海洋低温碱性蛋白酶的刺激性研究

探究海洋低温碱性蛋白酶的刺激性，并为其应用提供实验依据。作者应用新西兰大耳白兔，以40％、20％和5‰浓度的海洋低温碱性蛋白酶进行皮肤急性刺激试验，5‰海洋低温碱性蛋白酶的皮肤多次刺激性试验，1‰的海洋低温碱性蛋白酶的兔角膜刺激性试验，评价其安全性。结果表明，5‰和20％海洋碱性蛋白酶单次应用实验皮肤未出现红斑和水肿，对皮肤无刺激性。40％海洋低温碱性蛋白酶液对皮肤有中度刺激性。皮肤病理学显示5‰的海洋低温碱性蛋白酶液未见皮肤的慢性刺激反应，皮肤结构完整、层次清晰。1‰的海洋低温碱性蛋白酶液对兔眼亦无刺激性。     

海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒理学研究

应用NIH纯系小鼠骨髓细胞微核试验和染色体畸变试验，探究海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒性作用及对人类的潜在危害。观察并计数嗜多染红细胞（PCE)与正红细胞（NRBC）的比值、微核率；染色体的畸变类型和畸变率，检测海洋低温碱性蛋白酶的诱变作用。结果表明，皮下注射环磷酰胺的小鼠，P／N比值＜1，微核率为22.97‰，染色体畸变率为18.32,与生理盐水（NS）对照组比较差异极显著（P＜0.01)，而海洋低温碱性蛋白酶各组小鼠微核率均＜4‰，染色体畸变率为0.19%-0.25%,与NS组比较无显著性差异（P＞0.05）。未见海洋低温碱性蛋白酶各组对小鼠骨髓细胞的遗传毒性。     

海洋低温碱性蛋白酶的皮肤变态反应研究

利用酶工程技术制得的海洋低温碱性蛋白酶，主要用于加酶的洗涤剂，在室温下有较高的酶活力。为确保海洋低温碱性蛋白酶使用的安全性，并为其应用提供实验依据，本文以豚鼠为受试动物，进行皮肤致敏反应试验。结果表明，经致接触和激发接触，2，4－二硝基氯苯组（DNCB）皮肤最大平均反应值为3.3，致敏率为100％。海洋低温碱性蛋白酶组皮肤最大平均反应值为0.05，致敏率为5％。提示海洋低温碱性蛋白酶为弱致敏物。     

海洋低温碱性蛋白酶亚慢性毒理学研究

应用大鼠经口、经皮肤亚慢性毒性试验，对海洋低温碱性蛋白酶毒理学进行研究。120只Wistar大鼠，随机分为6组：对照组，海洋低温碱性蛋白酶1.2g/kg(经口），1.2g/kg、0.135g/kg、0.015g/kg(经皮）和1.2g/kg(经皮追踪组），用药周期90d，追踪组增加28d观察。记录和检测大鼠的一般状况和体质量增长、脏器系数、血常规、凝血时间、肝肾功、部分血液生化和离子浓度及病理检查。结果表明，海洋低温碱性蛋白酶各组（经皮、经口）大鼠的各项指标与对照组比较均未见明显异常（P均＞0.05），提示大鼠能耐受长期给予1.2g/kg（经皮、经口）的海洋低温碱性蛋白酶。     

产低温碱性蛋白酶黄海黄杆菌YS-9412-130的复合诱变原生质体选育

以黄海黄杆菌YS－9412－130突变株SW1－104为出发菌，在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，对原生质体进行复合诱变，对大量再生突变株进行筛选和淡水驯化，最终获得了高产、稳定的碱性蛋白酶产生菌SW2－104，在自来水培养基中能够大量产酶，产酶活力为3910U／ml。从而解决了黄海黄杆菌YS－9412－130低温碱性蛋白酶大规模工业化生产设备和产业化区域的局限性。     

纳豆菌抗菌肽APNT-6对凡纳滨对虾的低温保鲜效果

研究了一种以抗菌脂肽类物质surfactin、iturin和fengycin为主要成分的新型抗菌肽APNT-6的体外溶血和小鼠口服急性毒性, 为食品应用安全性提供初步评估。将抗菌肽作100倍稀释置于兔血琼脂平板上的牛津杯中观察溶血情况; 结果显示, 经100倍稀释的抗菌肽在体外对血细胞有较强的溶血毒性。将60只小鼠按雌雄各半随机分成6组, 分别以8、40、200、1 000、5 000 mg每千克体重剂量的抗菌肽对小鼠进行一次性灌胃, 7 d内观察小鼠毒性体征并测定相关指标。结果表明, 当小鼠被给予该抗菌肽5 000 mg/kg剂量时, 观察7 d无任何毒性反应, 说明高剂量的抗菌肽经口服在小鼠体内不能达到有效溶血浓度, 其口服半数致死剂量(LD50)大于5 000 mg/kg小鼠体质量, 急性毒性评级属实际无毒级。根据以上结果可知, 新型抗菌肽APNT-6在体外有溶血毒性但经口服对小鼠没有急性毒性作用。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的基因克隆和序列测定

黄海黄杆菌YS－9412－130具有稳定的分泌低温碱性蛋白酶的能力。将其染色体DNA用Sau3AⅠ部分酶切后，低熔点琼脂糖回收2－10Kb的DNA片段，用Klenow大片段酶半补齐，与用SalⅠ酶切且半补齐的质粒pUC19连续后，转化E.Coli.JM109，构建基因文库。且酪蛋白平板法和酶联免疫吸附（ELISA）的活性筛选方法从基因文库中筛选到一株产海洋低温碱性酶的阳性克隆（命名为pHH1）。序列测定分析表明，此重组质粒包含有长度为768bp低温碱性蛋白酶基因的完整的开放读码框架（ORF）和上游基因调控序列。此片段编码由256个氨基酸组成的酶，计算分子量为83000Dal。通过Southern杂交证实了此片段来自于黄海黄杆菌YS－9412－130基因组DNA。     

一种新型抗菌肽APNT-6的溶血性和急性毒性评价

研究了一种以抗菌脂肽类物质surfactin、iturin和fengycin为主要成分的新型抗菌肽APNT-6的体外溶血和小鼠口服急性毒性,为食品应用安全性提供初步评估。将抗菌肽作100倍稀释置于兔血琼脂平板上的牛津杯中观察溶血情况;结果显示,经100倍稀释的抗菌肽在体外对血细胞有较强的溶血毒性。将60只小鼠按雌雄各半随机分成6组,分别以8、40、200、1000、5000mg每千克体重剂量的抗菌肽对小鼠进行一次性灌胃,7d内观察小鼠毒性体征并测定相关指标。结果表明,当小鼠被给予该抗菌肽5000mg/kg剂量时,观察7d无任何毒性反应,说明高剂量的抗菌肽经口服在小鼠体内不能达到有效溶血浓度,其口服半数致死剂量(LD50)大于5000mg/kg小鼠体质量,急性毒性评级属实际无毒级。根据以上结果可知,新型抗菌肽APNT-6在体外有溶血毒性但经口服对小鼠没有急性毒性作用。     

山东省推广适应渔业发展需要七项水产科研成果

近期，山东省组织专家对近两年取得的水产加工、资源、环境科研成果进行了论证，筛选出了7项适应渔业发展需要、具有较高推广价值的项目：一是新型海藻植物生长剂，可使粮食增产10％；二是新型生态农药“农乐一号”海洋生物制剂，能使粮食增产10％；三是海洋生物蛋白酶。该技术总体处于国际先进水平，部分处于国际领先。包覆型洗涤用低温碱性蛋白酶，去污能力超过代表世界先进水平的品牌公司生产的洗涤用碱性蛋白酶，使我国洗涤用碱性蛋白酶进入国际先进行列：四是真鲷、河、牙鲆促生长剂。该成果可以提高海水鱼生长速度，提高饲料效率，缩短养殖周期，     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶发酵过程动力学研究

应用自动控制发酵设备，对黄海黄杆菌YS－9412－130碱性蛋白酶发酵动力学和工艺条件进行了研究。从基本的动力学概念和方程出发，通过分批发酵试验摸索了黄海黄杆菌YS－9412－130生长与代谢的基本规律，证明了发酵过程中低温碱性蛋白酶的形成为生长部分关联型。采用补料分批培养方法限制生长基质浓度，确定其一系列数值，从而推导出细胞生长与产物合成的动力学数学模型。     

吡喹酮不同给药方式对鲫的急性和亚急性毒性研究

研究了吡喹酮不同给药方式对鲫(Carassius auratus)的急性和亚急性毒性试验。急性毒性试验结果显示:浸泡时吡喹酮对鲫的24、48、96 h的半致死浓度(LC50)分别为54.80 mg/L、51.07 mg/L、50.78 mg/L;按每千克鱼体重10 g吡喹酮的剂量灌胃时,96 h未见明显中毒症状。亚急性试验结果显示:在不同的给药方式下,与对照组相比,低浓度的吡喹酮未对碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷丙转氨酶(ALT)的活性造成显著影响(P>0.05);随着试验时间的延长,较高浓度的吡喹酮使SOD活性先升高后降低,ALT活性显著(P<0.05)或极显著高于对照组(P<0.01)。     

Hns对紫贻贝和牡蛎的急性毒性试验

采用环境毒理学急性毒性试验分析方法,分别于24、48、72和96 h研究Hns对海洋污损生物紫贻贝和牡蛎的半数致死浓度、95%置信区间和安全浓度(CS)。结果表明,Hns对紫贻贝的毒性比对牡蛎的毒性高,安全质量浓度为0.854 mg/L,几乎是Hns对牡蛎毒性的8倍。     

恩诺沙星对红笛鲷血清中碱性磷酸酶活力、抗体IgM含量、溶菌酶含量及其抗菌能力的影响

以间隔200mg／kg的恩诺沙星设置8个浓度梯度腹腔注射红笛鲷进行急性毒性实验，测得其安全浓度为67．56mg／kg，参考安全浓度及日常生产给药量取0、20、40、80mg／kg鱼体重恩诺沙星，以腹腔注射及拌料投喂两种不同给药方式，研究恩诺沙星在该浓度范围内对红笛鲷血清中一些免疫指标及其感染细菌后死亡率的影响。实验结果表明恩诺沙星在40m非g浓度组中提高AKP活力、IgM含量、溶菌酶含量的同时可提高红笛鲷抵抗外界细菌感染的能力（P〈0．05）。当用药浓度不足（20mg/kg组）或浓度过高（80mg／kg组），虽然对AKP活力和IgM含量也有影响，但在投喂组中，红笛鲷体内的IgM含量受抑制显著，经腹腔注射2．3×10^7 CFU／mL溶藻弧菌 （ Vibrio alginolyticus ）攻毒后，注射组中相对生理盐水组的死亡率55％；20、40、80mg／kg浓度组红笛鲷的死亡率分别为45％、30％、50％；投喂组中，0、20、40、80mg，kg浓度组红笛鲷的死亡率分别为55％、40％、30％、60％；40mg／kg浓度组中抗菌能力增强；20、80mg／kg浓度组中红笛鲷抗菌能力不受影响或有负面影响。     

Immunization of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, against vibriosis: comparison of an extract antigen with whole cell bacterins by oral and intraperitoneal routes

Abstract. An extract vaccine against Vibrio anguillarum was compared with other vaccine preparations when administered to rainbow trout intraperitoneally or orally on food. Intraperitoneal vaccination resulted in virtually 100% protection within two weeks whereas oral vaccination gave a maximum protection of 50–70% after eight weeks. When administered intraperitoneally the extract performed better than formalin killed cells but when administered orally formalin killed cells were better. The addition of alum as adjuvant enhanced the response to antigen administered by both routes. Serum agglutinin litres after oral vaccination were low and variable but after intraperitoneal injection they reached a consistent peak of 64. As the response to oral vaccination was so low it was not possible to relate agglutinin titre to protection in a quantitative relationship.     

乍得油区环保钻井液的水生生态毒性评价

以国际标准组织(ISO)规定的淡水污染指示生物斑马鱼Brachydanio rerio和乍得湖区优势种泥鳅Misgurnus anguillicaudatus为实验对象,采用96h急性毒性试验,以96h半致死效应浓度(96h LC50)和毒性单位(TUa)为指标,对乍得油区石油勘探开发所用钻井液进行水生环境生态毒性评价及分级.实验结果表明,1号钻井液样品对斑马鱼和泥鳅基本无毒害作用,2号钻井液对斑马鱼和泥鳅均具有低水平毒性效应.2号钻井液对斑马鱼和泥鳅的96h LC50分别为42 362 mg/L、50 861 mg/L,TUa分别为2.36、1.97.对比发现,由于2号钻井液比1号钻井液多了一种添加剂——低荧光白沥青(JHBA-2),生态毒性即由无毒激变为低毒性,因此该添加剂具有明显的环境生物毒性,可在今后的研究开发中弃用或寻求低毒及无毒替代品.