实时定量PCR测定(鮰)爱德华氏菌隐蔽质粒的拷贝数

为测定(鮰)爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)隐蔽质粒的拷贝数, 并探究不同基因组制备方式及定量策略对质粒拷贝数测定的影响, 分别采用试剂盒和水煮法制备(鮰)爱德华氏菌基因组, 通过绝对定量和相对定量PCR测定两种不同总DNA制备方式下的隐蔽质粒拷贝数, 同时测定试剂盒对染色体DNA和质粒DNA的回收率.结果显示, 以试剂盒提取的总DNA测得的pEI1和pEI2拷贝数绝对定量和相对定量分别为3.63 ± 0.30、 5.04 ± 0.18和4.22 ± 0.15、 5.13 ± 0.50, 显著低于以水煮法测得的pEI1 和pEI2 拷贝数的绝对定量11.84 ± 0.80、 11.70 ± 0.25和相对定量13.85 ± 1.64、 11.90 ± 0.97.回收率结果显示, 试剂盒对染色体DNA的回收率(45.8 ± 4.1)% ,显著高于对质粒pEII的回收率(25.1 ± 0.5)%和pEI2的回收率(31.3 ± 1.7)% .结果表明: 通过实时定量PCR测定(鮰)爱德华氏菌隐蔽质粒的拷贝数时, 基因组的制备以水煮法为宜,(鮰)爱德华氏菌隐蔽质粒pEI1和pEI2均属于中拷贝质粒.     

鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕的构建及制备条件优化

菌蜕具有完整细菌表面抗原结构, 可诱导机体的体液和细胞免疫应答, 成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性, 实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体, 转化迟缓爱德华氏菌, 成功制备其菌蜕, 并对菌蜕形态、溶菌动力学、裂解效率以及制备条件等进行了研究。结果表明, 细菌菌蜕表面形成溶菌孔道, 细胞因内容物流失而发生明显的皱缩; 构建的迟缓爱德华氏菌诱导后1 h开始裂解, 5 h后裂解基本完成, 裂解效率为99.99%, 冷冻干燥后重悬涂布平板, 未检出活菌, 电镜观察表明冻干前后细胞形态未见明显变化; 构建的迟缓爱德华氏菌分别在OD₆₀₀值为0.4和0.6进行诱导, 其裂解过程和裂解效率没有明显区别; 分别用LB、BHI、NB 3种培养基进行比较研究, 其中LB培养基制备的菌蜕细胞较完整、裂解完全, 是制备迟缓爱德华氏菌菌蜕最优培养基。本研究成功构建了鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕, 并对其制备条件进行了优化, 为鳗鲡爱德华氏菌病疫苗开发奠定了基础。     

5种淡水细菌的多重PCR检测方法的建立及其应用

细菌对水产养殖品种危害大,造成的经济损失高。传统的显微镜镜检方法检测细菌误差大,而利用PCR方法鉴定细菌种类特异性强,准确性高。利用多重PCR探索出一种能准确鉴定水产常见细菌。研究表明,利用PCR分别扩增了嗜水气单胞菌Hly A基因,肺炎克雷伯菌Khe基因,无乳链球菌Sip基因,爱德华氏菌Ser C基因和Eip基因以及迟钝爱德华氏菌Muk F基因和Gad B基因,扩增特异性强。并成功地建立了一种同时用于无乳链球菌和爱德华氏菌等两种细菌以及爱德华氏菌、肺炎克雷伯菌、迟钝爱德华氏菌和嗜水气单胞菌等4种细菌的多重PCR检测方法。为了验证多重PCR方法的准确性,采集患病黄鳝病灶部位,分离培养细菌并提取该细菌基因组DNA,用上述两种多重PCR方法检测出患病黄鳝体内感染的细菌主要是肺炎克雷伯菌和嗜水气单胞菌。建立的多重PCR检测方法对水产常见致病菌的快速诊断和分子流行病学的调查具有重要意义,为鱼类的疾病诊断提供了依据。     

牙鲆腹水病病原免疫血清的制备和纯化试验研究

用迟钝爱德华氏菌免疫家兔,制备出高效价迟钝爱德华氏菌免疫血清.先制备迟钝爱德华氏菌抗原, 耳缘静脉注射免疫家兔.经微量反应板法检测血清效价, 效价达到1 ∶ 2560;用Millipore Montage抗体纯化试剂纯化抗体,纯化的抗体经SDS-PAGE电泳,杂带较少,条带主要集中于50 kD处;用斑点酶联免疫吸附试验检测时, 迟钝爱德华氏菌呈阳性, 温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、腐败希瓦氏菌、产碱普罗威斯登菌、阪崎肠杆菌和大肠杆菌均呈阴性.试验结果表明,特异、高效价的迟钝爱德华氏菌免疫血清,为快速检测牙鲆腹水病病原奠定了基础.     

养殖大菱鲆病原菌迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其疫苗研制

2006年9月山东胶南某养殖场大菱鲆(Scophthalmus maximus)发生病害,从患病大菱鲆脾脏分离出优势菌株WY28,人工感染试验证实WY28菌株对大菱鲆和斑马鱼(Danio rerio)有较强的致病性,其对大菱鲆和斑马鱼的半数致死剂量(LD50)分别为39cfu/g(Bw)(3.3×102cfu/ind)和2.1×104cfu/g(Bw)(6.4×103cfu/ind).综合该菌在形态与生理生化特征及16S rDNA同源性等方面的实验结果,确定WY28菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda).该菌对先锋霉素V、庆大霉素、氟哌酸、痢特灵等抗生素敏感.WY28菌株经福尔马林灭活制成灭活疫苗,对大菱鲆进行腹腔注射免疫,免疫后第4周测得免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价平均为1:1 280.免疫后第6周.免疫鱼血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体效价达到更高水平(平均值为1:3 289.6).攻毒试验表明,受免鱼的相对存活率明显高于对照组.由此可见,利用从病鱼体内分离的迟缓爱德华氏菌菌株制备的灭活疫苗能使大菱鲆较有效抵御迟缓爱德华氏菌强毒株的攻击.     

迟缓爱德华氏菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

根据克隆得到的迟缓爱德华氏菌gyrB基因序列设计并合成一对特异性引物,通用性和特异性检测结果显示所设计的引物具有良好的种间特异性和种内通用性,构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,经过反应体系优化后建立了检测迟缓爱德华氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法线性关系良好,在Tm为63℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.32x 39.38,相关系数为0.998,扩增效率为1.00,最低能检测到60个拷贝。应用建立的方法对人工感染的大菱鲆病样进行了检测,三个被检样品均呈阳性反应,证明该方法具有较好的适用性。实验结果表明所建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量的优点,可用于迟缓爱德华氏菌病的快速检测。     

“大菱鲆迟钝爱德华氏菌活疫苗”获批兽药产品批准文号并投入应用

<正>迟钝爱德华氏菌引起的腹水病是海水养殖鲆鲽类的一种严重病害,给我国大菱鲆养殖业带来了严重损失。通过863计划海洋技术领域五年的支持,华东理工大学科研团队通过病原基因组和致病机制的基础研究、高效疫苗分子设计和评价的关键技术、疫苗应用规程和规模示范的疫苗开发全链条创新,研制出针对迟钝爱德华氏菌的大菱鲆迟钝爱德华氏菌活疫苗(EIBAV1株),并于2015年获颁国家新兽药一类注册证书。这是我国注册的第一个海水养殖动物活疫苗,也是世界上第一个获得政府许可的针对迟钝爱德华氏菌的鱼用疫苗。2016年12     

大黄鱼中期染色体面积和物理长度的测定

为获知大黄鱼染色体的物理长度,实验采用流式细胞术测定了大黄鱼基因组大小,并利用显微图像分析技术测定了大黄鱼24对染色体的面积和累积光密度(IOD),据此估算了大黄鱼染色体的物理长度。结果显示,大黄鱼基因组大小约为(725.25±14.65)Mb;染色体相对面积最小为2.26%±0.08%,最大为4.83%±0.08%;染色体相对IOD最小为1.80%±0.32%,最大为5.04%±0.15%;物理长度最小的是24号染色体,为(13.1±3.37)Mb,其他染色体的物理长度为(24.4±6.21)~(36.6±1.62)Mb。染色体的物理长度与相对面积、相对长度分别成正线性相关。其中,物理长度-相对面积的相关系数大于物理长度-相对长度。显微图像还显示,同一基因组中的染色体碘化丙啶(PI)着色不完全均一,非同源染色体间、部分同源染色体间以及染色体不同位置均存在荧光强度的差异。研究结果为大黄鱼染色体识别与配对提供了新的数量标记,也为深入解析大黄鱼基因组结构提供基础数据。     

黑棘鲷内脏结节病病原的分离、鉴定及致病性研究

2017年4月,浙江台州某海水养殖公司跑道式养殖池黑棘鲷大量发病,病鱼活力下降、食欲减退、体表溃疡,剖检可见肝脏、脾脏、肾脏肿大且有不同程度的白色结节,同时伴随大量腹水。用胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)从典型结节病濒死黑棘鲷器官分离到革兰阴性短杆菌。分离病原菌AS15对健康黑棘鲷的致病力结果显示,AS15腹腔注射可使健康黑棘鲷发病死亡,死亡黑棘鲷可出现自然发病症状,在(24±1)°C的条件下,(25±2) g黑棘鲷的半数致死浓度(LD_(50))为6.5×10~4 CFU/尾。经API 20E鉴定,分离菌株AS15生理生化特性与类杀鱼爱德华氏菌LADL05-105和迟缓爱德华氏菌典型菌ATCC15947相似度为86.2%,与杀鱼爱德华氏菌ET~T883的相似度为82.8%;AS15的16S rDNA与杀鱼爱德华氏菌ET~T883同源性达99%,gyrB与类杀鱼爱德华氏菌LADL05-105和杀鱼爱德华氏菌ETT883同源性分别为100%和98%;16S rDNA进化树显示,AS15与ETT883、LADL05-105聚为一簇,gyrB进化树与LADL05-105、NCIM2056聚为一簇;采用4种爱德华氏菌属种特异性引物对AS15进行PCR分析,结果显示,AS15可扩增出类杀鱼爱德华氏菌的种特异性片段,不能扩增出迟缓爱德华氏菌、鲇鱼爱德华氏菌、杀鱼爱德华氏菌的种特异性片段,表明AS15属类杀鱼爱德华氏菌成员。分析了AS15的菌毛基因、sodB等毒力基因,发现AS15具有fimA、fimB、fimC、fimD等4种菌毛基因和sodB、citC、esrB、mukF、katB等毒力基因。本实验首次从黑棘鲷上检出致病性类杀鱼爱德华氏菌,该菌对黑棘鲷的发病机制和毒力机理还需进一步研究。     

斑点叉尾■的细菌病及其防控方法(一)

正一、斑点叉尾鮰肠道败血症(爱德华氏菌病,Enteric septicaemia of catfish,ESC)该病是由鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)引起的细菌性疾病,于1976年在美国阿拉巴马州和佐治亚州的斑点叉尾中被发现。1.病原病原是鮰爱德华菌,属于肠杆菌科,是一种非条件性致病菌。从宿主范围、致病性、血清学特性和质粒构型来看,鮰爱德华菌至少可分为两种类型。但是,从患病斑点叉尾鮰分离到的鮰爱德华菌     

迟钝爱德华氏菌对杂交东方鲀rags基因表达的影响

利用实时荧光定量PCR技术检测冀研一号(菊黄东方鲀♀×红鳍东方鲀♂)稚鱼肝胰脏、脾脏、头肾中重组激活基因rags在腹腔注射迟钝爱德华氏菌后6、12、24、36、48、72h内相对表达量的变化情况。试验结果显示,感染迟钝爱德华氏菌后,肝胰脏中rags基因表达呈下降趋势,相对表达量峰值出现在攻毒后6h。脾脏和头肾中rags基因表达均呈先升后降趋势,但在攻毒后48h出现反弹回升。脾脏中,rags基因相对表达量峰值出现在攻毒后6h;头肾中,rag1基因和rag2基因相对表达量峰值分别出现在攻毒后48h和6h。与对照组相比,腹腔注射迟钝爱德华氏菌能引起冀研一号东方鲀rags基因表达上调,且rag1基因和rag2基因表达趋势基本一致。     

鮰爱德华氏菌灭活疫苗免疫斑点叉尾鮰后外周血免疫指标的变化

在水温(25±1)℃下,给平均体质量(80±5)g的斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus腹腔注射福尔马林灭活的鮰爱德华氏菌(Formalin-killed Edwardsiella ictaluri,FKE)后,第2、4、6、8、14、21,和28d测定外周血液免疫指标,并在免疫后第28天进行攻毒试验。结果显示:注射鮰爱德华氏菌灭活菌苗后,斑点叉尾鮰外周血红细胞和白细胞数量显著升高,白细胞分类组成变化显著,吞噬细胞的吞噬活性与凝集抗体效价显著上升。第4d免疫组红细胞和白细胞达峰值2.52×106/μL和4.67×105/μL,极显著高于对照组(P<0.01);单核细胞、中性粒细胞、吞噬细胞分类百分比和吞噬指数均在第4d达到峰值,分别为22.3%、5.67%、39.3%和4.33,极显著高于对照组(P<0.01);淋巴细胞分类百分比、凝集抗体效价在第21d达到峰值,分别为54.33%和1:341.33,极显著高于对照组(P<0.01)。攻毒试验结果表明:免疫组相对免疫保护率为64.3%。福尔马林灭活的鮰爱德华氏菌免疫后,斑点叉尾鮰获得较强的抗鮰爱德华氏菌感染保护能力,为进一步研究斑点叉尾鮰肠道败血症的免疫奠定基础。     

抗黄颡鱼“红头病”功能性蛋粉的制备及其应用

为了评价抗爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)的特异性Ig Y的功能性蛋粉在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)"红头病"预防及治疗中的应用效果,采用灭活的爱德华氏菌(菌种保藏号:CCTCCNO:M2012024)免疫蛋鸡,通过微包膜及高速离心喷雾干燥技术制备抗爱德华氏菌的特异性Ig Y的功能性蛋粉,采用泼洒和口服两种方式检测该功能性蛋粉对黄颡鱼的免疫保护率。结果显示,所制备的功能性蛋粉抗体效价达到1∶5120;以剂量为2 mg/L功能性蛋粉连续泼洒水体3 d或以饲料重量0.2%的剂量口服14 d后,再用浓度为2.0×107CFU/m L的致病性爱德华氏菌对健康黄颡鱼进行攻毒,泼洒和口服功能性蛋粉对黄颡鱼的免疫保护率分别为85.5%和70.0%;对人工感染爱德华氏菌后患病的黄颡鱼养殖水体连续泼洒5 d或投喂14 d功能性蛋粉,其对黄颡鱼的免疫保护率分别为67.2%和40.7%,表明制备的功能性蛋粉对黄颡鱼"红头病"有很好的预防和治疗效果。     

洛美沙星治疗斑点叉尾鮰肠道败血症的初步研究

采用试管稀释法对鮰爱德华氏菌进行体外抑菌试验,测定其最小抑菌浓度(MIC);采用腹腔注射,进行急性毒性试验,检测洛美沙星对斑点叉尾鮰的毒性作用;结合体外抑菌试验和急性毒性试验的结果,配制一定浓度的洛美沙星,对人工感染鮰爱德华氏菌的斑点叉尾鮰进行浸泡治疗,检测该药对斑点叉尾鮰肠道败血症的治疗效果。试验结果表明:洛美沙星对体外鮰爱德华氏菌的M IC为7.57×10-5mg/mL,对斑点叉尾鮰未表现出明显的毒性作用,其对由鮰爱德华氏菌引起的肠道败血症的最佳浸泡治疗浓度约为1.14×10-3mg/mL。     

基于荧光定量PCR的鳜传染性脾肾坏死病毒滴度检测方法

针对传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的ORF007基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立了ISKNV的实时荧光定量PCR方法。采用CPE法对连续10倍稀释的ISKNV培养液的滴度进行了测定,同时采用荧光定量PCR法测定病毒拷贝数。结果显示,荧光定量PCR测定的病毒拷贝数与CPE法测定的病毒滴度具有良好的线性关系,其线性方程为y=1.076x+0.545(R2=0.998 6),其中y为基因组拷贝数浓度的对数,x为病毒滴度TCID50的对数。研究表明,荧光定量PCR法可替代CPE法应用于ISKNV疫苗抗原的定量,大大缩短了疫苗制备的时间,为疫苗生产提供了方便。     

鲖爱德华菌口服疫苗对斑点鲖的免疫效果

为评价鲖爱德华菌口服微球疫苗对斑点鲖的免疫效果,实验以天然高分子聚合物海藻酸钠和鲖爱德华菌灭活疫苗为材料,制备鲖爱德华菌口服微球疫苗。将实验动物随机分为鲖爱德华菌微球疫苗组、鲖爱德华菌灭活疫苗组、空微球组和对照组,以拌料口服方式进行免疫,通过检测血清中溶菌酶活力、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、补体替代途径(ACH50)活性等非特异性免疫指标,抗体效价以及相对免疫保护率评价疫苗免疫效果,采用荧光定量PCR检测口服疫苗对斑点鲖免疫相关基因表达量的影响。结果显示,鲖爱德华菌口服微球疫苗能够较长时间增强斑点鲖非特异性免疫功能;血清凝集效价于第5周达到峰值,为1∶16,免疫后第7周仍可检测到特异性抗体;口服鲖爱德华菌微球疫苗的斑点鲖获得的抗鲖爱德华菌相对免疫保护率为60.7%,远高于灭活疫苗组(14.3%)及空微球组(10.7%);荧光定量分析结果显示,攻毒后48 h相比攻毒前各免疫基因表达量均有上调,鲖爱德华菌微球疫苗对受免鱼肾脏、脾脏中免疫基因的表达影响尤为明显。结果表明,鲖爱德华菌口服微球疫苗能增强斑点鲖非特异性免疫功能,对鲖爱德华菌病起到一定的预防作用。     

牙鲆NOD2基因的表达分析及在抗迟缓爱德华氏菌感染过程中的功能

本研究利用实验室已建牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库预测得到牙鲆NOD2基因(PoNOD2),并利用PCR技术进行序列验证。同时,设计迟缓爱德华氏菌注射感染牙鲆成鱼和体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验,探究PoNOD2基因在抗菌免疫反应中的作用。PoNOD2基因的开放阅读框长度为2964 bp,编码988个氨基酸。PoNOD2蛋白有3种保守结构域,包括C-末端LRR,中心NACHT和N-末端CARD结构域。实时荧光定量PCR结果显示,在所检测牙鲆组织中,迟缓爱德华氏菌的侵染能显著上调PoNOD2的表达。体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验显示,在PGN、PolyⅠ:C和迟缓爱德华氏菌刺激下,PoNOD2表达上调。亚细胞定位显示,PoNOD2蛋白定位于牙鲆鳃细胞的细胞质中。在迟缓爱德华氏菌侵染牙鲆鳃细胞过程中,PoNOD2基因的过表达能够抑制细菌生长,并引起IL-1β、IL-6和IL-8等炎性细胞因子的表达上调。结果表明,PoNOD2在抑制迟缓爱德华氏菌生长以及调节牙鲆对病原菌的免疫应答中发挥重要作用。     

迟钝爱德华菌环介导等温扩增检测方法研究

为了建立一套用于实验室及室外现场检测迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda, Et)的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，以迟钝爱德华菌的毒力基因fimA为靶基因设计特异性引物，以基因组DNA为模板，进行环介导恒温扩增，并对其特异性、灵敏性和临床检测进行了试验。结果显示，迟钝爱德华菌阳性样本反应呈现为荧光绿色，阴性样本不变色。该LAMP方法的最适反应温度为63℃；特异性试验表明仅迟钝爱德华菌样本发生反应，而杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温气单胞菌和豚鼠气单胞菌均不发生反应；敏感性试验表明，该LAMP方法可检出浓度为2.16×10^-5mg/L的迟钝爱德华菌的核酸。     

半滑舌鳎线粒体 DNA 含量测定方法的建立与优化

本研究旨在应用实时荧光定量PCR技术,建立半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)线粒体DNA(mtDNA)含量测定方法并进行优化.通过质粒标准品的线性化处理、模板DNA的酶切和超声处理、mtDNA和核DNA(nDNA)基因引物的筛选实验,建立半滑舌鳎mtDNA含量测定方法.结果表明,质粒标准品的构象对荧光定量PCR标准曲线影响较大,线性化的质粒更适合用作标准品;酚-氯仿方法提取的模板DNA适用于mtDNA含量测定,无需进行预处理;用D-loop和ND1这2对引物所得的拷贝数较小且结果一致,适用于mtDNA拷贝数的测定;以不同核基因为参照所得的mtDNA含量可能存在差异,当以单拷贝核基因ENC1和MYH6为参照时,可以计算出单个细胞中mtDNA含量,若以多拷贝基因GAPDH为参照,mtDNA含量测定值则较小.采用本方法分别对半滑舌鳎肝、肾、脾和肌肉组织的mtDNA含量进行重复性检测实验,结果表明,相同组织的mtDNA含量显示出良好的重复性(P＞0.05),而不同组织中mtDNA含量具有差异性,可见该方法稳定可靠,能为海洋鱼类mtDNA含量检测提供借鉴.     

基于单链DNA浓度法的哈维氏弧菌核酸适配体亲和特异性研究

本研究采用核酸适配体的单链DNA浓度来表征其亲和力,通过测定核酸适配体与靶细菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)结合后ssDNA的浓度,来研究该核酸适配体的亲和特异性和亲和常数,并通过荧光显微镜法对其亲和特异性进行验证。结果显示,采用单链DNA浓度法测得该核酸适配体对靶细菌哈维氏弧菌的亲和力是非目标菌的15.2倍以上;荧光显微镜直接观察发现只有靶细菌能较好结合有荧光标记的核酸适配体,并呈现明显荧光;荧光阻断法发现靶细菌和非靶细菌都未呈现明显荧光,证明了该适配体有较好的亲和特异性,也进一步验证了单链DNA法的测定结果。在亲和常数的测定方面,利用单链DNA浓度法测得该核酸适配体的亲和常数K_d=(33.70±7.83) nmol/L,相应的拟合系数为R~2=0.960,有较好的准确性和可靠性,说明采用单链DNA浓度法来测定适配体的亲和力和亲和常数是可行的。