进境苹果果实中梨火疫病菌的套式PCR检测

 针对进境商用苹果果实携带梨火疫病菌Erwinia amylovora数量有限的特点,选取源于病菌pEA29质粒的2对引物P29A/P29B和PEANT1/PEANT2配对组合成套式PCR,其检测灵敏度可达0.15 pg菌体DNA,检测灵敏度高于EPPO推荐的单管套式PCR方法和常规PCR方法。分别利用这3种PCR检测方法对美国、新西兰、日本和智利等国进境的166批苹果样品进行检测,3种检测方法的样品阳性率分别为53.6%、38.0%和8.4%,试验结果表明此套式PCR检测方法可用于进境商用苹果的梨火疫病菌快速检测。进境样品的检测结果证实了进境商用苹果果实中存在梨火疫病菌的可能性。     

免疫吸附PCR技术提高梨火疫病菌检测灵敏度

本研究采用已经发表的引物和制备的梨火疫病菌抗血清,研制了免疫吸附-PCR技术,使其检测梨火疫病菌纯菌的灵敏度比标准PCR技术提高10倍;检测模拟样品中的梨火疫病菌灵敏度提高了1000倍;从相关混合菌液中能够更加灵敏和准确地检测出梨火疫病菌.该方法简单易行,准确灵敏,具有广阔的应用前景.     

美国进境樱桃果实中梨火疫病菌的检测

为了筛选快速、灵敏的梨火疫病菌检测方法,利用常规PCR、套式PCR和实时荧光PCR方法分别对美国进境的326批樱桃果实中梨火疫病菌进行检测。结果显示,3种PCR方法的检出率不同,不同引物或探针的检出率也存在差异。在常规PCR中,引物Ams3/Ams4c、P29A/P29B和PEANT1/PEANT2的检出率分别为35.28%、24.85%和16.87%;单管套式PCR和套式PCR的检出率分别为23.01%和50.61%;4种实时荧光PCR的检出率分别为17.48%(探针PA)、32.21%(探针Ams)、29.14%(探针ITS)和23.93%(SYBR GreenⅠ)。在所有试验方法中由引物P29A/P29B和PEANT1/PEANT2组成的套式PCR的检出率最高。检测结果证实了进境樱桃果实中存在梨火疫病菌DNA,套式PCR和常规PCR(引物Ams3/4c)可用于进境樱桃样品中梨火疫病菌的常规检测。     

梨火疫病菌的实时荧光PCR检测

 根据梨火疫病菌16S~23S间的ITS保守序列,设计并合成了一对特异性引物REA/FEA,应用荧光染料SYBR Green I,对10个梨火疫的菌株和其它相关参试菌株进行了检测。结果表明,10个梨火疫菌株都产生荧光信号而其它参试菌株都不产生荧光信号,成功建立了梨火疫病菌的实时荧光PCR检测方法。整个检测过程只需3h,完全闭管,降低了污染的机会,无需PCR后处理。检测的灵敏度是4个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高了10倍。用该特异性引物对梨枝条浸泡液进行实时荧光PCR检测,结果可特异性检测到目标菌的存在,并且检测的灵敏度是24个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高10倍。     

梨园气溶胶中梨火疫病菌的定量检测

为系统研究梨园气溶胶中梨火疫病菌的含量, 本研究于2019年－2021年在新疆库尔勒市人和农场梨园, 利用病原菌孢子捕捉器在每年春季(4月下旬)、夏季(6月中旬)、秋季(9月中旬)收集梨园气溶胶, 检测梨火疫病菌。结果显示, 健康梨园气溶胶中未检测到梨火疫病菌, 不同发病程度的梨园气溶胶中均能检测到梨火疫病菌, 携菌量均值在102 cfu/(24cm2·h)以上, 其中, 气溶胶中梨火疫病菌含量最高值为2.81×104 cfu/(24cm2·h), 最低值为8.50×102 cfu/(24cm2·h); 重度、中度、轻度发病果园收集的气溶胶中含梨火疫病菌总菌落数均值分别为8.74×103、4.55×103、2.36×103 cfu/(24cm2·h)。此外, 在同一高度收集的气溶胶中, 梨火疫病菌菌落数随收集时间的延长而增加。不同季节气溶胶携菌量检测结果表明, 秋季发病梨园中气溶胶携菌量明显高于夏季和春季, 与梨园梨火疫病发病规律相符。致病性测定结果表明, 气溶胶中分离的梨火疫病菌具有致病性。     

不同引物PCR检测向日葵黑茎病菌的灵敏度比较及应用

为准确快速筛查进境油葵种子中携带的向日葵黑茎病菌Plenodomus lindquistii,采用常规PCR方法比较了3对向日葵黑茎病菌PCR检测引物320FOR/320RVE、LEPB/LEPF和LLF/LLR的灵敏度,对哈萨克斯坦进境120批油葵种子样品进行PCR检测,并对检测为阳性的样品进行产物序列测定及病原菌分离。结果显示,引物320FOR/320RVE的检测灵敏度最高,可达10-5ng/μL,引物LEPB/LEPF和LLF/LLR分别为10-4ng/μL和10-3ng/μL。利用引物320FOR/320RVE、LEPB/LEPF和LLF/LLR对120批进境油葵种子样品进行检测,阳性检出率分别为65%、50%和45%,阳性检出率高低与引物的检测灵敏度相一致。阳性样品扩增的产物序列与Gen Bank中向日葵黑茎病菌的序列同源性最高;分离的病原菌菌落为乳白色至灰白色,分生孢子器黑褐色、球形并产生透明状分生孢子液,分生孢子单胞、无色、肾型、两端有油球,与已报道的向日葵黑茎病菌的病原特征描述一致,初步鉴定哈萨克斯坦进境油葵种子中存在向日葵黑茎病菌。     

应用聚合酶链反应技术检测梨火疫菌的研究

应用梨火疫菌ＰＣＲ技术可以准确，快速地检测出梨火疫菌潜伏侵染的样品，检出样品中梨火疫菌的最低带菌量为５０个细菌，未发现它与其它植病细菌有交叉反应，从ＰＣＲ扩增、电泳分离到获得最后结果仅需８小时。此法适宜对进口苗木、接穗和水果上的梨火疫菌快速检疫和对引种苗圃和果园里梨火疫病发生进行监测。     

亚洲梨火疫病致病相关因子的研究进展

本文概述了亚洲梨火疫病(Erwinia pyrifoliae)的生物学特性、危害症状、寄主范围、分布情况,重点介绍了该病菌的微生物学、生理生化、分子生物学特点,以及一些致病相关因子的研究进展.同时,分析比较了亚洲梨火疫病菌和梨火疫病菌以及日本梨枝枯病菌的关系,指出了亚洲梨火疫病菌传入我国的风险以及在检疫上的重要性.     

进境苹果中3种检疫性真菌三重PCR同步检测方法的建立

苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii)、美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)和丁香疫霉病菌(Phytophthora syringae)是为害多种水果和其他植物的重要检疫性真菌,均能侵染苹果果实导致烂果,并造成严重的经济损失。本研究设计和筛选了3对特异性引物,建立了同步检测3种检疫性真菌的普通PCR和三重PCR方法。设计的引物Bs-368 F/R、M.cola 986F/R和Psy1/Psy2能分别特异性地扩增出B.stevensii、M.fructicola和P.syringae所有供试菌株的DNA,而对相应多个近似种的DNA则无扩增。灵敏度试验结果表明,上述3对引物分别检测B.stevensii、M.fructicola和P.syringae DNA的灵敏度是41.7 pg、47.4 pg和0.375 pg,三重PCR同时检测到3种病菌DNA的灵敏度是4.44 ng。该方法可以满足对进境苹果果实携带的苹果壳色单隔孢溃疡病菌、美澳型核果褐腐病菌和丁香疫霉病菌的快速初筛,加速进境新鲜水果的快检快放。     

进境玉米中玉米内州萎蔫病菌的PCR检测

 为了快速准确检测进境玉米样品中的玉米内州萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis(Cmn), 根据GenBank中Cmn的16S-23S序列设计引物CM1/CM4和引物PSM1/CM3。引物PSM1/CM3仅能从供试的4株Cmn菌株中扩增获得208 bp的预期产物, 而其他36株对照菌株均不能扩增出预期条带。灵敏度测试结果表明引物CM1/CM4和PSM1/CM3组合的巢式PCR方法的检测灵敏度高于常规PCR, 检测灵敏度可达40 fg DNA或6.8 CFU目标细菌。常规PCR和巢式PCR方法对进境美国玉米样品的阳性检出率分别为8%和24%, 试验结果表明所建立的PCR方法可用于玉米样品中Cmn的快速检测。