脊椎动物源细胞因子对合浦珠母贝外套膜细胞培养及其矿化功能的影响

筛选出能促进合浦珠母贝外套膜细胞培养及矿化功能的细胞因子,以作为优化本物种细胞培养基的参考,挑选三龄合浦珠母贝,获取其外套膜进行原代细胞培养。向各实验组细胞培养基中分别添加表皮生长因子(EGF)、内皮细胞生长添加剂(ECGS)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),通过比较细胞活性、贴壁能力、迁移能力和4种基质蛋白基因(pif80、n16、msi7及accbp)表达水平的变化,来评判这些因子对细胞培养及细胞矿化功能的影响。结果显示:(1)EGF能显著提高原代培养细胞的活性、贴壁能力和迁移能力,并促进pif80、n16和accbp基因的表达;(2)ECGS能增强细胞的贴壁能力和迁移能力,并大幅提高pif80、n16和msi7基因的表达水平;(3)IGF-1能显著增强细胞活性、贴壁能力、迁移能力和msi7的基因表达水平,但对pif80、n16和accbp基因的表达有一定抑制作用;(4)碱性成纤维细胞生长因子能增强细胞的活性及贴壁能力,并显著提升pif80、n16和accbp基因的表达水平。研究表明,脊椎动物源细胞因子具有延长细胞培养时间、增强细胞活性及促进矿化相关基因表达的作用,能够用于优化合浦珠母贝外套膜细胞的培养基。     

合浦珠母贝matrilin-1基因的克隆和表达分析

以合浦珠母贝(Pinctada fucata)转录组中的matrilin-1基因片段为基础,开展了matrilin-1的c DNA全长(Pfmatrilin-1)克隆和定量表达分析。Pfmatrilin-1基因c DNA全长2 036 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 194 bp,编码397个氨基酸,包括1个信号肽序列和2个血管性血友病因子A(von Willebrand factor A,VWA)样结构域。系统进化分析显示无脊椎动物的matrilins与脊椎动物的matrilins进化关系较远。荧光定量PCR表达分析结果显示,Pfmatrilin-1 mRNA在合浦珠母贝各个组织中均有表达,其中在血液中表达量最高(P0.05);Pfmatrilin-1从担轮幼虫期至变态期均有表达,眼点期表达量最高(P0.05),而贝类幼虫发育到眼点期就会开始附着,眼点期幼虫原壳生长停滞,次生壳形成,因此推测其可能与次生壳的形成有关。这些结果表明Pfmatrilin-1在合浦珠母贝生物矿化中发挥重要作用。     

合浦珠母贝骨形态发生蛋白10(BMP10)基因的克隆与表达分析

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)具有成骨活性,在胚胎发育、组织发生、生殖调控等方面也有重要作用,但在贝类中研究还很少。研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)BMP10基因,命名为Pf BMP10。该基因c DNA长1 752 bp,包含开放阅读框(ORF)1 344 bp,编码447个氨基酸。编码蛋白包含一个N端信号肽、一个前结构域和成熟蛋白区。成熟区包含转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)结构域,其中含7个半胱氨酸残基。不同发育时期表达分析显示Pf BMP10高表达于担轮期和变态期,提示其可能参与幼体担轮期、变态期的发育调控。组织表达分析显示其在鳃和外套膜高表达,贝壳缺刻实验显示缺刻处理24h后其在鳃和外套膜中的表达量均显著上升,表明Pf BMP10可能与贝壳形成相关。研究结果可为BMP家族基因功能及贝壳形成机理研究提供参考。     

缢蛏IGFBP基因结构及生长性状相关SNP筛选

类胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)是IGF系统的一部分,主要参与IGF的运输、定位和生物活性调节。本研究采用RACE技术和长PCR技术,克隆了缢蛏IGFBP基因的cDNA和DNA全长序列,应用荧光定量PCR技术分析了缢蛏不同发育时期和不同组织中IGFBP mRNA的表达特征,并进一步筛选了IGFBP基因与生长性状相关的SNP位点。序列分析表明,缢蛏IGFBP cDNA序列全长631 bp,包括5'端非编码区60 bp,3'端非编码区136 bp和开放阅读框435 bp,编码144个氨基酸。该基因含有保守的IGFBP-N端,包含12个半胱氨酸残基,其中1～18个氨基酸为信号肽,属于分泌型蛋白。IGFBP DNA全长3 122 bp,其中包含1个内含子(2 687 bp)和2个外显子(200和235 bp)。荧光定量PCR结果显示,IGFBP mRNA在消化腺组织中表达量最高;在缢蛏的稚贝期,IGFBP mRNA呈现高表达,而在其他发育时期表达量低。在IGFBP基因中筛选到4个SNP位点,其中1个SNP位点与缢蛏的壳长和体质量呈显著相关。     

马氏珠母贝基质金属蛋白酶基因MMP-17的克隆及表达分析

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)是一种能够降解细胞外基质的蛋白水解酶。MMP-17是一种膜型基质金属蛋白酶,通过糖基磷脂酰肌醇连接于细胞表面,参与调控有机体的内环境稳定、宿主防御等多种生理过程。为研究MMP-17在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验运用RACE技术,克隆得到马氏珠母贝MMP-17(Pinctada martensii MMP,Pm-MMP-17)基因cDNA 全长序列,并对其序列特征及功能进行初步分析。结果显示,Pm-MMP-17基因cDNA全长2 794 bp,开放阅读框(ORF)为1 923 bp,编码640个氨基酸,5'UTR长156 bp,3'UTR长715 bp,分子量约为73.11 ku,等电点为8.98;多序列比对和系统进化树分析表明,Pm-MMP-17与其他物种的MMP具有较高的保守性,与长牡蛎的MMP-17相似性高达82%;功能结构域分析表明,Pm-MMP-17有5个高度保守的结构区域:N-末端的信号肽、前导区、催化区、铰链区和C-末端的类血红素结合蛋白区;荧光定量数据分析表明,Pm-MMP-17基因在马氏珠母贝的闭壳肌、珍珠囊、足、外套膜、血淋巴、肝胰腺、性腺、鳃等8个组织中均有表达,在血液中的表达量最高,闭壳肌和鳃次之;脂多糖(LPS)刺激后,Pm-MMP-17基因表达水平上调,12 h后达到最大值,之后又逐渐下调并恢复到正常水平。研究表明,Pm-MMP-17基因可能在马氏珠母贝的免疫反应中起着重要作用。     

合浦珠母贝章鱼胺受体(OAR)基因的克隆与表达分析

章鱼胺受体(octopamine receptor,OAR)广泛存在于无脊椎动物中,具有调节神经肌源性节奏收缩、调节c AMP水平、参与磷酸化途径等多种重要功能,但其在贝类中的研究却很少。该研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)OAR基因(pf OAR)的c DNA全长序列,比较分析了氨基酸序列的同源性,并采用荧光定量PCR技术检测了该基因在不同组织和幼体不同发育阶段的表达差异以及贝壳损伤后该基因在外套膜中表达水平的变化。结果显示:pf OAR的c DNA全长1 890 bp,开放阅读框1 659 bp,编码552个氨基酸,有7个跨膜结构域,具有G蛋白偶联受体的共性。pf OAR在6个被检测的组织中均有表达,且在外套膜中的表达水平显著高于其他组织;幼体发育过程中pf OAR表达水平逐渐升高,变态期的表达水平显著高于其他时期;人为损伤贝壳36 h后,pf OAR的表达水平显著升高。这些结果表明pf OAR在合浦珠母贝中可能具有多样化的功能,参与了贝壳的形成和修复,为进一步开展pf OAR的功能研究奠定了重要基础。     

脊尾白虾EcR基因的克隆及其在卵巢和胚胎发育过程中的表达分析

为了解蜕皮激素受体(EcR)在脊尾白虾卵巢和胚胎发育中的作用,采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾EcR基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KC506600),用实时荧光定量PCR方法分析了EcR基因在雌虾不同组织、卵巢以及胚胎发育不同时期的表达特征。结果显示,脊尾白虾EcR基因全长2 638 bp,开放阅读框1 713 bp,编码570个氨基酸,脊尾白虾EcR在系统进化上与行抱卵繁殖的真虾类和蟹类亲缘关系较近,而与对虾类较远。脊尾白虾EcR基因在各组织中均有表达,但主要在肝胰腺内表达。在脊尾白虾繁殖期内,肝胰腺内EcR的表达量始终高于卵巢,表达量峰值出现在卵巢成熟时期,而卵巢内EcR的表达量在卵巢成熟前期达到最大,两种组织中EcR表达量与卵黄蛋白原(Vg)质量浓度变化趋势相一致。随着胚胎发育,EcR表达量呈先上升后下降趋势,在原肠期达到最大,前溞状幼体期和溞状幼体Ⅰ期的表达量虽有下降,但仍保持较高水平。结果表明,脊尾白虾EcR基因系统进化方向与虾蟹类不同繁殖方式相吻合,其mRNA主要在肝胰腺内表达;卵巢发育过程中,EcR基因参与了肝胰腺和卵巢中Vg合成,其在肝胰腺中表达量变化与性腺发育指数变化趋势一致,对卵巢成熟有重要作用;在胚胎发育过程中,EcR基因参与了胚胎细胞分化及器官形成。     

合浦珠母贝胸腺素β4(thymosin beta4)插核损伤和发育时期的表达研究

胸腺素β4(thymosinβ4)具有抗菌、抑制炎症和促进伤口愈合等作用。该研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)胸腺素β4(Pfthymosinβ4)的基因序列。该基因长261 bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)126 bp,编码42个氨基酸。生物信息学分析发现,胸腺素β4的蛋白理论分子量为4.78 ku;具有典型的"THY"特征模体和胸腺素β家族的特征序列;氨基酸序列保守性很高,与其他物种相似性达90%以上。荧光定量PCR结果表明,Pfthymosinβ4在各组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高,其次是足与鳃。插核手术后取血细胞和伤口组织,Pfthymosinβ4在血细胞和伤口组织的表达量显著升高,第6小时达到最高,推测表达量升高的原因是Pfthymosinβ4促进血细胞向伤口处移动来参与合浦珠母贝伤口的前期修复。在各个发育时期中Pfthymosinβ4均有表达,在变态期的表达量突然升高,推测其可能参与了合浦珠母贝的变态附着过程。     

三角帆蚌EFCB1基因cDNA序列克隆及表达研究

为了发掘更多三角帆蚌具有EF-hand结构域的功能基因及其蛋白质,本研究运用RACE-PCR技术,克隆得到了三角帆蚌包含EF-hand结构域钙结合蛋白1基因(EF-hand calcium-binding domain-containing protein 1,EFCB1)的cDNA全长并进行了生物信息学分析;通过real-time Q-PCR技术,分析了EFCB1基因在三角帆蚌10个组织,以及内脏团、外套膜插核后不同时间点的时空表达特点。结果表明三角帆蚌EFCB1基因cDNA序列全长981 bp,ORF为531 bp,编码176个氨基酸残基,5'-UTR 239 bp和3'-UTR 211 bp。EFCB1分子式为C₈₇₇H₁₃₄₈N₂₃₈O₂₇₀S₁₀,分子量约19.9 ku,等电点为4.70,不稳定系数为62.65,属亲水蛋白。其序列无信号肽序列,存在1个跨膜区域和2个EF-hand结构域,EF-hand模块分别为DLNDDKLISPEE(98-109)和DTNGDDKLDGEE(129-140)。荧光定量结果显示三角帆蚌EFCB1基因在各组织中均有表达,其中在肠和鳃中表达量最高(P<0.05),外套膜中表达量显著高于内脏团(P<0.05)。EFCB1基因在插核后不同时期的外套膜和内脏团育珠部位组织中表达具有显著差异(P<0.05),在外套膜中的表达量均显著高于内脏团(P<0.05),在插核后第20 天时表达量显著高于各时期(P<0.05)。研究表明,EFCB1在三角帆蚌Ca²⁺的吸收过程中发挥调节作用,在珍珠囊形成过程中以及珍珠形成初期具有重要功能。     

泥蚶Smad1/5基因cDNA全全长克隆及时空表达特征分析

为了研究Smad1/5基因在泥蚶生长、发育过程中的调控作用,本文利用SMART RACE方法克隆得到泥蚶Smad1/5基因（Tg-Smad1/5）的cDNA全长序列,该序列全长2 424 bp,开放阅读框有1 386 bp,编码462个氨基酸。Tg-Smad1/5蛋白与合浦珠母贝Smad5、太平洋牡蛎Smad5和大西洋舟螺Smad1的同源性分别达到了92.3%,91.2%和80.4%,与脊椎动物的同源性都在70%以上;该蛋白包含MH1和MH2区两个较为保守的结构域,此结构与高等动物Smad1和Smad5蛋白极为相似,表明该基因在物种进化过程中比较保守。利用qRT-PCR技术,研究了Smad1/5基因在泥蚶6个组织和9个发育时期中的表达情况,结果显示,Tg-Smad1/5基因在泥蚶成贝6个组织中均有表达,而在斧足中的表达量最高,极显著地高于其他组织;在各发育时期中,Tg-Smad1/5表达量随发育进程呈逐渐升高的趋势,在眼点幼虫期达到最高,极显著高于其他时期,而在变态至稚贝时,表达量又极显著地下降。研究结果表明,Tg-Smad1/5具有类似于高等动物的分子结构,并在泥蚶不同组织、不同发育时期表达有所差异,这为进一步研究该基因在贝类中的功能和作用机制奠定了重要基础。     

Effect of nitrite on larval development of giant river prawn Macrobrachium rosenbergii

The effects of ambient nitrite concentrations on larval development of giant river prawn Macrobrachium rosenbergii were evaluated. The trials were conducted in two phases: phase 1, larvae from stages I through VIII and phase 2, larvae from stage VIII until post-larvae. In both phases larvae were kept in water with nitrite (NO₂-N) concentrations of 0, 2, 4, 8 and 16 mg/L. Oxygen consumption was analyzed for larvae in stage II at nitrite concentrations of 0, 4, and 8 mg/L. Survival, weight gain, larval stage index and metamorphosis rate decreased linearly with increasing ambient nitrite concentration. However, there was no significant difference between larvae subjected to 0 and 2 mg/L NO₂-N. In phase 1, there was total mortality at 16 mg/L NO₂-N, while in phase 2 larval development stopped at stage X in this treatment. The oxygen consumption in stage II increased significantly at NO₂-N concentration from 0 to 4 mg/L, but there was no difference between 4 and 8 mg/L NO₂-N. In conclusion, increasing ambient nitrite up to 16 mg/L NO₂-N delays larval development, reduces larval growth rate and causes mortality, whereas no significant effect occurs for levels below 2 mg/L NO₂-N. However, the establishment of a general safe level of nitrite to M. rosenbergii hatchery may be difficult due to the great variability in larvae individual sensitivity.     

三角帆蚌种质资源研究进展

三角帆蚌是我国优良的淡水育珠蚌,具有重要的经济价值。本文从我国三角帆蚌种质资源调查、搜集与保护出发,介绍了三角帆蚌RAPD、SSR及线粒体基因片段等不同分子标记开发状况,重点讨论了这些分子标记分析三角帆蚌遗传多样性的情况。比较了我国五大淡水湖泊三角帆蚌种质及3个优秀种质9个F1后代的生长性能,比较了三角帆蚌雌雄生长差异。简述了三角帆蚌珍珠质形成相关基因、免疫相关基因、贝壳及珍珠颜色相关基因的研究现状。从三角帆蚌与其他蚌类种间杂交、三角帆蚌种内杂交,介绍了培育康乐蚌新品种的过程及三角帆蚌家系选育的进展情况。对今后进一步开展三角帆蚌种质资源研究提出了意见和建议,为三角帆蚌遗传改良提供了基础资料。     

Productivity improvement of Lysmata seticaudata (Risso, 1816) larval rearing protocol through modelling

The Monaco shrimp Lysmata seticaudata (Risso, 1816) is a marine ornamental species whose ecology and biology, as well as its larval culture has previously been addressed. The objective of the study was to predict and improve productivity of this species rearing protocol through modelling. The models developed intend to help aquaculturists to maximize survival to postlarva, decrease larval duration and increase synchronism of metamorphosis and newly metamorphosed postlarvae size by manipulating temperature, diet, first feeding period and stocking density.The models developed allow us to conclude that the L. seticaudata rearing protocol productivity can be improved by raising larvae at a density of 40 larvae L^− 1 and fed newly hatched Artemia nauplii since hatching to zoea V, and with Algamac 2000™ enriched Artemia metanauplii from zoea V to metamorphosis to postlarvae.By providing more productive protocols to aquaculturists, destructive practices and wild collection may be reduced.     

三角帆蚌生长性状和内壳色与所产无核珍珠质量的相关性分析

为了研究供片蚌和育珠蚌对无核珍珠质量的影响,以三角帆蚌紫色选育系F₅为材料,在插植无核珍珠前,测量了供片蚌和育珠蚌的壳长、壳高、壳宽、体质量等生长性状,检测了供片蚌内壳色颜色参数L、a、b、dE。经过18个月育珠,测量了育珠蚌的壳长、壳高、壳宽、体质量,计算其特定生长率,检测了育珠蚌内壳色颜色参数L、a、b、dE,测量了育珠蚌所产无核珍珠的颜色、大小、圆度、光泽和产珠量。结果发现,供片蚌生长性状与所产无核珍珠大小、圆度和产珠量相关性不显著(P>0.05)。供片蚌内壳色与无核珍珠颜色相关性极显著(r=-0.400~0.376,P<0.01),供片蚌dE值越大所产紫色珍珠比例越高、dE值越小所产白色珍珠比例越高。育珠蚌特定生长率与所产无核珍珠大小、光泽和产珠量相关性极显著(r=0.237~0.516,P<0.01),相关程度为体重> 壳长> 壳宽> 壳高,育珠蚌特定生长率与所产无核珍珠圆度相关性极显著(r=-0.284~-0.256,P<0.01),相关程度为壳长>体质量>壳宽>壳高。育珠蚌内壳色与所产无核珍珠颜色、大小、圆度、光泽和产珠量相关性不显著(P>0.05)。综合各性状相关性分析,改良供片蚌内壳色可以改良珍珠颜色,改良育珠蚌的生长性状可以改良珍珠大小、光泽、圆度和产珠量。     

中华绒螯蟹蜕皮激素受体基因（Ers-EcR）的克隆和组织表达分析

蜕皮激素受体(ecdysteroid receptor,EcR)介导调控甲壳动物蜕皮生长、附肢再生等重要生命活动。为了解EcR在人工控制甲壳动物的繁殖和生长中的作用,采用RACE方法结合同源克隆技术,首次从中华绒螯蟹Y-器官中克隆得到蜕皮激素受体基因全长cDNA序列(Ers-EcR,登录号:KF736985),并进行了结构解析和组织表达分析。结果发现,Ers-EcR编码基因全长2 176 bp,开放阅读框为1 638 bp,编码545个氨基酸,具有DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)等典型的核受体超家族结构域,但不具有信号肽结构。其中,DBD含有8个保守的Cys残基,可以形成2个锌指结构(C156-C159-C173-C176、C192-C198-C208-C211),是典型的DBD特征。多重序列比对分析表明,Ers-EcR氨基酸序列与拳手招潮蟹同源性最高,达到91%。荧光定量PCR结果显示成体中华绒螯蟹ErsEcR基因在Y-器官和肌肉组织中表达量最高,在血液、肠道、卵巢、眼柄、心脏和肝胰腺中有一定表达,在鳃、胸神经节和精巢表达量较低。这表明Ers-EcR基因在中华绒螯蟹各组织器官中的表达不具有典型的特异性,提示Ers-EcR基因可能参与体内多种生命活动的调控。     

凡纳滨对虾AP-1基因的克隆和表达特征分析

为了探讨凡纳滨对虾转录因子AP-1在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾AP-1基因(LvAP-1,GenBank注册号:KF999956),利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了该基因在白斑杆状病毒(WSSV)侵染过程中的表达变化特征。结果显示,AP-1基因ORF区全长882 bp,编码293个氨基酸。预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个Jun结构域和1个高度保守的亮氨酸拉链结构域(bZIP),其中Jun结构域在非脊椎动物中保守性不高。组织表达分析表明,该基因在凡纳滨对虾各组织中广泛表达,其中在血细胞中表达量最高。在WSSV感染早期(0.5 hpi),该基因表达没有显著改变,感染后5 h(5 hpi),AP-1基因开始显著上调表达,在人工感染后24 h,该基因的表达量达到最高(P0.01)。研究表明,该基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程,为进一步研究LvAP-1在对虾应答病毒侵染过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

Effect of starvation during late megalopa stage of Mithraculus forceps (Brachyura: Majidae) on larval duration, synchronism of metamorphosis, survival to juvenile, and newly metamorphosed juvenile size

Larval resistance to temporary starvation is considered a key factor for successful development in the wild. Subjecting larvae to temporary starvation during early and/or late development is occasionally used in larviculture to reduce production costs.Mithraculus forceps is a popular species in the marine aquarium industry for their ability to control nuisance algae in aquarium tanks; a larval culture methodology was previously proposed in order to avoid collection from the wild. In an attempt to reduce production/feeding costs of M. forceps larval culture (two zoea stages and a megalopa), larvae (megalopa stage) were starved after 7 and 8 days post-hatch (DPH); starvation treatments were compared with those of the control treatment where larvae were fed continuously. No differences were found in survival to juvenile, metamorphosis synchronism or larval duration between the treatments, which suggest that at least by day 7 DPH, megalopae have already achieved the point-of-reserve-saturation (PRS) and are able to successfully metamorphose to crab stage without feeding (facultative lecithotrophic); newly metamorphosed juveniles are slightly smaller (particularly the ones starved after 7DPH). This flexible way of development might be very advantageous in the wild and might allow the reduction of costs of larval culture in captivity.