中国对虾生物量评估的环境DNA检测技术 的建立及优化

近年来，环境DNA(Environmental DNA, eDNA)技术作为一种新的水生生物调查方法发展迅速，在水生生态系统的研究领域被广泛应用到物种检测、生物多样性评价、生物量评估等方面。然而，很少有研究专门评价eDNA技术操作流程中不同的eDNA富集方法与提取方法对研究结果的影响，从而针对具体研究对象建立一套最佳的eDNA技术操作流程。此外，由于物种间生活习性的差异，不同物种释放到环境中的DNA量及DNA片段大小不同，因而，针对不同研究对象需采用不同的eDNA富集与提取方法。本研究以中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)为研究对象，采用滤膜法富集eDNA，结合血液与组织DNA提取试剂盒提取eDNA。选取直径为47 mm的玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、聚碳酸酯膜、尼龙膜共4种材质的滤膜，每种滤膜根据其孔径大小设置0.45、0.8、1.2、5 μm共4个梯度，取样水量设置500 ml、1 L、2 L共3个梯度。结果显示，滤膜材质、滤膜孔径大小及取样水体体积均对中国对虾的定性与定量分析具有一定的影响，其中，0.45 μm的玻璃纤维滤膜过滤2 L水样能够检测到的DNA拷贝数最多，并依据此建立了一套中国对虾eDNA技术的操作流程，提高了中国对虾的检出率，为后续中国对虾的分布监测及生物量评估提供了基础。     

环境DNA技术在水域环境中的应用进展

简述了环境DNA发展进程,介绍了环境DNA应用领域,包括物种及物种多样性研究、生物量评估、珍稀物种和入侵物种监测。归纳了环境DNA研究方法,样品的采集与保存、eDNA捕获、提取、分析。指出了eDNA技术的优势和存在的问题。提出,在今后的环境DNA研究中,一方面要大力发展并推广eDNA技术;另一方面应尽快制定一个统一的eDNA监测方法标准化框架,将eDNA技术和传统调查方法相结合,才能更好地对水生生物进行监测,在水生生态文明建设中发挥更为重要的作用。     

人工模拟条件下环境DNA宏条形码技术的定量分析初探

近年来,环境DNA宏条形码技术(eDNA metabarcoding)在水生生态系统生物多样性评估等相关领域中得到广泛应用,因其具有快速测算群落中物种丰度的潜能,eDNA宏条形码技术成为资源保护和管理中颇具应用前景的调查工具。虽然大量证据表明eDNA高通量测序获得的reads数与自然环境中生物相对数量具有相关性,但一直不能得到明确的量化关系结果。eDNA的富集、扩增过程中的偏倚等诸多不确定因素,制约了该技术在生物资源调查领域的推广应用。假定水体中的eDNA全部回收,且PCR扩增时不存在引物偏倚性,这种理想状态下的水体中eDNA组成与其高通量测序reads数是否存在线性关系？为此,本研究在实验室可控条件下,选择2个同属近缘的凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)和墨吉对虾(Penaeus merguiensis),对其DNA样品进行不同比例混合,模拟从自然水体中富集到的eDNA复合样品,既保证了样品的回收率,又降低了引物偏倚的干扰。以此为模板,探究eDNA宏条形码技术检测种群相对数量的准确性。结果显示,当2个物种DNA模板浓度比例为1∶1时,高通量测序结果注释得到的2个物种reads数比值为13/24(墨吉对虾/凡纳滨对虾),可见,即使是同属近缘种间依然存在轻微的引物偏倚现象,引物偏移率为1.5%。同时,根据7个实验组获得的高通量测序结果注释得到的2个物种reads数比值与对应模板中2个物种DNA浓度比值之间的线性回归分析表明,水体中eDNA组成与其高通量测序reads数间呈明显线性关系,即y=0.0716x+0.7043 (r²=0.9824)。综上所述,本研究为验证eDNA宏条形码技术监测水生生物资源量的可行性提供了直接证据,也为后续DNA宏条形码技术的定量研究提供了思路。     

黄海中国对虾环境DNA(eDNA)的垂直分布规律及其影响因素初探

准确掌握物种分布和种群动态是渔业资源评估的基础。然而，对某些种群规模小或生活史复杂的物种进行监测的难度很大。近年来，环境DNA技术快速兴起，已被广泛应用于各类物种监测、生物多样性评估和生物量评价等领域。为了解冬季中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)越冬洄游过程中的分布情况，2019年12月在黄海中南部采集表、中、底3个水层水样，检测其中中国对虾的eDNA，并对表层沉积物进行室内实验。结果显示，中国对虾eDNA在自然水体中呈现特殊的垂直分布规律：底层浓度高，表层浓度低，这一规律与中国对虾生活习性相关；表层沉积物会在外力作用下再悬浮，并向周围释放eDNA，对水体造成较大程度影响，本研究将采集到的表层沉积物分为3个实验组，3个实验组最大释放量分别为1624.06、3453.34和1143.24 copies/L，沉积物对水体的影响持续1周左右。     

环境DNA在长江江豚监测中的应用

为了从水体环境中提取到高质量的eDNA环境DNA(environmentalDNA,eDNA),应用于长江中长江江豚(Neophocaenaphocaenoidesasaeorientalis)的分布调查,本研究比较了滤膜孔径和水样保存方式对eDNA获取的影响,同时对比了eDNA技术与传统调查法对长江江豚的检测结果。结果显示水样抽滤时间与滤膜孔径大小呈负相关关系,且都可以检出目标生物;水样采集后需在6 h内完成抽滤处理,或在冷藏条件下短期保存48 h;长江流域江苏段中观测到长江江豚出现的8个检测点均检测出长江江豚eDNA,而在10个未观测到长江江豚的水域中有3个检测出其eDNA。研究结果表明,相比传统目视监测方法, eDNA技术在长江江豚监测中不仅具有较高的准确性,还具有更高的灵敏性,可作为长江江豚种群调查的有效辅助检测工具。     

环境DNA在水生生态系统生物量评估中的研究进展

环境DNA (Environment DNA, eDNA)技术因其无创、高效、经济、灵敏等特点在水生生态系统生物评价中愈来愈引起人们的重视。文章围绕eDNA技术的内容、应用现状和面临的挑战3个方面,系统综述了该技术在实验室环境和野外环境水生生态系统生物量评估中的应用进展,探讨其优劣势、生态过程、评估错误等内容,展望了该技术在水生生物量评估领域的应用前景,以期为eDNA技术的相关应用研究提供参考。     

环境DNA(eDNA)技术在水生生态系统中的应用研究进展

环境DNA(Environmental DNA,eDNA)是指从皮肤、黏液、唾液、精子、分泌物、卵、粪便、尿液、血液、根、叶、果实、花粉和腐烂体等释放出来的、普遍存在的、游离的DNA分子。环境DNA技术是指从环境样品(土壤、沉积物和水体等)中直接提取DNA片段后利用测序技术进行定性或定量分析的方法。近年来随着分子生物学的发展,环境DNA技术已经成为一种新的水生生物调查方法,其主要被用来进行生物入侵的防治、濒危物种的保护、生物多样性的评价以及生物量的评估等。作者综述了环境DNA技术的发展历程、操作流程、在水生生态系统中的应用、优势以及存在的问题,同时对环境DNA在生态学领域中的应用前景进行了展望。     

环境DNA在水体中存留时间的检测研究——以中国对虾为例

精确地掌握物种的分布与种群动态是保护生物学的基础。然而，对于某些具有特殊生活史的物种以及群体数量非常少的种群而言，物种分布检测极其困难。DNA条形码技术与环境DNA(Environmental DNA, eDNA)的结合使以上困难得以解决。鉴于eDNA易降解、在环境中含量低的特性，探究其在环境中的持续存留时间对于后续准确进行定性与定量分析至关重要。本研究以中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)为研究对象，结合实时荧光定量PCR定量分析了水环境中eDNA随时间的降解情况，基于赤池信息准则(Akaike Information Criterion, AIC)，选择了最适于eDNA随时间降解的统计模型。结果显示，当eDNA的释放源头被去除后，eDNA在水体中的含量与时间呈负相关关系，其在环境中的存留时间为30 d左右。本研究旨在为合理规划物种的定性检测与定量评估提供理论依据，以期将人为因素造成的实验误差降到最低。     

环境DNA技术及在鱼类监测中的应用

随着人类活动的影响,鱼类资源正在急剧下降,开展鱼类监测对于鱼类多样性的保护具有非常重要的意义。传统的鱼类监测方法因具有破坏性、调查者也要专业形态学知识、调查工作量大等弊端,故亟需一种新的技术方法进行辅助补充。环境DNA （eDNA）技术的发展使得鱼类调查更加的省时省力、节约成本、无损伤,目前在鱼类的监测中广泛使用,然而eDNA技术也存在着一定的缺陷所以不能完全取代传统方法。eDNA技术包含了样品的采集及处理、eDNA提取、eDNA扩增、测序和生物信息学分析几个主要步骤,在整个流程中每一个步骤都非常必要,对单个步骤又有不同的实验方案,选择不同对鱼类eDNA的检测效率也会产生重要的影响。目前国外对于eDNA技术应用于鱼类监测所研究的问题较为丰富而全面,如生物多样性监测、入侵物种检测、濒危物种检测和生物量的估算等,虽然国内的起步不晚,但国内对此研究方向较为单一,需要进一步重视。     

蛋白质水解物的超过滤分馏

为浓缩富集低分子量抗氧化肽（2kDa）鱼肉蛋白水解物（绿青鳕，Pollachius virens），测试了不同材质和截留分子量的五种有机管式纳滤膜。为限制浓差极化效应，研究了在低污染状况下膜的材质和截留分子量（MWCO）对渗透通量、水解吸附程度、膜的清洁和多肽保留时间的影响。水渗透通量显现出对MWCO和膜的材质都敏感。高疏水性材质的聚醚砜膜（PES）表现出比改进的聚醚砜（m—PES）膜和聚砜（PS）膜更低的透水通量。     

环境DNA分析技术—一种水生生物调查新方法

掌握珍稀濒危和外来入侵物种的分布状况对于物种保护和管理十分重要。环境DNA(Environmental DNA)分析通过收集、分离和分析环境样品中的DNA来检测物种是否存在,是一种低耗、高效、高灵敏度的无损伤性物种监测新技术(e DNA)。本文综述了环境DNA技术的发展、分析方案、优势及存在的问题,主要综述了该方法在外来入侵物种足迹追踪、濒危珍稀水生生物资源调查和物种多样性分析中的研究现状,并对环境DNA分析技术在生物多样性保护研究中的应用前景进行了展望。     

环境DNA在水域生态中的研究进展

环境DNA(environmental DNA,eDNA)是指生物通过皮肤脱落、唾液、配子、粪便以及分泌物等方式向环境中释放的游离DNA。环境DNA具有敏感性、准确性以及容易操作等诸多优势,更能实时地反映物种多样性以及生物量等,近两三年受到了世界各地学者们的大量关注。水域环境高度复杂,环境DNA在水域生态领域具有重要的应用价值。本文主要从环境DNA在水域生态的应用以及研究方法方面对环境DNA的研究做一小结,同时介绍环境DNA在其他生境的应用,以期为水域生态的研究提供参考。     

大型河流中鱼类组成的eDNA监测效率:以长江武汉江段为例

为了探讨大型河流中的 eDNA 监测效率, 以长江为大型河流的代表, 以鱼类为水生生物的代表, 分析传统捕捞监测和 eDNA 监测结果的差异, 研究 eDNA 监测技术对长江武汉江段鱼类组成的监测能力、监测效率、平行样设置等问题。结果显示: (1) 用 1 对 eDNA 宏条形码引物(mlCOIintF/jgHCO2198R)共监测到 89 种鱼类, 其中 30 种可与历史捕捞调查记录互相确认, 另外 59 种需要更完善的条形码数据库来解决序列比对注释问题; (2) 9 月在武汉监测断面, 可用单引物(mlCOIintF/jgHCO2198R) eDNA 监测到的物种最优估计约 99 种, 单样品 eDNA 监测的鱼类物种检出能力约为 26 种, 检出效率约为 25.8%; (3) 在 80%的检出度目标下, 需要约 10 个平行样, 在 95%的检出度目标下, 需要约 17 个平行样。本研究在长江武汉江段鱼类 eDNA 监测效率和平行样设置的相关量化结果可为长江其他断面及其他大型河流的 eDNA 监测提供量化参考。同时, 本研究表明, 更完善的 DNA 宏条形码数据库和合适的平行样设置是未来 eDNA 监测作为常规监测手段进行运用的前提。     

环境DNA技术在湖泊生物资源调查中的应用进展

简述了环境DNA(eDNA)技术的研究背景以及在湖泊生物资源研究中的应用.指出,eDNA方法操作简单、特异性强、灵敏度高,还能对入侵种和引进种及时监测,不仅拓展了生物资源调查方式,还能弥补传统方法的不足.提出,虽然eDNA技术有其独特的优势,但同时该项技术还存在着一些不足,今后对于特定水域利用eDNA技术进行物种调查的...     

基于环境DNA的岩原鲤检测及生物量评估

为建立岩原鲤基于环境DNA （eDNA）的实时荧光定量PCR （qPCR）检测方法,准确鉴别岩原鲤并探讨e DNA浓度与其生物量的定量关系,实验根据岩原鲤mtDNA中12S rRNA基因序列设计eDNA引物和TaqMan探针,利用PCR扩增出岩原鲤12S rRNA基因的序列,克隆入pMD19-T载体,构建重组质粒作为qPCR标准;使用梯度稀释质粒标准品作为模板,进行qPCR扩增,制作标准曲线,建立岩原鲤qPCR检测方法,并评价其特异性、灵敏性和应用效果。结果显示,引物和TaqMan探针对供试的岩原鲤样品出现荧光增长曲线,显示阳性扩增,而其他鱼类和空白对照均未得到扩增信号,表现为阴性;qPCR的阈值循环数（C_t）与标准品拷贝数的线性关系好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数（R²）达到0.999,检测限位DNA浓度为5×10^-6 ng/μL,扩增效率为94.7%;检测养殖不同数量岩原鲤的水体中eDNA浓度,目标DNA浓度和岩原鲤数量存在线性正相关性（R²=0.957）,得到岩原鲤DNA浓度与其个体数...     

基于线粒体COⅠ的DNA条形码在对虾科种类鉴定中的研究

对虾科包含有26个属,约有200多种对虾,由于同属内的对虾在形态上非常相似,只呈现细微的差别,因此使得只基于形态学对对虾科物种的鉴别非常困难。为确定DNA条形码技术在对虾科物种鉴别的可行性,本研究中,采用线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因研究了32种对虾的核苷酸组成、对虾种间及种内遗传距离,用邻接法构建32种对虾COⅠ基因序列系统发生树。结果显示,对虾COⅠ基因组成偏倚明显,A+T含量(61.5%)显著高于G+C(38.5%)。基于Kimura双参数模型计算,32个物种的种内平均遗传距离为0.003,种间平均遗传距离(0.468)是种内遗传距离的156倍,符合Hebert提出的种间遗传距离大于或等于10倍种内遗传距离的标准。在系统进化树中,32种对虾中有30种对虾都以较高的置信度聚合成独立的分支。可见,线粒体COⅠ基因作为对虾科DNA条形码在物种的鉴别上具有很好的应用性,可以作为形态学分类系统的必要补充和佐证。     

基于线粒体COI的DNA条形码在对虾科种类鉴定中的研究

对虾科(Penaeidae)包含有26个属,约有200多种对虾,由于同属内的对虾在形态上非常相似,只呈现细微的差别,因此使得只基于形态学对对虾科物种的鉴别非常困难。为确定DNA条形码技术在对虾科物种鉴别的可行性,在本研究中,我们采用线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(COI)基因研究了32种对虾的核苷酸组成、对虾种间及种内遗传距离,用邻接法(Neighbor-joining)构建32种对虾COI基因序列系统发生树。结果表明,对虾COI基因组成偏倚明显,A+T含量(61.5%)显著高于G+C(38.5%)。基于Kimura双参数模型计算,32个物种的种内平均遗传距离为0.003,种间平均遗传距离(0.468)是种内遗传距离的156倍,符合Hebert提出的种间遗传距离大于或等于10倍种内遗传距离的标准。在系统进化树中,32种对虾中有30种对虾都以较高的置信度聚合成独立的分支。可见,线粒体COI基因作为对虾科DNA条形码在物种的鉴别上具有很好的应用性,可以作为形态学分类系统的必要补充和佐证。     

溶解碳源与固体碳源对对虾生物絮团养殖系统的影响

为探讨溶解碳源与固体碳源在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生物絮团养殖过程中的影响，设置5个不同碳源搭配组、花生壳粉组、红糖组、花生壳粉∶红糖(1∶1)组、花生壳粉∶红糖(2∶1)组以及花生壳粉∶红糖(1∶2)组，分别进行为期40 d的南美白对虾养殖试验，每4 d进行一次水质监测，试验结束时对对虾肝胰腺取样进行谷胱甘肽-S转移酶活性测定并且将抽滤滤膜进行高通量测序分析，探究不同类型碳源且不同搭配比例对生物絮团养殖系统内水质、对虾生长性能、微生物多样性及其群落结构的作用。结果显示：在水质调控方面，花生壳粉∶红糖(2∶1)组的氨氮在整个试验周期始终维持在较低水平，氨氮峰值仅为(2.43±0.45)mg/L,而氨氮峰值最大的花生壳粉组高达(9.80±0.35)mg/L;亚硝酸盐氮在对照组中呈上升趋势，在生物絮团组浓度呈先上升后下降趋势，花生壳粉∶红糖(2∶1)组的浓度变化拐点要比其他处理组提前；在硝酸盐氮水平，除对照组外其余生物絮团组都呈上升趋势，花生壳粉∶红糖(2∶1)组在试验结束时硝酸盐氮质量浓度高达(17.84±1.20)mg/L;在微生物群落分析中，副球菌属是属...     

罗氏沼虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因的克隆及分析

根据已公布的罗氏沼虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因序列设计一对特异性引物,从疑似患白斑病毒病的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中提取总DNA,并以此为模板,经PCR扩增、克隆并测序后将该片段通过GenBank比对,证实为WSSV的VP28基因;与20个已公布的WSSV VP28进行同源性比较,结果显示:从中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、日本对虾、波纹龙虾提取的病毒株聚为一类,印度对虾WSSV VP28为另一类,罗氏沼虾WSSV VP28又单独为一类。根据测序结果推测VP28蛋白的二级结构在氨基酸的7～29区间可能为跨膜螺旋区,且该区域高度保守。     

显微介导的远缘基因渐渗技术在鲤育种中的应用

以中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)为外源DNA供体,运用显微介导的远缘杂交技术,将中国明对虾总DNA直接导人鲤(Cyprinus carpio L.)受精卵内,创建鲤外源DNA导人系,并利用AFLP分子标记技术和肌肉营养成分分析,对显微介导中国明对虾基因鲤进行外源DNA检测与蛋白质和氨基酸含量进行测定,结果表明:(1)在30对AFLP引物中,有8对所扩增带,其显微介导中国明对虾基因鲤亲本和子代中都有和中国明对虾基因相同而对照鲤没有的带.说明受体鱼中,肯定有一段序列与目的基因序列一致,研究证明了亲缘关系甚远的异源DNA片段的超远缘杂交的可行性.(2)导人中国明对虾总DNA片段的显微介导中国明对虾基因鲤的蛋白质含量分别为18.37%,18.47%,17.99%,均高于对照组(17.06%);而氨基酸的总量分别为17.16%,17.56%,16.92%,也高于对照组((16.13%),其中天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等4种鲜味氨基酸含量明显超过对照组,经数理统计分析,均有显著差异(P<0.05).说明直接导人中国明对虾总DNA对显微介导中国明对虾基因鲤的营养成分和氨基酸含量均产生影响,这可对鲤的品质改进,丰富鲤的遗传基础,为显微介导的超远缘杂交技术的应用提供思路.