海南五指山原始森林、定安雷鸣发病胡椒园采集土壤样品及死亡线虫尸体,分离得到126株菌落形态有差异的真菌。以离体培养的南方根结线虫为靶标线虫对126株真菌进行筛选,获得7株对根结线虫校正死亡率在70%以上的菌株。菌株DF09002抗线虫活性最强,校正死亡率达100%;经5次继代培养,仍具有稳定产生杀线虫活性物质的能力。通过形态学和rDNA ITS序列分析,将该菌株归类为曲霉属黑色组曲霉黑曲霉集合体。酶系分析试验表明,菌株能产生在线虫侵染过程中起重要作用的几丁质酶和胞外蛋白酶,酶活力分别达到0.67、41.63 U/mL。     

生防细菌YC-10的杀线虫活性及其鉴定

 从烟草中分离出1株对根结线虫和胞囊线虫有较高生物活性的内生细菌菌株-YC-10。将该细菌发酵滤液原液及5、10、20和40倍稀释液处理南方根结线虫,96 h后线虫死亡率均达到100%,处理大豆胞囊线虫96 h,致死率大于90%,在植物线虫生物防治上显示出巨大的应用前景。通过形态特点、理化特征以及16SrDNA序列同源性分析将菌株YC-10鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。对发酵液活性成分理化性质研究表明,活性成分对热稳定,高温、蛋白酶K处理不影响其杀虫活性,而酸性条件下杀线虫活性比碱性中更强。为后续杀线虫活性成分的分离及杀线虫机理研究奠定基础。      

日本曲霉ZW1发酵滤液的杀线虫活性和发酵条件优化

根结线虫是一类严重为害作物的寄生线虫，分布于世界各地，且寄主范围广。前期试验表明，日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1发酵滤液对南方根结线虫Meloidogyne incognita 2龄幼虫（J2）具有毒杀作用，发酵过程中产生表面光滑球形菌丝体和表面辐射状球形菌丝体，且两种菌丝体发酵滤液的杀线虫效果具有显著差异。表面光滑球形菌丝体的发酵滤液处理南方根结线虫J2的校正死亡率在24 h达100%，显著高于表面辐射状球形菌丝体发酵滤液处理的死亡率（12.7%）。本研究通过对菌株ZW1发酵的温度、转速、培养基、光照和黑暗等条件优化表明，菌株ZW1的最优培养温度25℃和转速150 r/min，以Czapek培养基为基础培养基的最优碳源为蔗糖30 g/L和氮源KNO₃3 g/L，光照和黑暗条件下培养不影响菌株ZW1杀线虫活性；评价煮沸和4℃保存发酵滤液的杀虫效果结果表明，发酵液杀线虫活性随着贮藏时间发生变化，发酵液煮沸对菌株ZW1发酵液的杀线虫活性无影响，4℃保存1年的发酵滤液处理J2的校正死亡率仍保持87.8%。菌株ZW1代谢产物对南方根结线虫J2具有良好的毒杀作用，值得进一步研究和开发利用。     

白僵菌及其伴生菌发酵液对线虫的毒力研究

采用发酵液浸没法,以4种线虫作为靶标,对6株白僵菌、7株伴生菌菌株进行了杀线虫活性筛选,以期获得新的、高效的杀线虫生防菌资源。其中:处理24 h对南方根结线虫Meloidogyne incognita 2龄幼虫及大豆胞囊线虫Heterodera glycines 2龄幼虫校正死亡率均达80%以上的菌株仅有白僵菌Snef2598及伴生菌Snef5;供试菌株对水稻干尖线虫Aphelenchoides besseyi的毒力均较低,其中仅有1株白僵菌校正死亡率达到40%以上。处理48 h对南方根结线虫2龄幼虫校正死亡率达90%以上的菌株有白僵菌4株和伴生菌5株;对大豆胞囊线虫2龄幼虫校正死亡率超过90%的菌株有白僵菌3株和伴生菌1株;供试菌株对水稻干尖线虫毒力均较低,校正死亡率达60%以上的菌株有白僵菌3株和伴生菌2株;几乎所有供试菌株,对小杆线虫Caenorhabditis sp.的毒力均很高,处理24 h及48 h的校正死亡率均达97%以上,且被杀死的小杆线虫体壁以及虫体内部物质均被不同程度地消解。研究表明,球孢白僵菌菌株Snef2598及其伴生菌菌株Snef5对4种靶标线虫的毒力均较好,具有进一步研究的价值。     

杀线虫解淀粉芽胞杆菌Sneb709与费氏中华根瘤菌Sneb183共培养发酵条件优化

根结线虫可引起作物发生严重的土传病害,生物防治是持续控制此类病害的有效措施。本实验室前期筛选获得多株杀线虫活性的芽胞杆菌和根瘤菌,本研究将解淀粉芽胞杆菌Sneb709与费氏中华根瘤菌Sneb183进行共培养后发现,共培养发酵液对南方根结线虫2龄幼虫J2活性显著提高,因此本文利用响应面法对其发酵条件进行优化,获得更好的生防效果。以J2的校正死亡率为指标,采用单因素法、最陡爬坡法和响应面法设计并优化共培养菌株的发酵液培养基成分以及培养条件,确定共培养发酵液的最适培养基成分为：山梨糖1.98 g/L、黄豆粉1.06 g/L、花生饼粉2.08 g/L;最佳发酵条件为：温度30.4℃、初始pH 6.49、装液量103.15 mL。使用优化条件对两个菌株进行共培养后,其发酵液对J2的毒杀活性显著提高,提升至84.17%,使用发酵罐验证,共培养发酵液的毒杀活性提升了24.72%。该结果为共培养菌株有效的活性产物分离提取等后续研究及杀线虫生防菌的产业化提供了理论依据。     

生防链霉菌JH108-2的发酵培养基优化

 为了提高链霉菌菌株JH108-2的发酵滤液对植物寄生线虫的毒力,采用正交试验设计,优化其发酵培养基。使用优化培养基[大豆粉20g、(NH₄)₂SO₄ 6g、蛋白胨3g、葡萄糖40g、酵母粉6g,NaCl 2g、K₂HPO₄ 0.6g.CaCO₃ 2g、蒸馏水1000mL、pH 6.0]所得的发酵滤液,稀释10倍,处理南方根结线虫(Meloidogyne incognita)二龄幼虫,24h后校正死亡率达95.4%,比对照培养基的发酵滤液所产生的校正死亡率高6.9%,差异达到极显著水平(P=0.01)。     

杀线虫植物内生细菌和根际放线菌对根结线虫的防效

为了获得防治植物寄生线虫的微生物菌种资源和防效稳定的生防菌剂,以松材线虫为靶标,采用直接触杀法对植物根际放线菌和内生细菌进行了筛选,通过盆栽试验测定了筛选到的菌株发酵液对根结线虫的防治效果,并将有初步防效的菌株制成固体菌剂,分别测定单菌剂和复合菌剂的防效。共筛选到16株放线菌和4株内生细菌具有杀线虫活性,其中2株放线菌和3株内生细菌的发酵液对根结线虫防效明显;放线菌和内生细菌混合发酵液均保持了对根结线虫的抑制作用,但是放线菌和细菌菌株的固体菌剂混合后对根结线虫的防效低于细菌单菌株的防效。植物内生细菌BCM2和CCM7单菌株的固体菌剂对番茄根结线虫的防效最高,分别达到了83.31%和83.07%。表明高杀线虫活性的植物内生细菌制备的固体菌剂具有应用潜力。     

粉红螺旋聚孢霉NF-06固体发酵条件优化及对南方根结线虫的防治效果

南方根结线虫是一种严重危害我国蔬菜安全生产的土传病害，生产上亟需一种有效的防控方法。本研究从根结线虫卵囊中分离到一株生防真菌NF-06，通过形态学和分子生物学方法将其鉴定为粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea。通过离体活性测定的方法测定NF-06发酵滤液对根结线虫2龄幼虫的致死作用，发现24、48和72 h后2龄幼虫的相对死亡率分别达63.6%，75.5%和87.0%。以产孢量为指标，优化菌株NF-06固体发酵条件，确定最佳基础培养基为麦麸和麦秸秆混合物，其比例为4：1（wt/wt），在基础培养基中添加10%玉米粉、2%蚕豆粉和0.05% KH₂PO₄可获得最大产孢量；最优培养条件为初始pH值7.0，初始含水量40%，接种量5%，产孢量达8.9×10¹⁰ CFU/g。室内盆栽防治效果测定显示，菌株NF-06固体发酵物能够有效降低土壤中的线虫数量和番茄根结指数，其中5 g/株穴施处理的线虫减退率和防治效果分别达67.9%和69.6%。本研究为生物杀线虫剂的开发和利用提供理论依据。     

石榴枯萎病菌拮抗放线菌对南方根结线虫的毒力

从云南蒙自万亩石榴园、建水石榴园采集的土样中分离筛选得到对石榴枯萎病菌有较强拮抗活性的放线菌,其中菌株JS1对石榴枯萎病菌的室内抑菌半径为11mm。测定了菌株JS1发酵液对南方根结线虫的抑杀活性,结果表明,50%JS1菌株发酵液处理南方根结线虫卵6d,卵孵化率与对照相比降低了51.67%;50%JS1菌株发酵液处理南方根结线虫2龄幼虫72h,2龄幼虫的校正死亡率增加了88.10%;菌株JS1兼有拮抗石榴枯萎病菌及抑杀南方根结线虫的活性。结合菌株JS1在鉴定培养基上的培养特征、形态学观察及16SrDNA序列分析,将JS1初步鉴定为壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)。     

拮抗茄子黄萎病菌土壤放线菌的分离筛选和鉴定

为了研究土壤拮抗性放线菌对茄子黄萎病的生防价值,从陕西省延安市宝塔区与汉中地区土壤中分离、纯化获得154株具有纤维素降解活性的放线菌。采用平板对峙培养法进行初筛,用生长速率法对抑菌效果较好的菌株ZX-10-4进行抑菌谱的测定,并进行盆栽试验验证其对茄子黄萎病的防治效果,通过形态、培养特征及16S rDNA序列分析研究其分类地位。结果显示,有17株放线菌对茄子黄萎病菌抑菌效果较好且抑菌活性稳定,其中菌株ZX-10-4的抑菌活性最高,抑菌率达90.15%;活性菌株ZX-10-4发酵原液对茄子黄萎病的保护和治疗作用分别为70.00%和60.33%,稀释5倍液的防效也在50%以上。根据形态、培养特征、生理生化指标和16S rDNA序列分析,初步确定菌株ZX-10-4为白网链霉菌Streptomyces albireticuli的近似种。     

黄瓜内生放线菌的分离、筛选及其活性菌株鉴定

 从植物内生放线菌中筛选拮抗活性菌株和寻找新的农用活性代谢产物,可为植物病害防治提供新的资源。本研究结果发现黄瓜幼苗的根、茎、叶中均有内生放线菌的存在,根组织中的数量、种类明显多于叶片和茎,占总分离株的72.7%,以链霉菌的淡紫灰类群、灰褐类群为主。活性筛选试验结果表明,黄瓜内生放线菌中对12种靶标真菌和6种细菌具有拮抗作用的菌株分别占46.8%和39.0%,主要为分离自根组织的链霉菌淡紫灰类群。分离自黄瓜叶片的gCLA4菌株抑菌谱较广,其发酵滤液对供试12种靶标真菌均具有较好的抑菌效果,但对靶标细菌有选择性抑制作用。形态学、细胞化学和16S rDNA序列分析鉴定该菌株为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendularectus)。     

建兰炭疽病拮抗放线菌的筛选及防治效果

为筛选获得对建兰炭疽病菌胶孢炭疽菌具有良好抑菌效果的放线菌，以野生山地兰花表层土壤为分离样本，从土壤样品中分离获得25株放线菌，初筛出6株对建兰炭疽病菌胶孢炭疽菌具有明显抑制作用的菌株，其中菌株SVFJ-07的抑菌效果最好，抑菌率达83.64%。经形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析，确认菌株SVFJ-07为酒红链霉菌。该菌对多种真菌具有良好的抑菌效果。对建兰炭疽病的室内防效为70.06%，田间防效66.27%～68.54%。可见，酒红链霉菌SVFJ-07对建兰炭疽病菌胶孢炭疽菌具有较好的拮抗作用，生防应用前景良好。     

一株辣椒尖孢炭疽病菌拮抗菌株的分离鉴定与发酵条件优化

 为了探寻辣椒尖孢炭疽病的生防药剂,从而控制该病在辣椒生产上的扩散。以辣椒尖孢炭疽病菌（Colletotrichum acutata）为指示菌,从浏阳河风光带土样中分离筛选出6株拮抗放线菌株,其中菌株ND045对指示菌的拮抗效果最好,菌丝生长抑制率高达71.6%。经形态观察、培养性状、生理生化鉴定,并结合16S rDNA序列分析,将ND045菌株鉴定为吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）。抗菌谱研究表明,该菌株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、黄瓜枯萎病菌（Fusarium omysporum）和辣椒白绢病菌（Sclerotium rolfsii）都具有较强的拮抗作用,抑菌率达40.58%～72.00%。通过单因子变量法和均匀设计法对菌株ND045进行发酵条件研究,结果表明,其最佳的发酵条件为：15 g大米粉、5 g大豆粉、0.5 g MgSO₄、0.01 g FeSO₄·7H₂O、1.5 g NaCl、水1 000 mL、30℃、pH 8。经优化后,菌丝生长抑制率最高达到82.61%,比优化前提高了11.01%。该研究结果为辣椒尖孢炭疽病的生物防治提供科学依据。     

对紫茎泽兰具有除草活性的特基拉芽胞杆菌ZLSY5的鉴定及发酵条件筛选

为明确菌株的进化关系及发酵条件,本试验对一株来自泽兰实蝇幼虫消化道的ZLSY5菌株进行了鉴定,优化了基础发酵培养基和发酵条件。用形态学及建立系统进化树的方法鉴定了菌株;用分光光度法测定菌液在600 nm处的OD值, 根据OD值的大小判断发酵条件的优劣;用圆叶片法测定了优化前后菌株对紫茎泽兰叶片的侵害作用的比较。结果表明,菌株ZLSY5为特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis 10 b;分别在不同培养基上接种培养72 h后,以牛肉膏酵母葡萄糖培养基中细菌量最多,细菌生长速度最快;在5种不同碳源中,麦芽糖最利于菌株ZLSY5生长;在6种不同氮源中,酵母膏效果最好,其次为蛋白胨。最适发酵条件为温度28 ℃,pH 6,接菌量2.0 %,装液量40 mL/250 mL,转速240 r/min,发酵时间36 h,光照20 h/d。菌株ZLSY5最适培养基：蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,麦芽糖10 g/L,蒸馏水1 L。优化后培养基对叶片的影响较小,因此优化后所培养的菌株ZLSY5对紫茎泽兰叶片的侵害作用更好,原浓度时侵害指数接近90%。     

纳木错盐湖中度嗜盐放线菌区系研究

为探明纳木错盐湖中度嗜盐放线菌的数量、种类组成、拮抗活性和酶活性。采用盐浓度为5%和10%的4种分离培养基,利用稀释平板倾注法对盐湖土壤和水样放线菌进行分离,通过形态特征、培养特征和细胞壁化学组成对放线菌进行初步鉴定,并对分离到的放线菌进行抑菌和酶活性试验。结果表明：从纳木错盐湖土壤和水样中分离到36株中等嗜盐放线菌,其中土样中26株,水样中10株。分别属于链霉菌属（Streptomyces）、诺卡氏菌属（Nocardia）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）和红球菌属（Rhodococcus）。放线菌形态学排重后合并为13株,抑菌活性实验结果表明,分别有4株放线菌对小麦赤霉菌、小麦根腐病菌和烟草赤星病菌有抑菌活性,抑菌率占30.8%。其中对小麦根腐病菌的抑制活性最强,最大抑菌圈直径达22 mm。酶活性测定发现,纳木错盐湖中度嗜盐放线菌的酶活性菌株数少且弱。