应用DGGE分析三疣梭子蟹养殖塘底泥细菌的多样

将传统的菌落菌体形态分类方法与分子生物学方法相结合研究了三疣梭子蟹养殖塘底泥中一个细菌类群的多样性。首先采用平板稀释法对三疣梭子蟹养殖塘底泥中的细菌进行分离与纯化，根据各菌株的菌落形态特征初步将118株分离物分为8个类群，其中最大的一个类群的菌落基本特征为圆形、边缘整齐、表面凸起、菌落有光泽，对该类群的细菌多样性分析表明，通过芽孢染色可将产芽孢菌和不产芽孢菌区分开，不产芽孢菌根据其菌体形态又分为3个亚群，其中卵圆形细菌是最大的一个亚群，共有16株。应用PCR-DGGE方法对该类群进行菌株的遗传多样性分析。结果表明，卵圆形类群16株细菌中就有11株不同系统发育型的细菌。最后，将这11株细菌进行了16S rDNA部分序列（约750 bp）的测定，并做系统发育学分析，结果显示，这些细菌的系统发育学地位相距很远，分属于γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria和 Firmicutes等类群。试验结果表明，以菌落特征的差异来挑选不同的菌株作为分析细菌多样性的第一个筛选步骤，会大大低估可培养异养细菌的多样性。     

鲵鱼消化道细菌群落结构及多样性初步研究

采用常规分离纯化与构建16S rDNA克隆文库相结合的方法对（鲵）鱼（Miichthys miiuy）消化道细菌多样性进行了初步研究.结果表明,（鲵）鱼消化道各部位可培养细菌的菌落数量从大到小依次为前肠＞幽门胃＞中肠＞后肠＞前胃＞后胃＞口咽腔,其中肠道部位菌落数量最多.分离细菌菌株主要为杆状细菌和革兰氏阴性菌,对其中的50株典型菌株进行分子鉴定,发现它们主要属于变形菌门的γ-变形菌纲（占52.7％）和β-变形菌纲（占36.8％）,以及厚壁菌门的芽孢杆菌纲（占10.5％）;不可培养细菌16S rDNA文库克隆子主要属于γ-变形菌纲、α-变形菌纲和脱铁杆菌纲,部分序列与已报道的物种相似性较低,说明消化道中可能存在新的有待开发的肠道菌株.     

健康和患病凡纳滨对虾幼虾消化道菌群结构的比较

凡纳滨对虾养殖过程中,早期阶段是病害易感阶段,而消化道菌群结构与对虾健康关系密切。因此,探讨幼虾的消化道菌群尤其是弧菌类细菌与对虾发病的关系对病害有效防治具有重要意义。本实验采用Illumina测序研究了凡纳滨对虾健康和患病幼虾的消化道细菌群落结构,并基于纯培养和16S r DNA,rec A和pyr H基因序列比对,分析了幼虾消化道中弧菌的主要种类组成。结果发现,健康幼虾消化道中α-变形菌纲和厚壁菌门丰度较高,而患病幼虾中γ-变形菌纲、拟杆菌门、放线菌门和β-变形菌纲较高,其中放线菌门丰度差异显著。基于科水平的响应比分析,发现患病幼虾消化道中动性球菌科和噬菌弧菌科的丰度显著降低,而弧菌科的丰度显著升高。相似度分析发现,驱动群落变异的OTU主要来源于弧菌属、海洋杆状菌属、冷杆菌属、假交替单胞菌属以及未分类至属的红杆菌科和微杆菌科。健康幼虾消化道弧菌组成以锡那罗亚州弧菌为主,而患病幼虾消化道弧菌组成以坎氏弧菌为主。尽管健康和患病幼虾消化道内细菌群落结构整体差异不显著,但一些重要类群丰度变化显著,其特征与已知的生态功能一致。     

双斑东方鲀循环水养殖水体细菌群落结构分析

利用16S rRNA高通量基因测序技术研究了双斑东方鲀(Fugu bimaculatus)循环水养殖系统养殖水体细菌种群结构特征,并比较养殖患病(溃疡症)的双斑东方鲀的水体细菌群落结构与健康的之间的差异,探讨细菌群落结构与双斑东方鲀细菌性病害发生的相关性。研究结果表明,双斑东方鲀循环水养殖水体细菌群落的优势细菌门为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes),优势细菌纲为γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria),优势细菌目为黄杆菌目(Flavobacteriales)、硫发菌目(Thiotrichales)、红细菌目(Rhodobacterales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、弧菌目(Vibrionales),优势细菌科为黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、硫发菌科(Thiotrichaceae)、红细菌科(Rhodobacteraceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、交替假单胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)。患病的和健康的循环水养殖水体细菌群落种类组成相似度高,细菌群落多样性指数无较大差异,在同一分类水平上各细菌群落丰度占比差异显著;二者核心微生物(属)的差异明显,健康的循环水养殖水体核心细菌群落以Polaribacter属为主;患病的循环水养殖水体核心细菌群落以弧菌科的发光杆菌属(Photobacterium)和弧菌属(Vibrio)为主,而发光杆菌属和弧菌属的多数种类属于病原菌或条件致病菌。双斑东方鲀患病(溃疡症)与养殖水体细菌群落的弧菌属丰度占比高有关。该研究结果对双斑东方鲀循环水养殖细菌性病害的监测、预警、诊断及管理控制具有重要的意义。     

青岛即墨丁字湾潮间带菌种资源及优势度

为调查青岛即墨丁字湾潮间带菌种资源及优势度情况,采集丁字湾潮间带沉积物,利用平板划线法分离纯化细菌,根据生理生化实验和16S rRNA基因序列分析对分离细菌进行菌种鉴定。结果表明:共分离到细菌66株,属于细菌域的2个大系统发育类群:变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)中的2个科(Vibrionaceae和Bacillaceae))3个属(Vibrio、Bacillus和Shewanella)。青岛即墨丁字湾潮间带内地衣芽孢杆菌(12.12%)、枯草芽孢杆菌(22.73%)和蜡状芽孢杆菌(12.12%)属于优势种,其他菌株均为常见种,芽孢杆菌属为优势属(74.24%)。     

大连两个海区海带相关可培养细菌群落分析

为研究大连两个海区海带相关可培养细菌群落,于2014年12月和2015年3月分别自登沙河湾和正明寺海带养殖区采集健康海带孢子体和海水,采用2216E涂布平板法,共分离出240株细菌,对所有菌株进行PCR和16S rDNA测序。结果表明,120条海带相关序列归属为4个门、5个纲、8个目、15个科、19个属、42个种;120条海水序列属于4个门、6个纲、10个目、18个科、26个属,46个种。在门水平,海带相关和海水细菌群落均可分为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门,其中变形菌门和厚壁菌门为优势门。在属水平,海带相关优势属为嗜冷杆菌属、假单胞菌属、副球菌属和Salinibacterium;海水相关优势属为芽孢杆菌属、假单胞菌属、动球菌属、假交替单胞菌属和弧菌属。只从海带分离出的细菌属于微杆菌属、微小杆菌属、黄杆菌属、短小杆菌属、肠杆菌属、寡养单胞菌属和原小单孢菌属。Srensen指数表明,两个海区海带细菌群落有一定差异,不同海区海水及同一海区海带与海水细菌群落明显不同。     

从患病鲑形石斑鱼中分离到的细菌特征

网箱养殖的鲑形石斑鱼(Epinephelus salmoides)易感染细菌病,外表症状如皮肤出血溃疡,尾部和鳍溃烂,从病鱼中分离到的主要细菌为短杆状,无芽孢细菌。这些细菌呼吸或发酵代谢碳水化合物产酸不产气,氧化酶阳性,对孤菌抑制剂0/129敏感。根据生理生化特征,把这些细菌分成四簇群,第一簇群的细菌由两菌株组成,两菌株在硫代硫酸盐—柠檬酸盐—蔗糖(TCBS)琼脂平板上都形成兰绿色的大菌落。第二簇群的细菌在TCBS琼脂平板上形成大的,黄色菌落,培养48小时后,菌落颜色转变成绿色。这两簇群的细菌都对罗非鱼和鲑形石斑鱼有致病性,并具有同弧菌感染相似的症状。其它簇群的细菌一般是继发性入侵的,即於疾病发     

红鳍东方鲀稚鱼肠道可培养细菌的多样性

使用2216E平板涂布法从肠道样品分离可培养细菌,通过16S r DNA测序鉴定细菌。所有分离的细菌分为变形菌门(包含γ-变形细菌纲和α-变形细菌纲)和厚壁菌门。其中以γ-变形细菌纲为优势(83.3%)。在属的水平,从肠道中共分离出弧菌属、希瓦氏菌属、假交替单胞菌属、亚硫酸杆菌属、芽孢杆菌属、Aliivibrio、发光杆菌属、科尔韦尔氏菌属8个属,其中弧菌属、希瓦氏菌属和假交替单胞菌属的种类占总数的70%。首次发现亚硫酸杆菌属和科尔韦尔氏菌属作为红鳍东方鲀稚鱼肠道菌群的一部分。     

江苏近海海域好氧菌类群组成分析

在对江苏近海海域好氧菌进行调查中,选择了ZD-B287（N119°35′E34°40′）和JC-H187（N121°53′E32°20′两个采样点,分别在春、夏、秋、冬进行了4次水样和底层表面泥层样品采集。以随机挑选的方法分离、纯化了395株海洋好氧细菌,运用16SrDNA基因序例进行鉴定。通过NCBI的BLAST检索系统进行序列同源性比较,与GenBank数据库中获得菌株的16SrDNA基因序列进行多序列匹配排列。得到13株可培养的好氧菌,分别为假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、弧菌属（Vibrio）、红细菌属（Rhodobacter）、海杆菌属（Marinobacter）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、海洋单胞菌属（Marinomonas）、动性微菌属（Planomicrobium）、变形杆菌属（Proteus）、玫瑰杆菌属（Roseobacter）和交替单胞菌属（Alteromonas）。     

象山港紫菜区和网箱区沉积物异养细菌的生态分布

为探讨紫菜和网箱两类海水养殖活动对沉积物异养细菌生态分布的影响,于2006年1月和2006年10月对象山港紫菜养殖区、网箱养殖区沉积物细菌数量和群落结构进行了研究,并与周边非养殖海域对照点进行了比较。结果显示,沉积物异养细菌数量呈现10月份>1月份,网箱养殖区>网箱对照区>紫菜养殖区和紫菜对照区的分布特点,各区异养细菌数量平均值依次为(9.6×104±2.0×105)、(1.5×104±2.4×104)、(4.3×103±1.6×103)和(4.7×103±3.0×103)cfu/g。紫菜养殖区分离细菌109株,归属于17个属,其中芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Coryneforms)为优势菌属;紫菜对照区分离细菌95株,归属于18个属,其中芽孢杆菌属、棒状杆菌属为优势菌群;网箱养殖区分离细菌136株,归属于11个属,其中假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、芽孢杆菌属、不动杆菌属(Acinetobacter)为优势菌群;网箱对照区分离细菌110株,归属于11个属,芽孢杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、弧菌属为优势菌属。紫菜区和紫菜对照区沉积物检出菌属大多为海洋沉积物中的常见菌属,细菌群落多样性较网箱区和网箱对照区高,而网箱区沉积物长期受到高有机质等外界条件的选择作用,系统中细菌群落多样性下降,菌属组成与污浊海域相似,并且这种影响可能已波及至周边海域。可见,两类养殖区沉积物细菌分布特征存在明显差异,细菌数量和菌属组成与养殖自身污染密切相关。     

长臂虾亚科9个种系统发育关系的16S rDNA序列分析

分析了日本沼虾(Macrobrachium nipponense)线粒体基因16S rDNA部分序列,并将其与GenBank中的相关4属8个种的16S rDNA序列进行了同源性比对,探讨其系统发育关系。结果显示,在分析的442个比对位点中,变异位点188个,简约信息位点125个,碱基转换与颠换值比为1.134。以鼓虾(Alpheus cylindricus)为外群,分别用MP法、NJ法及ML法构建的长臂虾亚科4属的系统发育关系分支图显示:白虾属(Exopalaemon)首先与长臂虾属(Palaemon)以及小长臂虾属(Palaemonetes)聚在一起,然后与沼虾属(Macrobrachium)聚为一支;长臂虾属和小长臂虾属出现4个种混合相聚的现象;属间结点置信值以及聚集情况稳定。     

草鱼肠道芽孢杆菌的鉴定及产酶能力分析

从100 g左右的健康草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道中分离出3株疑似芽孢杆菌(Bacillus)菌株(G1、G2、G3),并通过对其进行生理生化特征、16S rDNA全序列和产酶能力的分析,筛选出1株高产酶能力的益生菌株。结果显示:G1、G2和G3菌株与枯草芽孢杆菌在16S rDNA序列相似性≥99%的水平上聚为同一分支,结合形态观察和生理生化特征,最终鉴定G1、G2和G3菌株均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);以水解圈直径/菌落直径比值评定了G1、G2和G3菌株的产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶的能力,其中G1菌株产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶能力(比值分别为2.9、2.2和3.3)均高于G2、G3菌株,具有作为益生菌的潜力。     

太平洋牡蛎核糖体DNA转录间隔子和线粒体基因片段序列测定

以相应引物经PCR扩增了太平洋牡蛎 (Crassostreagigas)的核糖体转录间区域 (ITS 1和ITS 2 )及线粒体 16SrDNA和COI基因片段。PCR产物经T 载体连接后进行克隆和测序 ,分别得到长度为 5 4 3、791、5 30和 70 0bp的核苷酸序列。 4个DNA片段的A、T、G和C碱基含量分别为 2 3.5 7%、2 0 .0 7%、2 9.4 7%和 2 6 .89% (ITS 1) ,2 7.4 3%、19.2 2 %、2 7.0 5 %和2 6 .30 % (ITS 2 ) ,2 9.2 5 %、2 9.2 5 %、2 3.0 2 %和 18.4 9% (16SrDNA) ,2 2 .71%、39.4 3%、2 0 .4 3%和 17.4 3% (COI)。实验证明ITS 1和ITS 2引物在贝类中通用性良好。文中同时讨论了 4个序列在我国几种牡蛎的种类鉴别及相关研究的应用潜力     

草鱼肠道约氏不动杆菌的分离鉴定及药敏特性研究

研究草鱼肠道不动杆菌,为鱼类肠道细菌的分离鉴定与微生态机制研究积累资料。从草鱼肠道中分离纯化获得1株细菌,编号为SW-2,采用细菌形态观察、生理生化特性分析、16S rDNA克隆测序及系统发育树构建等进行研究。结果表明SW-2菌株为革兰氏阴性短杆菌,对葡萄糖、甘露糖、木糖、枸椽酸盐利用等均为阴性;PCR方法扩增SW-2菌株16S rDNA并亚克隆至pMD18-T载体,测序获得序列长度为1 503 bp,与约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)序列相似性最高为99.7%;进一步构建系统发育树显示与A.johnsonii亲缘关系最近,自然聚类为一支,从而确定为约氏不动杆菌(A.johnsonii);药敏试验结果显示SW-2菌株对庆大霉素、羧苄青霉素、阿莫西林、氨苄西林、卡那霉素等药物敏感。人工回归感染草鱼7 d后未出现发病死亡现象,但是否为条件致病菌有待进一步研究。     

斑点叉尾鮰病原细菌的分离鉴定及系统发育分析

用传统的微生物学分离培养方法从斑点叉尾鮰的鳃、肠和肝等器官共分离到16株可疑病原菌（编号为WJ01~WJ16），以提取的基因组DNA为模版，扩增出约600bp大小的16S rDNA片段，测序分析表明：与GenBank数据库中的已知序列相比，16株细菌中有9株同源性在98%以上，5株在95%以上，2株为92%。系统发育分析表明这16株细菌明显的聚为3支。     

6株鱼源嗜水气单胞菌的分子鉴定与毒力基因分析检测

为了分子鉴定6株鱼源嗜水气单胞菌,并从分子层面验证通过检测毒力基因以推测嗜水气单胞菌潜在致病性的可行性。实验采用PCR扩增16 S rDNA和gyrB基因并结合系统发育树的构建和分析进行菌种的分子鉴定,检测气溶素（ aerolysin, aer）、溶血素（ haemoly-sin, hly）、丝氨酸蛋白酶（ serine protease, ahp）、热稳定细胞肠毒素（ heat-stable cytotonic enterotoxin, ast）和热敏感细胞肠毒素（ heat-labile cytotonic enterotoxin, alt）5种毒力基因,且使用Mega 5．2对核苷酸和氨基酸序列进行分析。结果显示6株菌均为嗜水气单胞菌Aero-monas hydrophila,检测出5种毒力基因中的至少4种,其中均检测出溶血素和2种肠毒素,序列分析表明气溶素、溶血素和丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列高度保守。本研究基于16 S rD-NA和gyrB基因可以准确地对嗜水气单胞菌进行分子鉴定,6株菌的毒力基因丰富预示着一定的致病性, aer、 hly和ahp基因相对保守,编码的毒力因子高度同源,在临床分子诊断中建议使用aer、 ahp和hly基因对嗜水气单胞菌的潜在致病性进行检测。     

15株鱼源致病性鲫鱼诺卡氏菌的聚类分析

文章对2006年～2012年从华南地区采样或送检的患“结节病”的鱼类（8个鱼种）样品中分离到的15个病原菌株进行了系统发育和聚类分析。系统发育分析结果显示,所有供试菌的16SrDNA序列均与鲫鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolae）聚为一支,同源性为99％,且明显地分为2个类群;聚类结果显示,15个菌株在T=23时可分为2个组群,在T=11时2个组群,分别可分为2个和4个亚群。研究结果显示15株鲫鱼诺卡氏菌存在多样性。     

加州鲈迟缓爱德华氏菌病的检测和防治

以江苏省吴江市八坼镇区域养殖场加州鲈鱼病鱼的细菌性病原体为研究对象。通过分离纯化,形态学观察,结合16S rRNA基因序列同源性检索,对该病原菌进行初步判断。同时进行药敏实验,了解该病原菌对各种抗生素的耐药性和敏感程度。研究结果:分离纯化得到2株纯菌株L2F和L2P2,革兰染色均呈红色,阴性杆状菌。16S rDNA序列分析,L2F和L2P2菌株与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的同源性达99%。初步判断该菌为迟缓爱德华氏菌。药敏实验结果,该菌对磺胺异恶唑、链霉素和利福平等药物不敏感或耐药,对左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、强力霉素、氟苯尼考、头孢哌酮相对敏感。     

滤食性鲢、鳙肠含物PCR-DGGE指纹分析

以采自武汉东湖的滤食性鲢、鳙为对象，通过PCR-DGGE并结合序列分析对其肠道微生物及肠含物中残留的食物组分进行了探索研究。在所有个体中都能检测到不同的PCR-DGGE指纹谱带，其中包括肠道细菌在内的原核谱带较多，真核谱带相对较少；分析结果表明针对鲢、鳙肠含物这一特殊生境样品进行PCR-DGGE指纹分析是可行的。PCR-DGGE指纹结构及针对部分特定PCR-DGGE谱带的序列分析显示，从武汉东湖采集的鲢、鳙在食性上存在很大的重叠，并没有像基于常规食性分析文献报道的那样明显不同。基于肠含物DNA来进行鱼类食性分析的方法不受对食物碎片分类鉴定的制约，可同时对多个样品平行进行分析，且不同研究者间的研究结果便于进行比较，以便总结生态学的内在规律。     

唾液乳杆菌NF19的液体发酵条件研究

从舟山海域海水中筛选到一株海洋细菌NF19,经16S rDNA分子鉴定和API鉴定结果显示菌株NF19为唾液乳杆菌属(L.salivarius)的一个种,将序列上传至NCBI获得GenBank登录号为FJ405036。通过对菌株NF19进行发酵条件优化及正交试验,得到菌株NF19的最佳发酵条件为:初始pH7.2,接种量为8%,在120 r/min下20℃培养48 h。此条件下发酵液有最佳抑菌效果。