凡纳滨对虾信号转导及转录激活因子（Lv-STAT）基因的克隆及表达特征分析

信号传导及转录激活因子（STAT）是生物体内重要信号通路JAK/STAT的关键组分,在机体免疫、生长、发育等方面起到重要作用。本研究从凡纳滨对虾血细胞中克隆获得了STAT基因的全长cDNA序列（Lv-STAT, GenBank accession number: KC779541）,其 ORF区全长2373 bp,编码790 aa,预测的分子量为和等电点分别为90.68 kDa和5.91。利用SMART在线软件分析表明：该基因编码的蛋白主要结构域由STAT_int、STAT-α、STAT-β和SH2 domain四部分组成,但不具有信号肽结构。将Lv-STAT与来源于其它物种的STAT进行氨基酸多序列比对后发现,该基因家族中的关键位点在Lv-STAT中同样保守。系统发生分析结果显示Lv-STAT 与斑节对虾、中国明对虾的STAT亲缘关系最近。在组织表达模式分析基础上进一步研究了该基因应答WSSV感染的表达变化特征,发现在感染后早期（0.5 hpi、1 hpi和3 hpi）,该基因在血细胞和肝胰腺中均呈显著上调表达趋势,上述研究表明该基因在一定程度上参与了南美白对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程。     

凡纳滨对虾AP-1基因的克隆和表达特征分析

为了探讨凡纳滨对虾转录因子AP-1在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾AP-1基因(LvAP-1,GenBank注册号:KF999956),利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了该基因在白斑杆状病毒(WSSV)侵染过程中的表达变化特征。结果显示,AP-1基因ORF区全长882 bp,编码293个氨基酸。预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个Jun结构域和1个高度保守的亮氨酸拉链结构域(bZIP),其中Jun结构域在非脊椎动物中保守性不高。组织表达分析表明,该基因在凡纳滨对虾各组织中广泛表达,其中在血细胞中表达量最高。在WSSV感染早期(0.5 hpi),该基因表达没有显著改变,感染后5 h(5 hpi),AP-1基因开始显著上调表达,在人工感染后24 h,该基因的表达量达到最高(P0.01)。研究表明,该基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程,为进一步研究LvAP-1在对虾应答病毒侵染过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

饲料中添加酵母提取物对凡纳滨对虾免疫相关基因表达及抗菌机能的影响

为了评估饲料中添加酵母提取物对凡纳滨对虾免疫灵敏性和平衡性的相关基因表达的影响,以鱼粉含量为24.5%的基础饲料(对照组)及在基础饲料中添加2.5%酵母提取物的实验饲料,分别饲喂凡纳滨对虾56 d,检测两种饲料投喂的对虾在急性感染溶藻弧菌前后鳃组织Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量变化及感染后的对虾死亡情况。结果表明:摄食添加酵母提取物饲料的凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体mRNA和溶菌酶mRNA表达量均显著高于对照组对虾(P0.05),IMD mRNA表达量与对照组无显著性差异(P0.05)。急性感染溶藻弧菌后,两组对虾鳃组织Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量随感染进程均出现显著变化,Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量峰值出现的时间分别为24、42和36 h,且摄食添加酵母提取物组对虾各基因的表达量峰值分别为对照组峰值的201.06%、481.46%和276.77%,均显著高于对照组对虾(P0.05)。摄食添加酵母提取物饲料组对虾鳃组织中Toll受体和IM D mRNA表达量在感染溶藻弧菌后12和24 h分别出现显著上调,而对照组对虾鳃组织中Toll受体和IMD mRNA表达量分别在感染弧菌后24和42 h才出现显著上调。两组对虾经溶藻弧菌人工急性感染后72 h内的累积死亡率无显著差异(P0.05)。实验表明,饲料中添加酵母提取物上调了溶藻弧菌感染前凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA的表达量,提早了溶藻弧菌感染后对虾Toll受体和IMD mRNA表达量上调时间,且增加了对虾Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量的峰值,在一定程度上提高了凡纳滨对虾免疫相关基因表达的灵敏性。     

饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾抗感染和5种免疫基因表达的影响

为研究饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力和非特异性免疫基因表达水平的影响,以初体质量为(6.95±1.20)g的凡纳滨对虾为研究对象,在室内养殖箱进行3周的养殖实验和2周的副溶血弧菌人工感染实验;其中,对照组每日投喂普通商品饲料,实验组每日投喂在普通商品饲料中添加地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌(1:1)配制成的3组实验饲料,实验饲料中益生菌的终浓度为10⁷ cfu/g。并采用实时荧光定量RT-PCR方法,对保护率最高的地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌实验组进行凡纳滨对虾相关免疫基因表达水平的分析。实验结果表明,在饲料中添加单一益生菌或复合益生菌均可显著提高对虾抗副溶血弧菌感染的能力(P<0.05),且复合益生菌的保护效果更佳,其相对免疫保护率为31.11%。感染副溶血弧菌后,地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌实验组凡纳滨对虾血淋巴中的先天免疫缺陷基因(innate immune deficiency gene,IMD)、对虾素3a分子(penaiedin 3a)、酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)、溶菌酶(Lysozyme,LZM)和甲壳素Crustin的mRNA的相对表达量均显著上调,且分别在18～24 h达到最大值。实验结果提示:饲料中添加芽孢杆菌可有效提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染的能力,这种能力的提高可能是通过增加抗病相关基因的表达量实现的。     

凡纳滨对虾细胞因子信号转导负调控因子 基因(Lv-SOCS)的克隆及特征分析

为了探讨凡纳滨对虾细胞因子信号转导负调控因子(SOCS)在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,本实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾的SOCS基因(Lv-SOCS,GenBank注册号:KJ000426),利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了该基因在白斑杆状病毒(WSSV)侵染过程中的表达变化特征。结果显示,Lv-SOCS的ORF区1 191 bp,编码397个氨基酸,预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个SH2结构域和1个SOCS-box结构域,组织表达分析表明该基因主要在凡纳滨对虾血细胞、肠道和肝胰腺中表达。在WSSV感染后中晚期(6~48 hpi),Lv-SOCS可以被显著诱导,在血细胞中呈明显上调表达趋势,表明该基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程,上述结果为进一步研究Lv-SOCS基因在对虾应答病毒侵染过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

饲料中添加复合芽孢杆菌对凡纳滨对虾抗病毒感染能力及抗病基因表达的影响

自健康凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)分离到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)和短小芽孢杆菌(B. pumilus)，将上述芽孢杆菌以单一和3株复合的方式包裹在基础饲料表面，制成益生菌饲料；每日投喂对虾，3周后进行白斑综合征病毒(WSSV)人工感染。统计实验组和对照组的累积死亡率，测定对虾鳃组织内WSSV拷贝数，分析对虾肠道组织含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶基因(Caspase)和硫氧还原蛋白基因(Trx)的相对表达量。结果显示，感染实验结束时，A组(枯草芽孢杆菌)、B组(地衣芽孢杆菌)、C组(短小芽孢杆菌)和D组(枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌+短小芽孢杆菌复合益生菌)的对虾累积死亡率分别为(73.3±7.0)%、(63.3±5.5)%、(75.0±7.9)%和(50.0±5.3)%，显著低于对照组(PBS组)(100%)；在整个感染阶段，各实验组的病毒拷贝数呈先上升后下降的趋势，但对照组呈现一直上升趋势，且显著高于实验组。抗病基因表达结果显示，WSSV感染后，各组对虾肠道Caspase相对表达量随感染时间的延长呈先上调再下调的趋势，且在18 h各组对虾肠道Caspase表达量达到最大值；益生菌摄取和WSSV感染都能刺激Trx的表达，益生菌的刺激相对平缓，且各实验组对虾肠道Trx相对表达量在WSSV感染后的18 h时陡升到最大值，极显著高于对照组，且以D组的激活能力最强。研究证实，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌均可提高对虾抗WSSV感染能力，复合芽孢杆菌抗病毒能力最突出。对虾抗病力的提高可能与芽孢杆菌减缓了病毒在靶组织的增殖速率、提高了Caspase和Trx基因表达水平相关。     

凡纳滨对虾含溴结构域蛋白基因cDNA序列的克隆和表达特征

含溴结构域蛋白(bromodomain/BRD-containing protein, BCP)是一种高度保守的蛋白,属于含溴结构域和额外终端域(bromodomain and extraterminal, BET)蛋白超家族成员。该蛋白在有丝分裂过程中通过募集不同的染色体修饰蛋白,达到了广泛调控基因复制及转录的作用,其表达水平的变化常与肿瘤及炎症的发生相关联。本研究根据实验室前期转录组结果提示信息,首次获得了凡纳滨对虾2 229 bp的BCP基因cDNA序列(LvBRD, GenBank注册号:MH638256),利用在线软件进行了生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR (qPCR)技术分析了该基因的组织表达特征和其在对虾白斑综合征病毒(WSSV)、苏云金芽孢杆菌以及副溶血性弧菌侵染过程中的表达变化特征。结果显示,LvBRD编码的蛋白质有一个保守的可以参与细胞周期调控过程的溴结构域(bromodomain,BRD);组织表达分析表明该基因主要在凡纳滨对虾血细胞、肝胰腺和鳃组织中表达;在WSSV和病原菌感染后早期(0.5～12 hours past infection,hpi),Lv-BRD的表达可以被显著诱导,在血细胞中呈明显上调的表达趋势,表明该基因在一定程度上参与了对虾体内由病原引发的天然免疫应答反应。上述研究结果为进一步研究Lv-BRD基因在对虾抗病毒免疫及干扰素调控过程中的功能和作用机制奠定了基础。     

凡纳滨对虾ARMC8基因的克隆及表达

为了研究含Armadillo重复蛋白8在凡纳滨对虾抗病感染过程中所起的免疫作用,本实验采用RACE-PCR技术首次克隆得到凡纳滨对虾ARMC8基因(LvARMC8,Gen Bank注册号:KX058562)的c DNA序列全长,并利用在线软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(Rt-PCR)技术对LvARMC8基因在凡纳滨对虾不同组织及感染白斑综合征病毒和副溶血弧菌过程中的表达变化特征进行分析。结果显示,LvARMC8基因全长为2917bp,其中开放阅读框长2046 bp,编码681个氨基酸,5′非编码区长49 bp,3′非编码区长822 bp。预测分析显示LvARMC8编码的蛋白质含有6个ARM结构域。同源性分析发现,LvARMC8基因与内华达古白蚁ARMC8基因的相似度最高,为71%。系统进化分析结果显示,LvARMC8和多种无脊椎动物ARMC8聚为一支,其中与昆虫类动物赤拟谷盗、致倦库蚊和柑橘凤蝶的亲缘关系最近。Rt-PCR分析发现,LvARMC8基因在凡纳滨对虾多个组织中均能检测出,在表皮中表达量最高,眼柄中表达量最低。WSSV感染后12 h,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量显著降低,但48 h后显著升高,72 h达到最高水平。除副溶血弧菌感染后24 h外的时间点,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量均显著升高。研究表明,LvARMC8基因可能参与凡纳滨对虾抗病免疫应答途径。     

白斑综合征病毒感染凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) TRx、LvP38、CAT、POD基因的表达

为比较凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的氧化反应和信号转导相关基因在白斑综合征病毒(WSSV)感染中的变化情况,采用实时荧光定量PCR,分析WSSV感染凡纳滨对虾6、12、24、48、72 h后,鳃和类淋巴组织中硫氧还原蛋白(TRx)、p38信号通路(LvP38)、过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)在mRNA转录水平的变化。结果显示,感染对虾的类淋巴组织中,TRx、LvP38、CAT、POD在72 h时表达量最高,与对照组差异显著(P<0.05);而在鳃组织中,该4种基因在12 h时表达量最高,呈先升高后下降的趋势。推断TRx、LvP38、CAT、POD与WSSV感染密切相关     

白斑综合征病毒感染凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)TRx、LvP38、CAT、POD基因的表达

为比较凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的氧化反应和信号转导相关基因在白斑综合征病毒(WSSV)感染中的变化情况,采用实时荧光定量PCR,分析WSSV感染凡纳滨对虾6、12、24、48、72 h后,鳃和类淋巴组织中硫氧还原蛋白(TRx)、p38信号通路(Lv P38)、过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)在m RNA转录水平的变化。结果显示,感染对虾的类淋巴组织中,TRx、Lv P38、CAT、POD在72 h时表达量最高,与对照组差异显著(P0.05);而在鳃组织中,该4种基因在12 h时表达量最高,呈先升高后下降的趋势。推断TRx、Lv P38、CAT、POD与WSSV感染密切相关。     

凡纳滨对虾LvRab5B蛋白与IHHNV病毒蛋白的互作

为了探究LvRab5B蛋白在凡纳滨对虾抗病毒感染中的作用,实验分别构建了LvRab5B蛋白在昆虫和酵母细胞中的融合表达载体,将不同的载体导入不同的细胞中,利用免疫荧光和酵母双杂交的方法研究了Lv Rab5B蛋白在昆虫细胞中的表达以及Lv Rab5B蛋白与病毒IHHNV之间的互作关系;通过qRT-PCR方法研究了该蛋白在健康对虾不同组织中的表达情况以及凡纳滨对虾分别感染IHHNV和WSSV后不同时间点的相对表达量。结果显示,Lv Rab5B基因融合蛋白能够在昆虫细胞中表达;Lv Rab5B蛋白与IHHNV病毒衣壳蛋白CP无相互作用,而与非结构蛋白NS1相互作用明显,与非结构蛋白NS2作用较弱。qRT-PCR结果显示,LvRab5B基因在凡纳滨对虾心脏、鳃腺、肠道、胃、肝胰脏和肌肉中都表达,在肠道中表达量最高,肝胰脏次之;Lv Rab5B蛋白在凡纳滨对虾机体感染病毒前后的表达情况不同,感染初期表达降低,随后迅速上升,末期下降。研究表明,LvRab5B基因参与凡纳滨对虾抵抗IHHNV和WSSV病毒的先天免疫过程,为进一步研究Lv Rab5B蛋白在对虾机体中的免疫功能及作用机制奠定了基础。     

亚硝态氮胁迫下凡纳滨对虾体内亚硝态氮的积累与能量代谢响应

为探究亚硝态氮胁迫下凡纳滨对虾[体长为(6.8±0.3) cm,体质量为(4.0±0.6) g]体内亚硝态氮的时空分布与能量代谢相关酶活性的响应,实验设置0(对照组)、0.8、4.0和8.0 mmol/L 4个处理组,进行持续96 h的亚硝态氮胁迫实验和12 h的恢复实验。结果显示,凡纳滨对虾死亡率与胁迫浓度呈现显著的正相关性。胁迫6 h内,亚硝态氮在凡纳滨对虾鳃、血淋巴、肠道、肝胰腺和肌肉组织中明显积累,且积累量与胁迫浓度呈现正相关。相同胁迫浓度组,亚硝态氮在对虾鳃中积累最多,肌肉中最少,鳃中的积累量约为肌肉的3倍。Na~+-K~+-ATP酶活性在0.8和4.0 mmol/L组对虾肝胰腺和肌肉中显著升高,而在8.0 mmol/L组的肌肉中显著降低。胁迫各组对虾肝胰腺AMPK活性显著上升,且与胁迫浓度呈现正相关性。恢复期间,除血淋巴(8.0 mmol/L组)外,各组织中亚硝态氮1 h恢复效率均超过50%,且肝胰腺和鳃的恢复效率最高,达到74%以上。血淋巴、鳃、肠道中亚硝态氮恢复到对照组水平的时间最短,均在6 h以内,而水体中亚硝态氮含量显著升高。以上研究表明,胁迫下亚硝态氮会在对虾组织中迅速积累,并引起能量代谢进程的加快;胁迫解除后,积累在体内的亚硝态氮能够迅速排出体外,以减轻毒性影响。本研究结果将为缓解亚硝态氮对养殖对虾毒性效应的研究提供参考。     

凡纳滨对虾肠道内产消化酶益生菌的分离与筛选

为获得具有消化酶活性且安全的益生菌,从凡纳滨对虾肠道中初步分离得到576株细菌,对菌株进行产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力的定性及定量测试,筛选出产酶种类多且产酶能力强的菌株11株。对筛选出的11株菌进行了幼虾浸浴实验、药敏性实验和溶血性实验,以评价其生物安全性。将11株菌的菌悬液添加到凡纳滨对虾幼虾的养殖水体中进行浸浴实验,浸浴结束后用鳗弧菌进行刺激,测定不同浸浴组幼虾相关免疫基因的相对表达量,以确定其对幼虾的保护效果。综合消化酶活性、菌株对幼虾的保护效果及生物安全性,筛选得到4株效果较好的菌株。菌株的16S r DNA分子鉴定结果表明,细菌1号、2号和4号分别与芽孢杆菌(Bacillus sp.PCSAS2-38,GQ284495.1)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus strain N419,JN400121.1)及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis strain EA26.1,KC758847.1)的相似性均为100%,9号菌株与荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus strain PSB-03,FJ866782.1)相似性达到99%,为后续益生菌制剂的开发奠定了前期基础。     

低鱼粉饲料中添加酶解豆粕对凡纳滨对虾生长性能和抗胁迫机能的影响

为研究在养殖过程中降低鱼粉用量的同时保持凡纳滨对虾良好的生长性能和抗逆能力,实验在含10%鱼粉的基础饲料中,分别添加酶解豆粕(PSM) 0%(A)、2.5%(B)、3.5%(C)、4.5%(D)、5.5%(E)制成5组等氮等能饲料,分别投喂初始体质量为(0.45±0.02) g的凡纳滨对虾幼虾8周,检测对虾生长性能及抗胁迫机能。结果显示,8周养殖实验结束后,各实验组对虾的终末体质量为14.65～15.38 g/尾,各组间对虾终末均重、成活率和饲料系数指标均无显著性差异;A组对虾肌肉粗蛋白质含量显著低于其他各实验组;C组、D组和E组对虾肌肉粗脂肪含量显著高于A组;各组间灰分和水分均无显著性差异;D组和E组对虾肝胰腺蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、血清溶菌酶和血清总超氧化物歧化酶活性(T-SOD)均显著高于A组;A组对虾血清丙二醛(MDA)含量显著高于D组和E组。人工急性感染高剂量副溶血性弧菌的胁迫实验中,A组对虾在弧菌感染48和60 h时的累积死亡率均显著高于D组对虾同期的累积死亡率;低剂量副溶血性弧菌人工急性感染后,在凡纳滨对虾鳃组织中检测Toll受体、免疫缺陷(IMD)和溶菌酶3种免疫相关基因的表达量,结果显示,对虾Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量最大峰值分别出现在添加酶解豆粕的C组、B组和D组,峰值出现时刻分别为感染后24、42和24 h。研究表明,含10%鱼粉的饲料中添加0%～5.5%酶解豆粕对凡纳滨对虾的生长性能改善效果不显著,酶解豆粕会显著提高凡纳滨对虾肌肉粗蛋白质含量和粗脂肪含量;显著降低对虾血清丙二醛含量;同时也会显著改变凡纳滨对虾对弧菌的抵抗力及其免疫相关基因的时空表达,酶解豆粕添加量达到4.5%时可使养殖的凡纳滨对虾获得最佳的抗弧菌能力。     

亚硝酸盐氮胁迫对鳙血液生化指标以及组织HSP70 mRNA表达水平的影响

为了探讨亚硝酸盐氮胁迫对鳙[初均重:(180.05±0.092)g]血液生化指标和组织热休克蛋白70基因表达水平的影响,实验选用170尾鳙,暴露于48.634 mg/L亚硝酸盐氮96 h后,进行96 h恢复实验。并在胁迫0、6、12、24、48、72和96 h以及恢复12、24、48、72和96 h时采集样品。结果显示,胁迫6 h后,血清皮质醇含量和谷丙转氨酶活性显著升高;胁迫12 h后,血清中葡萄糖含量显著升高;胁迫24 h后,血清总胆固醇含量开始显著降低;胁迫48 h后,血清总蛋白和甘油三酯含量开始显著降低,三碘甲状腺原氨酸含量和谷草转氨酶活性则显著升高;胁迫72 h后,血清低密度脂蛋白和高密度脂蛋白含量开始显著降低。恢复96 h后,鱼体血清生理指标大多都已恢复至胁迫前水平,而组织热休克蛋白70 mRNA表达水平的差异显示,头肾抗亚硝酸盐氮响应最快,其次为鳃和肠道,而脾脏热休克蛋白70 mRNA表达水平在恢复12 h时显著升高;恢复96 h后,除鳃组织外,肾脏、肠道和脾脏的热休克蛋白70 mRNA表达量均恢复至胁迫前水平。研究表明,亚硝酸盐氮对鳙的蛋白质代谢、脂质代谢和糖代谢均产生影响,并且诱导部分组织热休克蛋白70 mRNA的表达,而鳙对水体中高浓度的亚硝酸盐氮应激6 h即可产生快速应答,并启动防损伤自我保护机制,促进新陈代谢水平,保护机体免受应激损伤。     

日本鳗鲡巨噬细胞移动抑制因子的基因鉴定及表达分析

巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一类进化上古老的多功能细胞因子,广泛分布于细菌、植物和动物中。哺乳动物MIF兼具酶催化活性和趋化作用,在机体炎症反应中具有十分重要的作用。为探究MIF在鱼类免疫系统中的作用,本实验利用PCR技术克隆获得了日本鳗鲡MIF基因(AjMIF)。预测的AjMIF前体肽含MIF特征性的硫醇蛋白氧化还原酶活性基序Cys57-Ala-Leu-Cys60,以及异构酶活性相关的保守氨基酸残基,如Pro2和Cys81等。荧光定量结果显示,AjMIF在日本鳗鲡不同组织中均有表达,且在肝脏中表达量最高,其次为中肾和肠。脂多糖刺激8 h后,头肾、中肾和鳔中AjMIF表达量显著上调;PolyI:C刺激8 h后,鳃、皮肤和肠中AjMIF表达量显著上调。迟缓爱德华氏菌人工感染8 h后,肠和鳃中AjMIF表达量极显著上调;感染16 h后,鳃组织中MIF表达量显著升高;感染24 h后皮肤和鳃中MIF基因表达量显著上调。此外,本研究构建了AjMIF原核表达质粒,在获得重组蛋白的基础上研究了rAjMIF异构酶活性。结果显示,1 nmol重组蛋白在pH 6.2时异构酶活性为2.6 U,而在pH 8.0,酶活性为36.6 U。本研究结果为进一步解析MIF在鱼类免疫系统中的作用奠定了基础。     

香鱼白细胞介素17C基因克隆及鳗利斯顿氏菌侵染后的时空表达

为了解香鱼白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)的序列特征、系统发育及其与鳗利斯顿氏菌侵染的相关性,实验采用RACE-PCR方法扩增出香鱼IL-17C基因c DNA序列,并通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了鳗利斯顿氏菌侵染后香鱼各组织中IL-17C基因的表达变化。结果显示,香鱼IL-17C基因c DNA序列全长1 087 bp,含534 bp的开放阅读框,在3′端非编码区存在7个m RNA不稳定信号(ATTTA)。预测该基因编码177个氨基酸,N端19个氨基酸为信号肽序列,成熟蛋白中含有8个半胱氨酸残基。系统进化树分析显示不同物种的相同IL-17亚型聚为一支,香鱼IL-17C与其他脊椎动物IL-17C聚为一支;同源比对结果显示香鱼IL-17C与虹鳟的IL-17C1和IL-17C2亲缘关系最近,相似性分别为40.72%和33.51%。q RT-PCR检测显示IL-17C基因在健康香鱼的心、肝、脾、头肾、鳃、脑、肌肉和肠等组织中均有表达,鳃和头肾中表达量较高。经鳗利斯顿氏菌侵染后,香鱼肝脏中IL-17C基因表达变化最大,菌侵染8 h时的表达量为对照组的9.17倍;其次为脾,菌侵染4 h时的表达量为对照组的6.69倍。研究表明,香鱼IL-17C基因的表达与病原菌侵染密切相关,可能在免疫功能中具有重要作用。     

中国明对虾caspase2基因克隆及其在抗白斑综合征病毒中的表达分析

采用RACE技术克隆获得中国明对虾caspase2基因cDNA序列全长,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾caspase2基因全长为1517 bp,开放阅读框长924 bp,5'非编码区长78 bp,3'非编码区长515 bp,命名为FcCasp2。推测该基因编码307个氨基酸,预测分子量为34.21 ku,理论等电点为7.62。同源性和系统进化分析发现,FcCasp2基因与凡纳滨对虾caspase2和斑节对虾caspase的相似性分别为88%和80%,与其他节肢动物caspase家族基因聚为一类。荧光定量RT-PCR结果显示,FcCasp2基因在肝胰腺中的相对表达量最高,在肌肉中表达量最低。WSSV感染后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺和鳃丝中的表达量有不同的时空表达趋势,表明FcCasp2基因可能参与中国明对虾生物胁迫的应答反应。     

凡纳滨对虾养殖环境及肠道微生物群落特征分析

为探究凡纳滨对虾养殖过程中其肠道和养殖环境微生物群落的结构及变化，本实验采用Illumina MiSeq测序平台，基于16S rRNA基因的测序结果，对46和86 d虾龄的凡纳滨对虾肠道以及养殖水样、底泥中的微生物群落进行分析。结果显示，86 d时微生物Shannon-Wiener多样性指数显著高于46 d，水样中的Shannon-Wiener指数显著低于底泥和凡纳滨对虾肠道；有35个门、70个纲、152个目、274个科以及420个属在水样、底泥和虾肠道中均能检测到，其中虾肠道和底泥间共有菌类较水样中更多。微生物群落随养殖时间增加发生变化，46与86 d的差异性门类为放线菌门、绿菌门、丝状杆菌门、浮霉状菌门和TM6，相对丰度随时间增加而增高。水样、底泥和虾肠道中有相对固定的优势菌群，在水样、底泥和虾肠道中主要的门类均为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门，优势纲类为α变形菌纲、β变形菌纲以及放线菌纲，除此以外，虾肠道与底泥共有的优势纲为δ变形菌纲、γ变形菌纲以及芽单胞菌纲；从目、科、属的分类水平上看，水样、底泥和虾肠道中菌类相对丰度各异，鲜有明显重叠的优势菌类，在水样、底泥和虾肠道中均为一种未分类的属占优势地位，水样中优势属为hgcI_clade，底泥和虾肠道中优势属为Ambiguous_taxa。研究结果进一步解释了虾肠道和环境微生物群落结构之间的相关性以及随虾龄增长呈现的差异性。