PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌

根据已发表的气单胞菌16S rDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列，设计了2对引物，建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测，发现16S rDNA引物具有高度的特异性，仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97．2％，且具有高度的敏感性，可检测最低1fg的模板。将16S rDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94．4％。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径，是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。     

应用PCR快速诊断黄鳝嗜水气单胞菌败血症

根据致病性嗜水气单胞菌的标志性毒力基因-气溶素(aerolysin)基因序列,设计出一对特异性引物,采用PCR方法,对22尾临床疑似患嗜水气单胞菌败血症的黄鳝进行了诊断,检测出其中17尾呈致病性嗜水气单胞菌阳性,检测过程仅需6h;而常规细菌分离鉴定则耗时72 h,检出率仅为9/22.     

不同来源嗜水气单胞菌耐药基因检测

采用PCR方法,对分离于唐山和秦皇岛养殖场的宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)以及鲤(Cyprinus carpio)肝脏的42株不同水产养殖动物的致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了4种耐药基因β-内酰胺类(TEM)、氨基糖苷类(ant(3″)-I)、磺胺类(Sul3)和四环素类(tet(A))的检测。结果表明:42株嗜水气单胞菌均100%携带TEM、ant(3″)-I和Sul3,不携带tet(A)。所检不同水产动物源嗜水气单胞菌均携带TEM、ant(3″)-I及Sul3耐药基因,从分子层面表明该致病菌多重耐药或潜在耐药严重。     

应用多重PCR检测水生动物源气单胞菌安徽分离株的毒力基因型分布

粘附素(aha1)、气溶素(aerA)和细胞兴奋性肠毒素(alt)是气单胞菌的主要毒力因子。根据aha1、aerA和alt基因序列设计三对引物建立了可同时检测三种毒力基因的多重PCR方法(MPCR)。该方法扩增出气单胞菌的aha1大小为1087bp,aerA为721bp,alt为480bp,其敏感度为102CFU·mL-1。而对金黄色葡萄球菌、恶臭假单胞菌、拟态弧菌以及非致病性气单胞菌均未扩增出任何条带。用限制性内切酶EcoRⅤ、BamHⅠ和FbaⅠ分别酶切PCR扩增产物,均获得与预期一致的酶切图谱。用建立的MPCR对15株水生动物源气单胞菌安徽分离株进行毒力基因检测,结果显示在13株致病性气单胞菌中10株细菌的毒力基因型为alt aha1 aerA ,2株为alt aha1-aerA-,1株为alt aha1 aerA-;alt、aha1和aerA基因在气单胞菌中的携带率分别为100%、84.62%和76.92%。表明气单胞菌安徽分离株的主要毒力基因型是alt aha1 aerA 的高毒力表型,alt毒力基因普遍存在于不同表型种气单胞菌中。     

鲫源嗜水气单胞菌毒力基因多重PCR检测及ERIC-PCR分子分型

为快速了解鲫源嗜水气单胞菌株毒力基因携带情况及与菌株基因型的相关性,建立多重PCR法和ERIC-PCR分子分型,为临床快速检测、菌株分型和菌株致病性分析提供依据。通过单重PCR法检测出标准菌株ATCC7966内5个毒力基因气溶素(aerolysin,aer)、溶血素(hemolysin,hly)、细胞毒性肠毒素(cytotoxic enterotoxin,alt)、胞外蛋白酶(extracellular protease,ahp)和细胞肠兴奋性肠毒素(intestinal cells of excitatory enterotoxin,act),其扩增产物长度依次为300 bp、592 bp、442 bp、856 bp和500 bp。在此基础上,优化并建立特异性高,敏感度达7.2×102cfu·m L-1多重PCR法,用于检测从江苏射阳地区患病水产动物体内分离的17株嗜水气单胞菌5个毒力基因携带率。结果显示,毒力基因act的携带率为100%,而80%的菌株5个毒力基因均有检出。采用ERIC-PCR分子分型技术,以标准菌株ATCC7966为对照,对17株鲫源致病性嗜水气单胞菌进行基因分型,获得两种基因型,分别描述为A型和B型,其中B型菌株14株,带型与ATCC7966一致,认为是当地的主要流行株。探究菌株基因型与毒力基因分布相关性,携带5个毒力基因的均为B型菌株,而所有A型菌株存在一或多个毒力基因缺失,有可能是此类菌株更易发生毒力基因漂变,但还需进一步研究。     

27株嗜水气单胞菌致病性及ERIC—PCR指纹图谱分析

从福建省淡水养殖鱼类体内分离到27株嗜水气单胞菌,根据嗜水气单胞菌16SrDNA基因和气溶素基因（aerolysin）的保守序列,设计2对引物,对所分离到的27株嗜水气单胞菌进行双重PCR扩增,扩增结果表明,其中18株为含有Aer毒力基因的潜在致病性嗜水气单胞菌,占总菌数的66．67％。应用ERIC-PCR分型技术对27株嗜水气单胞菌菌株进行分析,以相似度54．00％为限,所有菌株可分为Ⅰ和Ⅱ两大聚类,以76．00％相似度为界,27株嗜水气单胞菌可分为11个聚类,同一个聚类中菌株分离区域基本相同。分析结果表明,分离的嗜水气单胞菌基因型的多样性和分离地域具有一定的关联,也表明ERIC-PCR可以有效应用于嗜水气单胞茵分子流行病学调查。     

6株鱼源嗜水气单胞菌的分子鉴定与毒力基因分析检测

为了分子鉴定6株鱼源嗜水气单胞菌,并从分子层面验证通过检测毒力基因以推测嗜水气单胞菌潜在致病性的可行性。实验采用PCR扩增16 S rDNA和gyrB基因并结合系统发育树的构建和分析进行菌种的分子鉴定,检测气溶素（ aerolysin, aer）、溶血素（ haemoly-sin, hly）、丝氨酸蛋白酶（ serine protease, ahp）、热稳定细胞肠毒素（ heat-stable cytotonic enterotoxin, ast）和热敏感细胞肠毒素（ heat-labile cytotonic enterotoxin, alt）5种毒力基因,且使用Mega 5．2对核苷酸和氨基酸序列进行分析。结果显示6株菌均为嗜水气单胞菌Aero-monas hydrophila,检测出5种毒力基因中的至少4种,其中均检测出溶血素和2种肠毒素,序列分析表明气溶素、溶血素和丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列高度保守。本研究基于16 S rD-NA和gyrB基因可以准确地对嗜水气单胞菌进行分子鉴定,6株菌的毒力基因丰富预示着一定的致病性, aer、 hly和ahp基因相对保守,编码的毒力因子高度同源,在临床分子诊断中建议使用aer、 ahp和hly基因对嗜水气单胞菌的潜在致病性进行检测。     

嗜水气单胞菌温敏胞外蛋白酶基因eprJ的克隆与检测

根据已发表的人源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)温敏胞外蛋白酶基因eprA1的核甘酸序列,设计合成一对引物,以嗜水气单胞菌鱼源株Ah J-1基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到1 005 bp的胞外蛋白酶基因eprJ1,将该基因片段连接到pMD18-T载体中,构建克隆载体pMD-eprJ1。序列分析发现,其与发表的Ah AH1的胞外蛋白酶eprA1基因的同源性有91%。根据测序结果在保守区重新设计一对引物以增强特异性,扩增片段大小为387 bp。对1990~2004年15年间从浙江、福建、湖北及江苏等地不同患病水产动物肝肾等脏器分离到的23株Ah检测结果显示,从中国东南地区分离的21株Ah水生动物致病性菌株扩增均为阳性,2株Ah非致病性菌株为阴性,推测该基因普遍存在于致病性Ah中。检测模板DNA的灵敏度可达1.5×10-3ng/μL。     

不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测及序列分析

采用PCR方法,对分离于发病宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、鲤(Cyprinus carpio)的42株致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了外膜蛋白(OMP)基因的检测;将代表菌株的外膜蛋白基因通过DNAStar软件与GenBank中报道的4株嗜水气单胞菌(FJ437030.1、AF183931.1、AF276639.2、CP000462.1)和1株温和气单胞菌(A.sobria,FJ437029.1)参考菌株进行了核苷酸同源性比较分析。结果表明,所检不同来源嗜水气单胞菌的OMP基因携带率为100%;所测代表菌株的OMP基因与参考菌株的同源性在86.0%～99.2%之间。所测得的不同来源嗜水气单胞菌OMP基因的同源性98.3%～100%,其中分离于宽体金线蛭的HTQ010505-1与青鱼的HL060811-4两菌株间同源性高达100%。     

斑点叉尾■溃烂症的病原鉴定和致病特性

为探明斑点叉尾[鱼回](Ictalunes punctatus)溃烂症的病因,从4尾患鱼肝脾中分离纯化出4株优势菌株,并进行病原鉴定、毒力基因检测、动物回归感染和药敏试验。4株优势菌经鉴定并命名为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp achromogenes)X-G1,杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.s subsp salmonicida)X-P2、X-P3和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)X-P4。15℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3的世代时间(约14 min)均小于嗜水气单胞菌X-P4(约20 min);25℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3株的世代时间(约20 min)均大于嗜水气单胞菌X-P4株(约16 min)。X-G1株可检到弹性蛋白酶、溶血素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等3种毒力基因;X-P2株仅可检到弹性蛋白酶1种毒力基因;X-P3株可检测到弹性蛋白酶、溶血素、细胞毒性肠毒素、丝氨酸蛋白酶、酯酶、气溶素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等7种毒力基因;X-P4株可检测到鞭毛、弹性蛋白酶、气溶素、细胞毒性肠毒素、热不稳定性肠毒素、丝氨酸蛋白酶和溶血素等7种毒力基因。分离株X-G1、X-P2、X-P3和X-P4在15~17℃水温下腹腔注射攻毒的半数致死浓度(LD 50)依次为0.49×10^4、0.78×10^4、0.53×10^4、3.84×10^4 CFU/g;而在23~26℃水温下测得的LD 50依次为1.48×10^4、1.80×10^4、0.82×10^4、0.68×10^4 CFU/g。分离株混合感染比单一株感染均表现出更强的致死能力。分离菌株对多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考均敏感,但因患病鱼不能摄食药饵而导致治疗失败。     

白斑狗鱼(Esox lucius)致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定

近些年来,新疆许多养殖场发生白斑狗鱼暴发性疾病而死亡。为鉴定病因,本研究对乌鲁木齐周边地区的自然患病白斑狗鱼(Esox lucius)的肝脏、肾脏等组织进行分离,经形态观察、生理生化试验、16S r DNA序列分析进行细菌鉴定。并通过人工回归感染白斑狗鱼和鲫,来验证分离菌株的致病性。结果表明,分离出的9株优势菌为致病性嗜水气单胞菌,命名为PK001-PK009。经PCR特异性检测发现,所得的9个菌株分别含有丝氨酸蛋白酶基因(ahp A)、溶血素基因(hly A)和气溶素基因(aer A)中的0-3个,从而导致了菌株间致病性的差异。通过人工回归感染实验发现,白斑狗鱼患病症状与自然病例相似,并重新分离得到原感染菌,经细菌学鉴定,其性状与原菌株一致,为嗜水气单胞菌。     

流水式养殖动物中弧菌和嗜水气单胞菌的PCR法监测

为了解流水式养殖场养殖动物中弧菌和气单胞菌的感染状况,分别针对霍乱孤菌肠毒素A亚单位(ctxA)基因、0139和01群群特异基因、毒力协同调节菌毛A亚单位基因(tcpA)、中心调节蛋白基因(toxR)、副溶血弧菌不耐热溶血素基因(tlh)、创伤弧菌Vibrio vulnificus溶细胞素基因(vvhA)和嗜水气单胞菌的气溶素基因(aerA)设计引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)检测技术,PCR产物经电泳,根据扩增条带的大小和数目,检测和区分霍乱孤菌、嗜水气单胞菌和副溶血孤菌.对南昌沿岸霍乱流行水域及附近养殖场的养殖动物进行了18个月的连续监测,对1 440份水产品的增菌液进行PCR检测,17份检出副溶血弧菌,25份检出霍乱弧菌,创伤弧菌和嗜水气单胞菌均未检出.扩增结果与传统培养检测法的结果一致.监测结果表明,南昌附近地区霍乱弧菌和副溶血弧菌检出率分别为1.74%和1.18%,总体感染状况处于较低水平,但个别养殖品种弧菌检出率较高.     

循环水养殖系统中高毒力嗜水气单胞菌的鉴定与药敏试验

为探究中华鳖（Pelodiscus sinensis）循环水养殖过程中出现体表穿孔和溃疡的病因，对患病中华鳖的肝、脾、肺和肾等部位取样并进行病原菌分离及革兰氏染色，利用16S rRNA测序和生化鉴定相结合进行细菌鉴定，通过毒力基因PCR检测和人工回感试验评估细菌的致病性，以纸片扩散法评估几种抗生素的抑菌效果，利用琼脂打孔法评估中药提取物的抑菌效果。结果显示，从病鳖的脏器中分离到一株优势菌AH0421，该菌为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状；菌株AH0421 与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）模式菌株ATCC 7966 的16S rRNA 序列相似性高达99.66%。菌株AH0421 能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，具有O/129 耐受性，其携带act、aerA、aha、ahh、ahp、ahpA、alt、ast、hlyA、lip、ompA毒力基因。回感试验出现与自然发病相似病症，菌株AH0421半致死浓度(LC50)为1.7×106CFU/mL。中药五味子提取物、诺氟沙星、多西环素、恩诺沙星、新霉素以及头孢克肟、头孢曲松等头孢类抗生素对该菌有较强的抑制作用。研究表明，五味子和多数头孢类抗生素可作为治疗菌株AH0421感染的参考药物。     

日本鳗鲡腐皮病病原菌的分离及鉴定

从患腐皮病的日本鳗鲡(Anguilla japonica)体表溃烂处分离到1株病原菌(322A),对其进行了人工感染实验和生理生化分析,测定了该菌株的16S rRNA基因序列和促旋酶(gyrase)B亚单位gyrB基因序列,并分别构建系统发育树。结果显示:感染实验证实菌株322A具有致病性;生理生化分析鉴定该菌株属于气单胞菌属(Aero-monassp.);16S rRNA基因分析显示,该菌株与气单胞菌属细菌的同源性均在99%~100%,构建的系统树显示,菌株322A与嗜水气单胞菌(A.hydrophila(FJ462702))亲缘关系最近;gyrB基因分析表明,该菌株与A.hydrophila种内序列的相似性为96%~98%,种间序列的相似性为94%~95%,构建的系统树结果显示,该菌株与A.hydrophila(FJ608553、FJ608552、AF208259)聚为一个分支。综合上述实验结果,菌株322A可鉴定为嗜水气单胞菌(A.hydrophila)。     

鲤鱼细菌性败血症病原菌的研究

从具有典型细菌性败血症症状的病鱼或濒死鱼中分离到2 株优势菌,经分离培养、人工感染试验、毒力因子、16S rRNA基因序列的测定及药敏试验,研究分离菌的生理生化特征、致病性及药物敏感性.根据2 株分离菌的菌落形态、生化特性和16S rRNA基因序列的测定结果(同源性为99%),确定为嗜水气单胞菌.人工感染试验的症状与自然发病相似,且再次感染后又分离到该菌株.2 株菌对阿米卡星、氨曲南、头孢噻肟等15 种药物均敏感,对氨苄西林均耐药,对复方磺胺表现出菌株差异.对其敏感的15 种药物可作为防治鲤鱼细菌性败血症的首选药物.