红鳍东方鲀AFP、CIRP、HMGB1和YB-1基因对低温胁迫的响应

鱼类的生长和繁殖受环境条件的调节,冬季的低温会给红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)产业带来不利影响。为研究红鳍东方鲀耐低温机制,本研究利用实时荧光定量PCR技术,分析抗冻蛋白(AFP)基因、冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因、高速迁移蛋白家族蛋白(HMGB1)基因、Y-box结合蛋白(YB-1)基因在不同温度条件下(18℃、13℃、8℃和5℃),在红鳍东方鲀的肝、脾、肾、脑、心、肠、肌肉、性腺和皮肤中的表达情况。结果显示,AFP基因呈广泛性表达,在肌肉中表达量最高(P<0.05),随着温度的降低,各组织中AFP基因的表达量基本呈显著升高的趋势,在5℃组达到最高值,显著高于对照组(P<0.05)。CIRP基因在肌肉中表达量最高(P<0.05),随着温度的降低,各组织中CIRP基因的表达量的升降程度有所不同,在肝、肾、脑、心、肠、皮肤中的表达量呈先升高后降低再升高的趋势,在脾、肌肉和性腺中表达量呈上升趋势。HMGB1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05),在脑、心、肝和皮肤中也有较高的表达量;随着温度的降低,除肝脏外,各组织中HMGB1基因的表达量基本呈先升高后降低的趋势,并在8℃组达到最大值,显著高于其他各组(P<0.05)。YB-1基因在肌肉中表达量最高(P<0.05),在其他组织中表达量较低;随着温度的降低,大部分组织中(脑、心、肠、肾、肝、肌肉和脾)表达量呈先升高后降低再升高的趋势,在8℃组达到最小值(P<0.05)。以上结果表明,4种基因表达水平因组织、温度的不同而不同,反映了这4种基因的功能特异性;在低温胁迫下,4种基因积极响应,表达量均发生不同程度的变化,表明4种基因在红鳍东方鲀低温环境适应中可能具有潜在的重要作用。另外,从表达变化规律来看,8℃可能是红鳍东方鲀应对低温胁迫的关键调控点,过低的温度会造成其调控紊乱,这可为研究红鳍东方鲀低温应答调控机制提供相关依据。     

重组IFN-γ免疫后红鳍东方鲀免疫相关基因在肾组织中的表达分析

为探讨重组红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)干扰素γ(rIFNg-γ)对机体的免疫应答,以不同浓度(25μg/mL rIFNg-γ为实验组1、50μg/mL rIFNg-γ为实验组2)的原核表达的IFN-γ重组蛋白免疫6月龄健康红鳍东方鲀,PBS作为对照组,于腹腔注射后6、12、24、36h取肾脏组织。实时定量PCR检测肾组织IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx1基因在肾脏组织不同时间表达量的差异。结果显示,红鳍东方鲀经rIFNg-γ免疫后6～36h,IFN-α基因在实验组1中的表达呈现先上升后下降的趋势,24h时表达量最高;在实验组2中的表达量在6h最高,随后呈下降趋势。IFN-γ、MHCⅠ在免疫后6h表达量都出现最大值且实验组1高于实验组2,随后呈下降趋势。Mx1基因的表达则出现上升趋势,24h时表达量最高,随后下降。     

红鳍东方鲀3个白介素基因的序列特征及表达分析

本试验分析体质量(190.34±2.13)g的红鳍东方鲀白介素基因IL-1b、IL-8和IL-10的序列特征,检测其在红鳍东方鲀脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏和脾脏中的表达,以及每尾红鳍东方鲀注射密度1×10^7 cfu/mL的哈维氏弧菌菌液0.1 mL后0、12、24、48 h在肝脏和脾脏中的表达。试验结果表明,IL-1b、IL-8和IL-10基因的序列全长分别为771、822 bp和844 bp。3个基因在健康成鱼脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏、脾脏中均有表达,其中肝脏和脾脏表达显著(P<0.05)。感染哈维氏弧菌后12 h,IL-1b基因在肝脏中显著上调,12 h和48 h在脾脏中显著升高(P<0.05)。感染哈维氏弧菌后12 h和24 h IL-8基因在肝脏和脾脏中均显著上调(P<0.05);而感染后24 h和48 h IL-10基因在肝脏中显著升高,在脾脏中12 h和48 h显著升高(P<0.05)。笔者首次探讨红鳍东方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因的序列特性及表达特征,为研究3个基因的原核表达提供了试验信息,将为进一步深入探究重组蛋白活性及其在红鳍东方鲀健康养殖中的应用奠定基础。     

红鳍东方鲀6种同工酶的组织特异性及基因位点分析

采用水平淀粉凝胶和聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳法,对2龄野生红鳍东方鲀的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、眼、鳃6种组织中的苹果酸酶(ME),乳酸脱氢酶(LDH),异柠檬酸脱氢酶(IDH),葡萄糖脱氢酶(GLCDH),磷酸葡萄糖变位酶(PGM)和酯酶(EST)共6种同工酶进行了研究。结果表明,以上6种同工酶存在明显的组织特异性。LDH在除肝脏外的5种组织中活性很强,GLCDH只在肝脏中表达,鳃组织中的GLCDH和肌肉组织中的EST表达活性都很弱。6种同工酶共检测到12个基因位点,其中ME和PGM有两个基因位点编码,EST有5个基因位点编码。本试验还检测到Ldh-1、Est-1、Est-2、Est-3和Est-4共5个基因位点具有多态现象(P0·99),多态位点比例为41·67%,在12个基因位点共观察到17个等位基因表达,平均每个位点表达的等位基因数为1·417个。同时在红鳍东方鲀眼组织中发现,AB3型和B4型LDH间有一条酶带弱表达。     

两种东方鲀的GH基因单核苷酸多态性分析

根据红鳍东方鲀生长激素基因全序列,设计13对引物,结合单链构象多态性(SSCP)技术和克隆测序技术对野生红鳍东方鲀、养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀群体进行了遗传多样性分析.结果表明:东方鲀整个生长激素基因的6个外显子中没有多态性,在其内含子2、内含子5以及3′侧翼区发现有多处序列变异位点,包括碱基的缺失、插入和一些单核苷酸突变.这些遗传多态性的存在为从分子水平上对东方鲀的鉴定提供了一定的依据.群体遗传结构分析结果表明,红鳍东方鲀养殖群体的一些等位基因丧失,造成其遗传多样性显著下降,应及早加强对其种质的保护.     

红鳍东方鲀幼鱼中性别分化相关基因的表达分析

为查明性别分化相关基因在红鳍东方鲀性别分化关键时期的表达规律,以孵化后40、60、80 d的红鳍东方鲀幼鱼为试验对象,对性腺进行组织学观察,并对采样个体进行遗传性别鉴定,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法研究amhr2、dmrt1、gsdf、cyp19a1a、foxl2、dnmt1基因在遗传型为XX(雌性)...     

暗纹东方鲀心型脂肪酸结合蛋白H-FABP基因克隆与表达分析

为深入了解心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding protein,H-FABP)的结构与功能,采用RACE技术克隆得到暗纹东方鲀H-FABP的全长cDNA序列,共772 bp,开放阅读框为402 bp,编码133个氨基酸。生物信息学分析表明,暗纹东方鲀H-FABP基因具有一个脂质转运蛋白家族保守结构域和多个蛋白激酶磷酸化位点。NJ法系统进化分析显示,暗纹东方鲀与红鳍东方鲀亲缘关系最近,其次是鲈形目。经荧光定量PCR检测,H-FABP基因在暗纹东方鲀所有被检测的组织中都有表达,其中肝脏中的表达量最高,其次为肌肉和心脏,预示H-FABP主要参与脂肪酸氧化分解过程。为探究豆油作为脂肪源的可行性,采用不同比例(0、25%、50%和75%)豆油替代鱼油的饲料投喂初始体质量为(8.31±0.20)g的暗纹东方鲀8周。结果显示,全鱼油组肝脏中H-FABP基因的表达量显著高于50%豆油组和75%豆油组,但与25%豆油组无显著性差异,且随着饲料中豆油比例的增加,暗纹东方鲀肝脏中H-FABP基因的表达量呈下降趋势。研究表明,富含n-3多不饱和脂肪酸的鱼油可以促进脂肪酸氧化分解,能预防脂肪肝。因此,为不影响暗纹东方鲀肝脏脂肪代谢,饲料中豆油替代鱼油的比例应控制在50%以下。     

低盐胁迫对红鳍东方鲀幼鱼肝脏的酶活性、组织结构及免疫基因表达的影响

为探讨低盐胁迫下肝脏在红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)机体免疫中的作用,在肝脏酶活性、组织结构和基因表达水平3个方面进行了研究。结果表明,低盐(盐度4‰)胁迫下红鳍东方鲀肝脏中总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)的酶活性显著高于对照组(P0.05);肝脏组织结构中肝细胞发生肿大,形状变形;肝脏IL15和TLR3基因的表达量显著升高(P0.05),而IRF2基因的表达量却未有显著性差异(P0.05)。     

急性低盐胁迫下红鳍东方鲀幼鱼IgM、NKCC1和Hsp70基因的表达

为探讨红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)耐低盐的分子机制,以自然海水组为对照,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析红鳍东方鲀幼鱼在盐度16、12、8和4胁迫下,鳃和肾中免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)、钠钾氯协同转运蛋白1(Na-K-Cl cotransporter 1,NKCC1)和热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)3个基因的表达情况。结果表明,3个基因在鳃和肾中均有表达,IgM和Hsp70基因在鳃和肾中的表达量均无显著性差异(P0.05),而NKCC1基因在鳃中的表达量显著高于肾(P0.05)。同一盐度下,随着时间的增加,鳃中IgM基因的表达量大致呈现先降低后升高的趋势,肾中则呈现先降低后升高再趋于平稳的趋势;同一时间内,鳃中低盐度组与对照组的IgM基因表达量差异比肾中差异更为明显。在鳃中,相同时间内NKCC1基因在各低盐度组的表达量低于对照组,尤其在6h和72h两个时间点时显著低于对照组(P0.05);肾中各时间点的表达量基本都高于0h表达量。在相同时间内,3h、6h、24h、72h的各低盐度组,在鳃中,Hsp70基因的表达量均与同一时间对照组之间差异明显(P0.05);在肾中,从6h开始,各低盐组与对照组之间差异性显著(P0.05)。以上结果表明,红鳍东方鲀幼鱼IgM、NKCC1、Hsp70 3个基因的表达量在不同盐度不同时间下存在差异,由此推测这3个基因对红鳍东方鲀幼鱼的渗透压调节起重要作用。     

不同光照强度对红鳍东方鲀稚鱼摄食的影响

为研究不同光照强度对红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)稚鱼摄食的影响,试验测量了红鳍东方鲀在不同光照强度下的摄食量。结果表明,在400 lx时红鳍东方鲀稚鱼摄食量达到最高,随着光照强度的降低,在1 000～400 lx时,摄食量总体呈现出上升趋势;在400～100 lx时,摄食量呈现出下降趋势。在400 lx时,摄食率和摄食效率均随时间延长逐渐下降;在1 000、700、100 lx时,随着时间的延长摄食率和摄食效率均呈现出先上升后下降的趋势,最大值均出现在40 min。     

池塘主养白须公试验

在0.27 hm2土池进行了主养红白须公秋片鱼种试验,放养红白须公夏花33855尾,白鲢夏花6000尾,花鲢夏花2000尾。经97 d饲养,出塘红白须公秋片17360尾,1675.24 kg,平均体重96.5 g,成活率51.2%,花、白鲢秋片580 kg,平均产鱼8457.15 kg/hm2,其中红白须公占77.3%,产值达108 750元/hm2。     

胶州湾红岛潮间带底栖微藻种类组成及其生物量变化

2004年2月至2005年3月对胶州湾红岛潮间带底栖微藻的种类、数量和叶绿素a、脱镁叶绿素a的含量及其变化进行了研究。结果显示,胶州湾红岛潮间带底栖微藻种类比较单一,仅鉴定出硅藻和甲藻2门,共有7属10种,其中硅藻门5属8种,甲藻门2属2种,其中圆筛藻属Coscinodis-cus的种类最多,有4种。从数量来看,舟形藻Naviculasp.的数量最高,占底栖微藻总量的24.6%,其次是曲舟藻(Pleurosigmasp.),占底栖微藻总量的15.8%,中心圆筛藻Coscinodiscus centralis和多甲藻Peridiniumsp.的数量最少,均占总量的1.8%。底栖微藻的个体数量为303～226364cell/m2,年平均数量为22685cell/m2。季节变化明显,冬季和春季数量高于夏季和秋季,冬季最高,夏季最低。各站叶绿素a的含量变化基本和底栖微藻的数量变化一致,表现为冬季和春季高,夏季和秋季低,而脱镁叶绿素a的含量变化刚好相反。叶绿素a和脱镁叶绿素a的含量均随取样深度的增加而减少,但叶绿素a的含量在0～15mm的深度内急剧降低,而后维持在较低的含量,相比之下,脱镁叶绿素a的含量降低比较缓慢。     

尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus) cyp19a1a原核表达与蛋白纯化

为表达和纯化尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)cyp19a1a蛋白,本研究从尼罗罗非鱼卵巢提取总RNA,反转录获得cDNA模板后,利用设计的引物PCR扩增cyp19a1a ORF区1200 bp片段,双酶切后连接到pET-28a(+)表达载体上,经酶切验证和DNA测序鉴定,证明成功构建了pET-28a-cyp19a1a原核表达载体。将表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)BL21中,优化IPTG诱导浓度和诱导时间。结果显示,在0.5 mmol/L IPTG诱导8 h后,cyp19a1a重组蛋白大量表达,并以包涵体形式存在。通过Ni2+-NTA层析柱和切胶纯化,获得与预期片段大小一致的表达蛋白,并用Western blotting验证了纯化的蛋白为目的蛋白。本研究为制备cyp19a1a抗体和研究高温对cyp19a1a蛋白表达的影响提供了重要的基础。     

青岛潮间带底栖微藻生物量研究

2004年3~6月,选择胶州湾口近海作为研究海区,在栈桥、湛山湾和石老人3个站位每月取样两次,每次退潮后,在潮间带固定地点采集底质样品,分别测定样品中叶绿素a、b、c和脱镁叶绿素a的含量,同步观测海水温度、海水密度和pH值。结果显示,青岛近岸春季海水水温上升较快,海水密度和pH比较稳定。栈桥取样点底质中叶绿素a、b、c和脱镁叶绿素a的平均含量分别为0·58、0·47、0·34和0·16μg/g。湛山湾取样点底质中的叶绿素含量最高,波动较小,叶绿素a、b、c和脱镁叶绿素a的平均含量分别为0·72、0·56、0·36和0·45μg/g。石老人海水浴场底质中的叶绿素含量最低,波动较大,叶绿素a、b、c和脱镁叶绿素a的平均含量分别为0·36、0·28、0·20和0·29μg/g。     

花鲈性腺分化组织学及性别相关基因cyp11b和cyp19a1a的表达分析

以花鲈(Lateolabrax maculatus) 1~214 dph (day post hatching)的仔稚鱼、幼鱼以及18月龄的雌鱼和雄鱼为研究对象,研究了花鲈早期性腺发生、发育和分化情况;分析了性腺分化过程中性别相关基因(cyp11b和cyp19a1a)的表达及与性别之间的关系。结果显示,在30 dph [全长为(1.28± 0.10) cm],首次在中肾管前端的腹腔膜周围观察到原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs),说明30 dph前是花鲈胚后PGCs迁移至生殖嵴的关键时期;在55 dph [全长为(2.45±0.19) cm],观察到一对呈对称分布的原始性腺已经形成,说明花鲈幼鱼的原始性腺在30~55 dph (全长为1.28~2.45 cm)之间发生;55~180 dph时(全长为2.45~12.28 cm),原始性腺不断发育变大,并且一直处于未分化状态;180 dph后性腺开始分化;在195 dph [全长(14.54±1.54) cm]观察到精巢开始分化,卵巢于205 dph [全长为(15.86±0.94) cm]开始分化,且性腺的解剖学分化要早于细胞学分化;18月龄的花鲈幼鱼性腺发育到Ⅱ期。性别分化相关基因cyp19a1a在花鲈卵巢中的表达量高于同期精巢,说明其在卵巢的分化及维持中发挥更关键的作用,而cyp11b在18月龄幼鱼Ⅱ期精巢中的表达量显著高于同时期的卵巢及Ⅰ期精巢,说明其主要在精巢的分化及维持中扮演重要角色。本研究结果不仅可以丰富花鲈的繁殖生理学资料,也为其性别调控技术的研究提供了科学依据。     

渤海近岸叶绿素和初级生产力研究

1998年 5、8和 10月分别对渤海近岸水域进行了综合调查 ,调查的内容包括海洋生物资源、浮游生物、叶绿素以及水文化学要素。作者在对 3个航次调查中叶绿素资料分析、整理的基础上报道了渤海近岸水域表层叶绿素 a和初级生产力的分布特征及季节变化。渤海近岸水域表层叶绿素 a的含量为 0 .5 4～ 16 .78mg/ m3 ,平均值为 2 .88mg/ m3 ,且季节变化明显。 5、 8和 10月 3个航次叶绿素的含量依次降低 ,其平均值分别为 3.4 7mg/ m3 (1.30～ 16 .78mg/ m3 ) ,3.0 1mg/ m3 (0 .5 8～ 15 .36mg/ m3 )和 2 .15 mg/ m3 (0 .5 4～ 14 .0 9mg/ m3 )。初级生产力采用叶绿素法测定。计算结果显示 ,渤海近岸水域初级生产力的平均值具有明显的季节变化 ,夏季 (8月 )初级生产力最高 ,平均为 4 2 0mg C/ m2 · d (32～ 180 9mg C/ m2 · d) ,春季 (5月 )次之 ,平均值为 319mg C/ m2 · d(6 8～ 12 6 7mg C/ m2 · d) ,再次为秋季 (10月 ) ,平均值只有 189mg C/ m2 · d(17～ 10 5 1mg C/ m2 · d)。整个调查水域 3个航次初级生产力的平均值为 32 7mg C/ m2·d(17～ 180 9mg C/ m2·d)。     

双酚A对暗纹东方鲀幼鱼类固醇合成酶基因表达的影响

为研究环境激素对养殖鱼类性别分化前后的内分泌干扰效应,分别将孵化后25 d(dph)的暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)稚鱼和95 dph的幼鱼暴露于不同浓度双酚A(BPA)(0、50μg/L、200μg/L、1 000μg/L)3周和2周,用荧光定量PCR(QRT-PCR)方法检测编码性类固醇激素合成酶及相关因子的基因(STAR、CYP17a、CYP11b及CYP19a)表达。结果显示,BPA诱导了稚鱼STAR、CYP17a和CYP11b表达上调,且与浓度有正相关,而CYP19a表达在BPA 200μg/L和1 000μg/L浓度下分别暴露3周后显著下调。在幼鱼暴露组中,雌雄性腺发生不同的应答,精巢中STAR、CYP17a及CYP11b的表达出现先下调后上调,CYP19a则呈先受抑制后表达升高;在卵巢中STAR、CYP17a及CYP11b的表达先受抑制,随着时间的延长基因表达上调,CYP19a的表达受抑制。研究结果表明,BPA通过干扰性别分化初期暗纹东方鲀类固醇激素合成酶及相关因子的表达的而对性别分化产生影响;通过抑制雄性暗纹东方鲀中类固醇合成相关基因的表达而表现出内分泌干扰效应。对于雌鱼中类固醇合成相关基因的表达的影响则有波动性的变化,其作用机制仍需要进一步研究。     

新安江水库表层水有色溶解有机质浓度的时空分布浅析

2011年3月至2012年2月对新安江水库表层水有色溶解有机质(CDOM)浓度的时空分布进行了研究。利用XRX-620快速多参数水质剖面仪测定和统计分析得到新安江水库表层水CDOM浓度在4个样点上的月变化,结果显示表层水CDOM浓度在春季明显高于其他季节,夏初表层水CDOM浓度为全年最低,上游至下游浓度逐渐降低。CDOM浓度与叶绿素a浓度无显著正相关关系,表明新安江水库表层水CDOM的主要来源是陆源。     

洋山深水港区域夏季叶绿素a分布及年际变化

根据2001年、2003年~2006年8月对洋山深水港工程建设项目所在地周边海域进行的生态调查,对该区域叶绿素a变化情况进行了研究分析。调查区域叶绿素a平均浓度呈现先下降后上升的趋势,最大值为2001年的2.61 mg/m3,最小值为2004年的1.27 mg/m3;港区、航道区变化趋势与全区相一致,大桥区略有不同,2003年至2005年叶绿素a浓度呈下降趋势,2006年出现回升;同一区域,表层叶绿素a浓度变化幅度小于底层;受工程施工的影响,底层下降快且恢复缓慢;2001年底层叶绿素a浓度高于表层,而2003~2006年则是表层浓度较高;叶绿素a浓度年际变化与网采浮游植物丰度变化相一致,但其相关性不明显。