荧光原位杂交技术的研究及其应用

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是现代分子生物学及基因工程中广泛应用的新技术,它可以鉴定核酸分子之间的同源性。荧光原位杂交技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法。综述了荧光原位杂交技术的原理、应用及其前景。     

尼罗罗非鱼六个性别相关标记的FISH分析

从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）BAC基因文库5个克隆中提取和纯化含有6个性别连锁或相关标记（CLC5，GM204，GM271，GM354，UNH995和UNH104）的重组质粒DNA作为模板，以简并核苷酸为引物，通过PCR制备原位杂交探针。探针用荧光素进行标记，并与尼罗罗非鱼中期相染色体进行荧光原位杂交以确定这些标记在尼罗罗非鱼染色体上的位置和分布。结果显示，这些性别连锁或相关标记都位于尼罗罗非鱼第一对染色体长臂近末端，从分子细胞学角度验证了第一对染色体是尼罗罗非鱼的性染色体。另外由于这些标记的荧光信号在XY个体的2条性染色体上都有，一方面说明这些标记在罗非鱼上还不是性别特异的；另一方面也验证了尼罗罗非鱼的性染色体还处于分化的早期阶段。【中国水产科学，2006，13（4）：525—529】     

牙鲆和半滑舌鳎5S rDNA基因的染色体定位及鲽形目5种鱼类的分子系统学分析

利用荧光原位杂交(FISH)技术将5S rDNA基因定位在牙鲆和半滑舌鳎染色体上,结果表明,5S rDNA基因在雌、雄性半滑舌鳎的一对同源染色体上分别存在2个杂交信号位点;在二、三倍体牙鲆的同源染色体上分别存在2个和3个杂交信号位点,杂交信号明显且特异。本研究首次将5S rDNA基因定位在半滑舌鳎和三倍体牙鲆的染色体上,为牙鲆及半滑舌鳎倍性鉴定、染色体鉴别提供了有效方法。此外,根据牙鲆5S rDNA基因编码区序列设计引物,扩增出大菱鲆和半滑舌鳎5S rDNA基因编码区序列,与鲽、塞内加尔鳎、大口黑鲈、七鳃鳗的5SrDNA基因序列进行同源性比较后发现,5种鲽形目鱼类5S rDNA基因序列同源性高达98.3%,系统发生分析结果显示5种鲽形目鱼类聚为一支;各序列中GC含量均显著高于AT含量。     

半滑舌鳎含sox9基因BAC克隆的筛选及BAC-FISH定位

以本实验室构建的半滑舌鳎BAC文库为基础,通过对其进行有序混合,构建了两步PCR筛选体系;对性别决定相关的sox9基因的序列设计特异性引物,筛选获得阳性单一BAC克隆。利用BAC-FISH技术将包含sox9基因的BAC克隆定位在半滑舌鳎染色体上。结果显示,sox9基因在雌、雄半滑舌鳎的一对常染色体的长臂上分别存在两个杂交信号位点,信号稳定且特异。研究证实了该文库筛选体系的有效性;首次实现了对性别相关的sox9基因在半滑舌鳎染色体上的定位,其结果为揭示sox9基因参与鱼类性别控制的机制提供了重要基础。     

荧光原位杂交概述

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记，     

黄姑鱼染色体识别与重复序列定位

黄姑鱼是我国重要的海水经济鱼类。然而,由于细胞遗传标记匮乏,黄姑鱼染色体仍然难以辨识。为了提高黄姑鱼染色体的配对识别水平,本研究利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、吉姆萨染色和荧光染色技术分析了黄姑鱼染色体的特征。以总DNA为探针进行基因组DNA荧光原位杂交(genomic fluorescence in situ hybridization,GISH),从而获得黄姑鱼染色体图谱,可使每对染色体呈现特定的荧光信号。依据GISH荧光信号分布模式,可以辨识黄姑鱼的24对染色体。18S r DNA FISH结果显示,18S r DNA只有一对信号,分布于1号染色体臂间,并与吉姆萨染色呈现的次缢痕、DAPI阴性带和DPI染色高亮区域同位。5S r DNA有一强一弱两对信号,信号强的一对分布于1号染色体着丝粒端,信号弱的一对分布于4号染色体的远端。端粒信号在所有染色体的端部显示,但个别染色体一端信号微弱。本研究结果丰富了黄姑鱼的细胞遗传标记,为解决黄姑鱼染色体辨识问题提供参考依据,也为进一步研究石首鱼科染色体进化提供了资料。     

鱼类性别特异分子标记筛选及分子性控育种研究现状与展望

本文系统介绍了鱼类性别特异分子标记筛选的研究历程、分子标记辅助性控育种的研究进展及展望。首先，作者回顾了我国鱼类性别特异分子标记的研究历程，包括探索期(2001—2006年)，突破期(2007—2012年)和快速发展期(2013—2023)，其中在突破期重点描述了半滑舌鳎、黄颡鱼等性别特异分子标记的发现，为我国鱼类性别决定机制研究和性控育种提供了重要技术手段。其次介绍了分子标记辅助性控育种的研究进展，采用性别特异分子标记辅助培育出半滑舌鳎“鳎优1号”，黄颡鱼“全雄1号”、“全雄2号”等新品种，极大的推动了我国鱼类性别控制育种研究工作。最后，文章对我国鱼类性别特异分子标记筛选和分子标记辅助性控育种的未来发展方向进行了展望，提出今后应从持续开发养殖鱼类性别特异分子标记、强化鱼类性别特异分子标记筛选方法创新、优化鱼类性别特异标记的应用方法等方面加强鱼类分子标记辅助性控育种的研究。     

异源三倍体鲫鲂的遗传组成和生殖特性观察

红鲫属鲤亚科,其染色体数目为2n=100;团头鲂属于鲌亚科,其染色体数目为2n=48。在红鲫(♀)×团头鲂(♂)的远缘杂交F1代中获得了异源三倍体鲫鲂和异源四倍体鲫鲂。本研究对异源三倍体鲫鲂进行了染色体核型分析、染色体FISH杂交检测和性腺结构观察,结果表明:1)异源三倍体鲫鲂的染色体数目为3n=124,染色体核型公式为31m+45sm+26st+22t,染色体组由2套红鲫染色体和1套团头鲂染色体组成;2)利用红鲫特有重复序列为探针进行FISH杂交,红鲫的100条染色体均被标记上荧光信号,而团头鲂的染色体均未标记上荧光信号,异源三倍体鲫鲂中有100条染色体被标记上荧光信号,说明异源三倍体鲫鲂含有2套红鲫来源的染色体组;3)异源三倍体鲫鲂的性腺发育异常,其卵巢型和精巢型性腺发育呈现出退化的特征。研究还讨论了异源三倍体鲫鲂的形成机制。实验结果为鱼类远缘杂交和多倍体鱼研究提供了实验数据,在鱼类遗传育种方面具有重要意义。     

热休克蛋白70(HSP70)基因在中国对虾染色体上的定位

以热休克蛋白70(HSP70)基因为探针,利用荧光原位杂交(FISH)的方法,将其初步定位在中国对虾(Fenneropenaeus chinesis)染色体上。观察150组精巢细胞染色体,有111组染色体有3个杂交信号,占所观察的74％,由此得出,热休克蛋白70基因(HSP70)很可能存在于中国对虾减数分裂细胞3对染色体的3个位点上。本研究首次将功能基因定位在了对虾染色体上,为中国对虾的遗传物理图谱的构建提供了有效可行的方法。     

软骨鱼类染色体研究进展

在各类脊椎动物中，软骨鱼类是开展染色体研究最少的类群。迄今为止，文献共报道了70种软骨鱼的核型，仅占现生838种软骨鱼类的8．35％，包括31种鲨类，37种鳐类和2种全头类。已报道的软骨鱼类二倍体染色体数为52～104（巴西双鳍电鳐二倍体染色体数为28例外），常存在微染色体。在不同的分类阶元，相对原始的软骨鱼类具有较多的染色体数，端部和亚端部着丝粒染色体较多，多有微染色体。软骨鱼类染色体进化趋势表现为个体染色体数目的减少。中部和亚中部着丝粒染色体数目的增多，并伴随微染色体的消失。软骨鱼类是核DNA含量较大的脊椎动物。已报道144种软骨鱼类的核DNA含量，其变化较大，为3．0～34．1pg／N，全头类的核DNA含量最小，角鲨目和扁鲨目的核DNA含量最大。近年来，在软骨鱼类染色体的C带、核仁组织区（NOR）染色、限制性内切酶显带、特异DNA探针如端粒序列和短散布重复序列（SINE序列）的荧光原位杂交等方面取得了较大进展。现代分子生物学技术也被用于一些软骨鱼类的基因组研究，在重复DNA序列、随体DNA家族和微卫星位点等方面均取得一些成果。     

原位杂交技术及其在水产养殖中的应用

原位杂交技术是近年来快速发展起来的一门新技术。本文介绍了原位杂交技术的基本原理和几种常用的原位杂交技术,并概述了原位杂交技术在水产养殖中的应用现状,包括该技术在基因定位、性别鉴定和病毒检测等领域的应用。此外,还对该技术的应用前景进行了展望。     

海带雌配子体细菌人工染色体(BAC)文库构建及特异分子标记邻近基因的图位克隆与序列

UV性别决定系统在一些低等生物生活史的单倍体阶段展现出特定的进化和遗传特性。实验构建了一个海带雌配子体基因组的细菌人工染色体(BAC)文库,结果显示,该文库包含31 872个克隆,插入片段平均长为115 kb,覆盖6.57倍的海带基因组。利用海带雌配子体特异性的标记FRML-1488的序列为探针筛选BAC文库,获得4个阳性BAC克隆。随机挑选一个克隆(638-C12),通过Roche454第二代测序平台进行测序,并经过间隔序列的扩增、克隆和测序,了解到该BAC克隆的插入片段长为86 996 bp。该序列位于海带基因组的Scaffold285上,占后者序列总长的22.4%。序列分析结果显示,在雌配子体特异性标记FRML-1488的上游存在大量的微卫星以及Copia逆转录转座子等重复序列。推测BAC克隆638-C12的插入片段可能与海带U染色体的性别决定区相关。本研究是BAC文库在海带性别相关序列图位克隆的首次应用报道,将有助于海带性别染色体结构的揭示及性别决定机制的解析。     

鱼类性别相关基因及性别特异标记的研究进展

对动物性别的研究一直深受人们关注,以哺乳类为代表已经取得了许多可喜的成果。由于鱼类在脊椎动物系统进化中处于承前启后的地位,是脊椎动物中分布最广、种类最多的类群,具有多种多样的生物学特征和重大的经济价值,所以,对于鱼类性别决定机理的研究具有重大意义。本文主要介绍了鱼类性别决定相关基因和性别特异标记的研究进展。     

鱼类性别决定的研究进展

有关鱼类性别决定的研究主要集中在温度、性激素、芳香化酶以及随机重复序列、核受体基因等对性别分化的调控方面。由于鱼类所处分类地位较低 ,生活环境千差万别 ,鱼类性别决定没有一个普遍的模式 ,目前研究的鱼类又各不相同 ,因此象哺乳动物那样的性别决定级联模式还没能阐述。本综述旨在阐述近几年有关鱼类性别决定机制方面的研究动态和进展 ,为系统研究鱼类性别决定机制提供参考     

重要养殖鱼类经济性状QTL定位研究进展

水产养殖动物大多数经济性状诸如生长、肌肉质量和抗病性等都是多个基因控制的数量性状。数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)是染色体上决定一个数量性状的区域,可能包含一个或多个基因。水产养殖鱼类QTL定位的目的是弄清决定一个性状的基因数量和效应,以加快重要经济性状的遗传改良速度。本文综述了几种重要养殖鱼类主要经济性状QTL定位研究进展、存在的问题及发展趋势,为提高标记辅助育种效率提供参考。     

一个奥利亚罗非鱼雌性特异性SCAR标记的建立

以奥利亚罗非鱼Oreochromis aureus为实验材料,通过对800多条随机引物的筛选,获得了1个奥利亚罗非鱼雌性特异性的、长度为1 488 bp的RAPD标记片段RAPD71699-1488,经琼脂糖凝胶电泳后回收、克隆、测序,并根据测序结果设计PCR特异引物,再经PCR条件优化,成功地将该RAPD标记片段转化为实验结果稳定、操作简便的SCAR标记,即SCAROaF1488。采用双重PCR技术,以mtDNA 16S rRNA基因片段为PCR扩增阳性对照,对该标记的有效性在两个群体共200个个体(雌、雄各100个)中进行验证。结果显示,标记检测结果与表型性别的符合度为100%。SCA-ROaF1 488标记的获得为奥利亚罗非鱼遗传性别鉴定及标记辅助选择提供了有效工具,为深入研究鱼类性别相关基因及性别决定机制提供了重要线索和新的思路。     

斑点叉尾鮰基因组的研究

作为重要的水产养殖种类之一,斑点叉尾(IctalurusPunctatus)的基因组学研究已经取得了较大进展。其众多遗传连锁图以及与表型性状有关的DNA分子标记和基因组资源已经建立;基因组中一些重要的重复片段,已经得到鉴定和辨别,这更有利于对斑点叉尾鮰基因组进行物理学分析;通过基因组学方法,获得了大量基因或全长cDNA序列、以及基因进化和与功能相关基因表达方面的信息。利用细菌人工染色体叠连群技术,创建斑点叉尾鮰基因组物理图谱,开发特定片段分子标记,进行数量性状基因位点(QTLs)分析和高密度基因组绘图。通过比较图谱,可以更有效地进行大范围EST分析和I型分子标记绘图。cDNA微阵列或基因芯片技术的利用,加快新基因发现和鉴定的步伐,为分子标记辅助育种和病害诊断与防治研究奠定了坚实基础。     

微卫星（Microsatellite）基本涵义

本刊讯：微卫星（Microsatellite），又称为简单序列重复（SimpleSequence Repeats，SSR），是基因组中广泛分布的1到6个碱基的重复序列，具有高水平的遗传变异。目前微卫星标记已成为基因组研究的非常有效的遗传标记，已用于遗传作图、基因定位、分子标记辅助选择、亲子鉴定、指纹识别。[第一段]     

基于线粒体全基因组结构的鲳属鱼类分子分类研究

为明确鲳属鱼类的线粒体全基因组序列结构、寻找有效的种间鉴别分子标记,并剖析其系统发育信息,从而为鲳属鱼类的分类学、进化遗传学和种质鉴定提供参考依据,测定了鲳属5种鱼类(中国鲳Pampus chinensis、灰鲳P.cinereus、银鲳P.argenteus、珍鲳P.minor、翎鲳P.punctatissimus)的线粒体全基因组序列,并结合NCBI数据库中已有的鲳属鱼类线粒体全基因组序列进行分析。结果显示:1)鲳属线粒体基因组全序列长度在16551 bp到18062 bp之间,其基因组结构与大多数硬骨鱼类一致;比较特别的是,银鲳和镰鲳具有两个tRNA;结构,珍鲳出现ND1基因重排以及两个重复的D-loop结构。2)银鲳与镰鲳的D-loop区出现重复CSB3结构,灰鲳与翎鲳D-loop区出现重复TAS结构。3)ND2基因条形码及其微型条形码均可将鲳属鱼类区分开,可作为有效的鲳属鉴别分子标记。4)东海区的银鲳与镰鲳应为同一物种,灰鲳可能为翎鲳的同物异名。     

微卫星DNA标记技术及其在鱼类中的应用

微卫星存在于几乎所有真核生物的基因组中,且呈随机均匀分布;在染色体上,除着丝粒及端粒区域外,其它区域均有广泛分布。微卫星能参与遗传物质结构的改变、基因调控及细胞分化等过程,有自身特异结合蛋白,能直接编码蛋白质。通过PCR扩增并使用凝胶电泳分离可产生大量含有微卫星DNA片断。微卫星DNA标记技术可应用于分析鱼类物种遗传多样性、分析群体的遗传结构、建立遗传图谱和基因定位、鱼类种质资源的保护、建立微卫星DNA指纹库、亲子鉴定和血缘关系分析以及种群生态学研究。