黄鳝ghrelin基因的克隆及分子特征分析

Ghrelin是联系生殖和能量代谢的重要桥梁信号分子,通过克隆黄鳝(Monopterus albus)的ghrelin基因并对其基因结构和功能进行了初步分析;运用c DNA末端快速扩增技术获得了黄鳝ghrelin基因的c DNA序列和DNA序列全长。结果表明,黄鳝ghrelin基因c DNA全长552 bp(Gen Bank accession no.JX122807),包括115 bp的5'端非编码区、324 bp的完整开放阅读框以及113 bp的3'端非编码区;DNA序列全长1323 bp,由3个内含子和4个外显子构成,内含子剪切位点具有典型识别核苷酸GT/AG,3个内含子分别为594 bp、84 bp和93 bp,4个外显子长度分别为229 bp、78 bp、112 bp和133 bp。氨基酸序列分析显示,ghrelin基因推导的Ghrelin蛋白前体原(propreghrelin)序列由26 aa的信号肽、19 aa的成熟肽以及C端氨基酸残基等构成;其中,成熟肽第3位为丝氨酸(Ser3),是Ghrelin的酰基化位点;C端氨基酸残基序列极可能包括与Ghrelin成熟肽功能相互拮抗的肥胖抑制素(Obestatin)。氨基酸的同源性及进化关系分析表明,黄鳝与某些鲈形目鱼类的蛋白前体原存在高度相似性,且在进化上黄鳝与较高级的鲈形目、鲽形目鱼类聚为一支。ghrelin基因结构及其蛋白质某些氨基酸残基序列的高度保守,预示着Ghrelin在脊椎动物中有着重要的生理功能与类似的作用机制。     

鲤胸腺素Tβ全长cDNA的克隆与序列分析

应用荧光DDRT-PCR从鲤外周血白细胞克隆了鲤胸腺素β(thymosinβ,Tβ)基因cDNA全序列。序列分析表明,TβcDNA全长528bp,其完整的读码框架位于40～178bp,编码46个氨基酸,5'非编码区长39bp,3'非编码区长为348bp,且具有Poly(A)加尾信号(AATAAA),将该基因序列递呈GenBank,注册序列号为AY457946。氨基酸序列同源性分析显示,鲤Tβ氨基酸序列与鲤Tβa、斑马鱼Tβa及斑马鱼Tβ-2同源性均为84%。在系统发生树上,鲤Tβ与鲤、斑马鱼、白斑狗鱼和鲑Tβa及斑马鱼Tβ2聚类。     

西伯利亚鲟CXCR7基因cDNA全长的克隆及其表达分析

采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),首次克隆了西伯利亚鲟(Acipenser baerii)的CXCR7a和CXCR7b基因的全长cDNA。CXCR7a的cDNA全长为2 325 bp(登录号为:JQ034508),包括207 bp的5'端非翻译区(UTR)、可编码362个氨基酸的1 086 bp的开放阅读框(ORF)及包括poly(A)尾巴在内的大小为1 032 bp的3'端非翻译区(UTR);CXCR7b的cDNA全长为2 423 bp(登录号为:JQ034509),包括209 bp的5'端非翻译区(UTR)、可编码370个氨基酸的1 110 bp的开放阅读框(ORF)及包括poly(A)尾巴在内的大小为1 104 bp的3'端非翻译区(UTR),并对它们编码的蛋白质序列的分子特征进行了分析。氨基酸序列相似性(similarity)分析表明,CXCR7a与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)的CXCR7相似性分别为82.6%、81.4%、80.9%、81.0%;CXCR7b与人、小鼠、非洲爪蟾、斑马鱼的CXCR7相似性分别为82.9%、82.3%、80.8%、82.5%;西伯利亚鲟CXCR7a与其CXCR7b的相似性最高为96.5%。系统进化树分析显示,西伯利亚鲟与斑马鱼聚为一簇,两栖类聚为一簇,其它高等脊椎动物再进行聚类。对CXCR7a和CXCR7b在各发育时期胚胎及仔鱼的表达状况分别进行定性分析表明,CXCR7a在除卵裂期、囊胚期的胚胎外,其在原肠胚中期至出膜1 d的仔鱼的各时期中均具有表达,CXCR7b在卵裂期至出膜1 d的仔鱼的各时期中均具有表达。另外,从基因组DNA水平上表明CXCR7a和CXCR7b来自不同的基因拷贝。这些结果为进一步研究CXCR7在西伯利亚鲟侧线系统发育中的作用提供了新的基础资料。     

草鱼免疫球蛋白M重链基因的克隆及表达

用RACE-PCR方法扩增出草鱼免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM) 分泌型的重链全长cDNA.其cDNA全长为1 940 nt,包含5'非编码区20 nt,3'非编码区189 nt,开放阅读框1 731 nt,编码576个氨基酸.序列比对分析表明草鱼IgM与鲤的相似性高达68%,与斑马鱼、斑点叉尾鱼回、鳜以及大西洋鳕的相似性分别为61%、43%、33%和30%.ClustalX比对结果显示:草鱼IgM中存在半胱氨酸和色氨酸的保守位点.进化分析表明,草鱼IgM与斑马鱼的IgM聚为一枝.荧光定量PCR显示草鱼IgM的mRNA主要在头肾、中肾和脾脏中表达,表明了这三个免疫器官是IgM表达的主要场所.     

仿刺参超氧化物歧化酶基因cDNA全序列的克隆及其特征分析

以仿刺参Apostichopus japonicus为材料,利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法首次得到仿刺参MnSOD的全长cDNA。该全长cDNA大小为955bp,其中5′端非编码区67bp,3′端非编码区216bp,开放阅读框(ORF)672bp,在3′端有多聚腺苷酸信号序列ATTTA,并有polyA加尾,符合有效翻译的基因全长cDNA的特征。MnSOD全长cDNA可编码223个氨基酸的前体蛋白,预测蛋白分子质量为24.64kD,理论等电点是6.66,为亲水性蛋白。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构,仅有一段线粒体导肽。其二级结构主要以α-螺旋为主,无规则卷曲和延伸链构成了蛋白中量最大的结构元件,不含β-折叠。仿刺参SOD的氨基酸序列与目前已报道的其他物种如人、牛、斑马鱼、原鸡、非洲爪蟾、中国对虾、皱纹盘鲍、海湾扇贝、果蝇等的MnSOD氨基酸序列进行序列比对的结果表明,相似性均在61%～69%之间,说明该基因在各物种间具有一定的保守性。该段氨基酸序列无N-糖基化位点,含有3个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个肉豆蔻酰基化位点,还发现了1个SOD家族的特征肽段DVWEHAYY。对磷...     

草鱼TLR9基因全长cDNA的克隆及特征分析

采用同源克隆及快速扩增cDNA末端技术,从草鱼鳃组织中克隆了Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)基因的cDNA全长。序列分析表明,草鱼TLR9 cDNA全长3 468 bp,编码1 058个氨基酸,其中包括18个氨基酸组成的信号肽、16个富含亮氨酸重复结构域(leucine rich repeat,LRR)、1个跨膜区和1个TIR结构域(Toll/IL-1 receptor)。该蛋白的分子量为121 921 u,等电点为8.80。氨基酸序列的同源性分析显示,草鱼TLR9与鲤TLR9的同源性最高(85%),依次为斑马鱼(82%)、大西洋鲑(55%)、虹鳟(55%)。在系统发生树上,草鱼TLR9首先与鲤科的鲤和斑马鱼聚类。通过半定量RT-PCR检测可知,草鱼TLR9在被检测的15个组织中都有表达,其中在鳃中的表达最高,其次为血、头肾等。这些结果为进一步深入研究TLR-9的功能及开发草鱼免疫增强剂奠定基础。     

军曹鱼dnd基因cDNA克隆及其在性腺周年发育过程中的表达

本研究通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了军曹鱼(Rachycentron canadum)dnd基因(Rcdnd)的cDNA序列,全长1339bp,其中,5'非编码区59bp,3'非编码区173bp,开放阅读框(ORF)1107 bp,共编码368个氨基酸.Rcdnd氨基酸序列含有1段RNA识别保守基序(R...     

团头鲂 HSP70 cDNA 的克隆、序列分析以及热应激对其 mRNA 表达的影响

采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)分离、克隆出团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏热休克蛋白70(HSP70)基因全长cDNA序列,共2 224 bp,包括135 bp5'非翻译区、1 932 bp阅读框以及157 bp 3'非翻泽区[不包括Poly(A)].阅读框共编码643个氨基酸,分子量计算值为70.53 kD,理论等电点为5.25.该HSP70基因在翻译区不含内含子,符合诱导型HSP70的特征.团头鲂HSP70氨基酸序列中含有HSP70家族的3个签名序列以及细胞质特异性调控基序EEVD等.同源性分析表明,团头鲂HSP70氨基酸序列与斑马鱼等脊椎动物的相似性高达84.0%以上,与无脊椎动物果蝇的相似性也高达73.4%.生物信息学分析显示,团头鲂HSPTO基因所编码的蛋白质以亲水性区域为主,具有丰富的B细胞抗原位点,无信号肽,无跨膜区域,为非分泌型蛋白;同时还含有众多的蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,推测其可能在细胞信号转导与调控中发挥重要作用.该蛋白含有2个部分重叠的双向核定位序列,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,空间结构包括N端ATPase功能域和C端多肽结合功能域.应用实时定量PCR研究高温(34℃)应激对团头鲂HSP70 mRNA表达的影响.结果表明,在热应激过程巾肝脏HSP70 mRNA水平呈先升高后下降的变化趋势,说明该基因的表达受热应激调控,本实验克隆的序列为诱导型HSP70 cDNA.     

鳜胃蛋白酶原基因cDNA全长的克隆与序列分析

利用RT–PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆鳜(Siniperca chuatsi)胃蛋白酶原基因cDNA全长序列，并对该基因的结构特征和系统进化关系进行了分析。鳜胃蛋白酶原基因cDNA序列全长1367 bp，5′端非翻译区43 bp，3′端非翻译区187 bp，开放阅读框(ORF)1137 bp，共编码378个氨基酸。鳜胃蛋白酶原氨基末端存在信号肽和激活肽序列，序列中含有催化活性必需的2个天冬氨酸残基和构成二硫键的6个半胱氨酸残基。鳜胃蛋白酶原氨基酸序列与其他脊椎动物胃蛋白酶原氨基酸序列的同源性为59.9%～91.2%，表明胃蛋白酶原基因在脊椎动物的长期进化中比较保守。鳜胃蛋白酶原基因的成功克隆不仅为进一步研究该基因的时空表达奠定基础，而且为鱼类胃蛋白酶原的分子特征和进化提供了新的资料。     

奥利亚罗非鱼雌激素β受体两种亚型cDNA的克隆、组织分布及雌激素对其表达的影响

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了奥利亚罗非鱼β雌激素受体基因(estrogen receptorβ,ERβ)两种亚型的cDNA全序列(ERβ1和ERβ2)。荧光定量PCR分析雌雄奥利亚罗非鱼两种亚型的组织分布,并观察注射外源雌激素对雄性奥利亚罗非鱼下丘脑-垂体-性腺轴雌激素受体ERα和β(β1/β2)基因表达的影响。序列分析表明,ERβ1cDNA全长为4262bp,其中包含239bp5′非编码区,2349bp3′非编码区和1674bp的开放阅读框,共编码557个氨基酸。ERβ2 cDNA全长为2506bp,包含5′非编码区393bp,3′非编码区109bp,阅读框为2004bp,共编码667个氨基酸。氨基酸序列同源性分析显示奥利亚罗非鱼ERβ1与尼罗罗非鱼的相似性高达99.1%,而与鲈形目其它鱼类的相似性为82.6%～94.2%。ERβ2氨基酸序列与尼罗罗非鱼的相似性为98.7%,与大口黑鲈、虹鳟、底鳉及斑马鱼的相似性分别为81.8%、76.3%、64.7%和55.0%。在系统进化树上奥利亚罗非鱼的ERβ1和ERβ2分别与尼罗罗非鱼的相应受体聚类。奥利亚罗非鱼ERβ1/β2基因在所检测的10种组织中均有...