基于环介导等温扩增技术快速检测美澳型核果褐腐病菌

本文建立了美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)环介导等温扩增技术,并利用此技术开展了M.fructicola的检测和鉴定。采用M.fructicola SCAR分子标记的MO368特异片段为靶标序列,设计并筛选出M.fructicola的特异性LAMP引物,建立了该病菌快速诊断方法。试验结果表明,仅M.fructicola的菌株DNA扩增后呈天蓝色的阳性反应,而在其他真菌的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。检测灵敏度可达到100 pg/μL。利用该方法对无锡机场截获的7份疑似李子褐腐病样本进行检测,结果有3份样品呈LAMP阳性反应。本文建立的M.fructicola LAMP检测方法具有灵敏度高、特异性好,简便易行等优点,为美澳型核果褐腐病菌的快速检测提供了一种新技术。     

2010年广东口岸从进境美国水果中截获多种检疫性真菌有害生物

2010年,广东出入境检验检疫局技术中心从广州白云机场、高明、佛山澜石等口岸进境截获的美国水果可疑样品中检出美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola(Winter)Honey 1928)、苹果牛眼果腐病菌     

丁香疫霉病菌PCR和实时荧光PCR检测

 为了快速、准确地检测丁香疫霉病菌 (Phytophthora syringae, PSY),根据GeneBank中PSY的ITS序列设计特异引物Psy1/Psy2和探针P-Psy,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物Psy1/Psy2扩增供试的26株PSY能得到585 bp的预期目标条带,但扩增其它61个非PSY供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为12 pg菌丝DNA;探针P-Psy对供试26株PSY表现为阳性扩增,而对其它菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达120 fg菌丝DNA,比常规PCR高100倍;引物Psy1/Psy2和探针P-Psy对5 g土壤中PSY卵孢子的检测灵敏度分别为20 000个和200个。样品检测试验表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确和特异地检测丁香疫霉病菌。     

美澳型核果褐腐病菌的检疫鉴定方法

本文根据美澳型核果褐腐病菌的形态学、生物学培养性状和分子生物学等方面的特征,确立了检疫鉴定美澳型核果褐腐病菌的各项技术要求.     

从进境美国樱桃中首次截获美澳型核果褐腐病菌

Monilinia fructicola是我国禁止进境的检疫性真菌有害生物。广州白云机场口岸从美国输华樱桃中截获可疑病果,病果表面有微小的圆形褐色病斑。保湿培养4d后,病斑迅速扩展至全果,并簇生绒状灰白至灰黄色菌落,导致果实腐烂。经对分离物进行形态学观察和ITS序列分析,将病菌鉴定为美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola(Winter)Honey),从进境美国樱桃大宗货物中截获该病菌在我国尚属首次。     

褐腐病菌三种分子鉴定方法的比较

为了筛选出适用于口岸检疫的、可快速鉴定三种褐腐菌,即美澳型核果褐腐菌(Monilinia fructicola)、核果褐腐菌(M. laxa)和仁果褐腐菌(M. fructigena)的方法,采用Lane等基于形态学特征的方法对采自北京、山东、河北等省市的58株褐腐菌进行了种类鉴定,并以这些菌及三个种的标准菌株为材料比较了已报道的三种分子检测方法的可靠性。研究发现,58株菌中有53株是美澳型核果褐腐菌,2株为核果褐腐菌,3株为仁果褐腐菌。采用Ioos等的PCR方法,从3个标准菌株、53株美澳型核果褐腐菌和2株核果褐腐菌中都只扩增出相应种的特征条带,而从3株仁果褐腐菌中的2株中扩增出了两个种的特征条带。采用Ma等的方法,从美澳型核果褐腐菌标准菌株、采自国内的53株美澳型核果褐腐菌和核果标准菌株中,只扩增到相应种的特征条带,而从采自国内的2株核果褐腐菌株中不仅扩增出了核果褐腐菌的条带还扩增出了美澳型核果褐腐菌的特征条带,3株仁果褐腐菌株产生了核果褐腐菌的特征条带,仁果褐腐菌标准菌株中没有得到产物。采用Cote等的方法,只从16株美澳型核果褐腐菌中扩增出该种的特征条带,从其余菌株(包括标准菌株)中没有获得产物。这些研究结果表明:Ioos等的检测方法可用于检测美澳型核果褐腐菌和核果褐腐菌;Ma等的检测方法可用于检测美澳型核果褐腐菌,而不适用于检测其它两个种;而仁果褐腐菌的分子检测方法需要进一步研究和完善。     

桃褐腐病菌对多菌灵抗性的AS-PCR检测技术

由于杀菌剂的长期大量使用, 植物病原菌对杀菌剂抗性问题日趋突出, 严重影响病害防治的效果?褐腐病是一种在全世界范围内广泛发生和流行的重要果树病害?本文以桃褐腐病菌Monilinia fructicola为例, 基于已知的多菌灵抗性机理, 即靶标β微管蛋白基因TUB2的点突变E198A, 建立了一种桃褐腐病菌对多菌灵抗性的等位基因专化性PCR检测技术?结果表明, 碱基错配?内参引物?退火温度?dNTPs?Taq DNA聚合酶?专化性引物浓度及配比等因素均对检测效率有影响?经过对以上因素的优化, 并对优化后的检测技术进行专化性及灵敏度评价, 证实该检测技术能特异性地鉴别桃褐腐病菌M. fructicola对多菌灵抗性基因型E198A, 且检测灵敏度可达到4.342 pg/μL病菌DNA, 有望在实践中推广使用?     

李属植物检疫性丁香疫霉和栗黑水疫霉的三重PCR分子检测

为建立我国禁止进境的2种检疫性真菌丁香疫霉Phytophthora syringae和栗黑水疫霉P.cambivora的同步分子检测方法,根据疫霉属的18S rRNA、HSP90和Ypt1基因分别设计通用引物、丁香疫霉和栗黑水疫霉的特异性引物,建立三重PCR检测方法,并进行灵敏度测试和模拟带菌试验。结果表明,可同时检测李属植物上丁香疫霉和栗黑水疫霉的特异三重PCR检测体系为:最佳引物浓度组合18SUF/18SUR、PCSF/PCSR和PSSF/PSSR依次为0.2、0.8、1.0μL,最佳退火温度为63℃,最佳退火时间为20 s。该体系扩增丁香疫霉出现884 bp的18S rRNA条带和683 bp的HSP90基因特异条带,扩增栗黑水疫霉出现884 bp的18S rRNA条带和314 bp的Ypt1基因特异条带,对照菌只出现18S rRNA条带;三重PCR反应体系检测灵敏度低于单重PCR;模拟带菌试验可同时扩增出3个片段。表明该三重PCR检测方法能实现丁香疫霉和栗黑水疫霉的同步特异性检测,可有效改进李属类水果及其种苗上检疫性疫霉的快速检测。     

苹果壳色单隔孢溃疡病菌在原木上的侵染及热处理技术研究

 本研究从欧洲进境水曲柳原木上分离获得了检疫性病原真菌苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii Shoemaker),分别测定了烘箱热处理和炭化烘房热处理对该病菌存活的影响。结果发现苹果壳色单隔孢溃疡病菌可以侵染至原木的木质部组织,原木中心处理温度达到60℃并持续6 h可杀灭原木中携带的病菌。研究结果对进境原木携带苹果壳色单隔孢溃疡病菌及其它重要病菌的检疫处理有较好的参考价值。     

塞尔维亚在储藏苹果上首次报道Monilinia fructicola导致的褐腐病

美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola(G.Winter)Honey)是核果类褐腐病的重要病原,偶尔也危害仁果。该菌一般发生在北美洲、南美洲、大洋洲和亚洲,在欧洲被列为检疫性有害生物,也是我国的检疫性有害生物。欧洲2001年在法国首次发现该菌,继而在德国、匈牙利、意大利、波兰、罗马尼亚、斯洛文尼     

进境苹果果实中梨火疫病菌的套式PCR检测

 针对进境商用苹果果实携带梨火疫病菌Erwinia amylovora数量有限的特点,选取源于病菌pEA29质粒的2对引物P29A/P29B和PEANT1/PEANT2配对组合成套式PCR,其检测灵敏度可达0.15 pg菌体DNA,检测灵敏度高于EPPO推荐的单管套式PCR方法和常规PCR方法。分别利用这3种PCR检测方法对美国、新西兰、日本和智利等国进境的166批苹果样品进行检测,3种检测方法的样品阳性率分别为53.6%、38.0%和8.4%,试验结果表明此套式PCR检测方法可用于进境商用苹果的梨火疫病菌快速检测。进境样品的检测结果证实了进境商用苹果果实中存在梨火疫病菌的可能性。     

广州口岸进口水果截获病害概述

近年来,全国进口水果无论种类还是数量都急剧增加,但很少有截获重要病害的报道.作者对实验室受理的进口水果进行了病害检疫鉴定,共鉴定出病原33种,其中包括美澳型核果褐腐病菌、可可毛色二孢等重要疫情.     

免疫捕获PCR检测进境苹果果实中梨火疫病菌

利用梨火疫病菌抗体和PCR技术建立了梨火疫病菌免疫捕获PCR方法,检测苹果模拟样品的灵敏度达到了1.5×102cfu/reaction。与直接PCR进行比较,免疫捕获PCR方法检测苹果模拟样品的灵敏度提高了10倍以上,而且省去了DNA提取等步骤。利用该方法成功从进境苹果样品中检测到梨火疫病菌,产物测序结果表明,产物序列和梨火疫病菌的相应序列高度一致。试验结果表明,免疫捕获PCR法能除去样品中的大部分PCR反应抑制物质,可以有效检测进境苹果中梨火疫病菌,在口岸水果检疫中具有一定的应用潜力和推广价值。     

基于LAMP方法的苜蓿疫霉根腐病菌分子检测研究

苜蓿疫霉根腐病菌是我国检疫性有害生物之一.但是,目前国内尚无检测标准.笔者针对该病菌特异分子标记,设计了LAMP引物,建立了苜蓿疫霉根腐病菌恒温快速检测方法(巳申请发明专利).该方法快速、准确、无需PCR仪,很好地满足了口岸检疫部门的检测要求.     

柑橘属植物疫霉病菌检测与鉴定的研究进展

在全世界危害柑橘属植物的疫霉有十几种,其中冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)和丁香疫霉(P.syringae)为我国规定禁止进境的两种检疫性真菌病害。本文从传统的症状观察、病原菌形态特征和分子检测等方面综述了柑橘属疫霉菌检测与鉴定的研究进展,可为柑橘属植物疫霉菌的口岸检疫提供借鉴。     

应用实时荧光PCR检测苹果果实球壳孢腐烂病菌

根据苹果果实球壳孢腐烂病菌(Sphaeropsis pyriputrescens Xiao&J.D.Rogers)ITS区序列设计特异性引物和TaqMan荧光探针,建立了苹果果实球壳孢腐烂病菌的实时荧光PCR检测方法。该方法能够特异性检测苹果果实球壳孢腐烂病菌,供试的目标菌株检测结果为阳性,而苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、苹果干腐病菌和苹果褐腐病菌、苹果腐烂病菌等5种对照菌株检测结果为阴性。该方法具有快速、简便、准确的优点,适合于该病害的快速诊断和口岸检验检疫运用。     

非洲菊疫霉根腐病的快速分子诊断

 隐地疫霉引起的根腐病是非洲菊生产上的主要病害,为发展该病的快速诊断技术,本文比较了卵菌核糖体基因ITS的序列,在此基础上设计了2条针对隐地疫霉的特异性PCR引物PC1和PC2。供试的23种不同真菌和疫霉菌的46个菌株中,利用这对引物能从隐地疫霉基因组DNA中扩增出一条分子量为620bp的特异性条带,该引物的检测灵敏度可达10pg。采用快速组织碱裂解法提取发病植物组织的DNA,结合PCR检测技术,4h内可从发病的非洲菊根部组织中特异性地检测到隐地疫霉菌。结果表明,建立的非洲菊疫霉根腐病菌分子检测方法可用于该病害的快速分子诊断。     

栎枯萎病菌与栎树疫霉猝死病菌的多重PCR检测方法

根据实验室设计的栎枯萎病菌的特异性引物CF01/CF02和2004年Hayden等设计的栎树疫霉猝死病菌特异性引物Phyto1/Phyto4,组合并优化出了可以同时检测2种病原菌的多重PCR检测体系,经PCR扩增可以分别得到687bp和280bp两条特异性条带,利用菌丝DNA检测,灵敏度为10pg基因组DNA。     

苹果壳色单隔孢溃疡病菌的适生区预测

苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii)是一种寄主十分广泛的进境植物检疫性真菌,在我国尚无分布。近年来,我国口岸多次截获该病菌。为更好地实现对该病菌的针对性检疫防控,本研究采用DIVA-GIS软件对该病菌在我国的潜在适生区进行了预测,并对其适生区内寄主情况进行了深入分析。研究结果表明,苹果壳色单隔孢溃疡病菌在我国的适生区域较为广泛,主要分布在我国华东、华北和华中地区;该病菌在其适生区域内存在大量寄主,尤其是水果类作物,林木寄主也有较多分布。因此,该病菌一旦传入我国,极可能造成十分严重的经济损失,值得高度警惕。本文最后提出了针对苹果壳色单隔孢溃疡病菌的风险防控建议。     

EF-1α基因作为苹果牛眼果腐病菌DNA条形码的评价研究

苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea malacorticis、N. perennans、N. kienholzii和N. vagabunda)是我国重点关注的进境水果检疫性有害生物,相似的形态和生理特征使该类真菌的鉴定非常困难。本研究在EF-1α基因区域设计了一对通用引物(NS1/NS4),对不同地理来源的苹果牛眼果腐病菌及其近缘种菌株进行序列分析,考察EF-1α基因是否具备成为苹果牛眼果腐病菌条形码的特征与条件。结果显示, EF-1α基因在苹果牛眼果腐病菌上的PCR扩增和测序成功率均为100%,具有明显的种间和种内遗传变异间距(Barcoding Gap),系统树分析显示该基因片段对4种苹果牛眼果腐病菌及其近缘种具有很好的区分能力,因此认为EF-1α基因可作为苹果牛眼果腐病菌理想的DNA条形码候选片段。