雌核发育草鱼群体及两个普通草鱼群体的微卫星遗传分析

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)养殖群体(YZ)为母本,以紫外线灭活的鲤鱼精子激活草鱼卵子,冷休克抑制第二极体排出的方法诱导获得异精雌核发育草鱼群体(CH)。利用12对微卫星引物对YZ群体、YS (扬州广陵长江系家鱼原种场引进草鱼群体)群体、CH群体进行PCR扩增并分析,共检测出194个等位基因,其中75.8个有效等位基因。YZ群体、YS群体、CH群体的平均等位基因数依次为13.0、12.6、4.7;平均有效等位基因数依次是7.7、6.6、2.3;平均期望杂合度依次为0.87、0.82、0.56;平均多态信息含量依次为0.84、0.79、0.49。从每个个体在微卫星位点的纯合率看,YZ群体中个体的纯合度在0.00～0.33, YS群体r中个体的纯合度在0.00～0.42, CH群体中个体的纯合度在0.42～0.92。这表明与YZ群体和YS群体相比,CH群体的遗传多样性显著下降,并且在每个位点的纯合率CH群体均高于普通草鱼群体,表明人工诱导减数雌核发育可加速草鱼大多数基因位点的纯合,是快速建立高纯品系的有效手段。同时,本研究筛选并利用微卫星位点组合建立了雌核发育草鱼子代不同家系及其母本亲缘关系的简易、高效鉴别技术,旨在为雌核发育草鱼标记辅助育种打下基础。     

黄姑鱼异质雌核发育子代的遗传分析

为了解黄姑鱼（Nibea albiflora）异质雌核发育子代的基因纯合情况，利用微卫星标记（SSR）和扩增片段长度多态性标记（AFLP）对黄姑鱼异质雌核发育家系进行遗传鉴定和分析。结果显示：（1）雌核发育家系在4个SSR位点和5对AFLP引物组合扩增出的位点均未发现父本特异性等位条带，表明雌核发育体比率为100%。（2）用于遗传分析的7个SSR位点在雌核发育家系和正常交配家系中均未见完全纯合的情况，雌核发育家系7个SSR位点的平均纯合度为0.382，是正常交配家系（0.161）的2.37倍。雌核发育家系各个体的纯合位点数为0~6个，纯合位点所占比例为0~85.7%。（3）5对AFLP引物共扩增出182条清晰的扩增条带，其中有21条父本特异性条带和16条母本特异性条带。16条母本特异性条带中有7个条带在雌核发育家系中显著偏分离（P<0.05）。雌核发育家系和正常交配家系多态性条带比例分别为14.7%和20.3%。（4）雌核发育家系与母本的遗传相似度高于与正常交配家系的遗传相似度，正常交配家系同父本和母本的遗传距离大致相同。研究结果表明，黄姑鱼异质雌核发育二倍体家系的遗传纯合度显著高于正常交配家系，人工诱导雌核发育是促进基因纯合的一个有效途径，它不仅可以加速有利基因的纯合固定，还可以加速有害基因的淘汰，从而有效提高育种效率。     

牙鲆减数分裂与有丝分裂雌核发育的遗传差异

利用同一尾牙鲆亲鱼的同一批卵子诱导减数分裂雌核发育二倍体和有丝分裂雌核发育二倍体,同时用牙鲆精子做人工授精制备普通二倍体,作为对照组。利用10对微卫星引物对普通二倍体和两种雌核发育二倍体进行遗传分析。结果表明,母本基因型在8个位点为杂合,2个位点为纯合。普通二倍体有6种基因型,等位基因均来自父母本的随机结合,类型丰富;母本与子代、子代个体之间的遗传相似系数分别为0.452 8和0.560 3,接近随机交配群体的遗传相似度。减数分裂雌核发育二倍体有3种基因型,除在1个位点出现异于母本的纯合基因型外,其他所有位点的基因型与母本完全一致;母本与子代、子代个体之间遗传相似系数分别为0.976 6和0.959 5,接近近交系的遗传相似度。有丝分裂雌核发育二倍体有2种基因型,且全部为纯合型;母本与子代、子代个体之间遗传相似系数分别为0.806 2和0.742 5,有丝分裂雌核发育二倍体全部为纯合个体。减数分裂雌核发育二倍体具有高度的遗传相似性,适于固定母本性状;有丝分裂雌核发育二倍体纯合度高,适于作为制备克隆的亲本;两者具有明显不同的遗传特性,均可作为特征不同的育种材料。     

ENU诱变草鱼及其雌核发育后代的微卫星遗传分析

为了获得雌核发育ENU诱变草鱼(Cetpharyngodon idellus)群体的相关遗传参数,实验采用Partec Cy Flow倍性分析仪测定ENU诱变草鱼群体(Q群体)和雌核发育ENU诱变草鱼群体(E群体)相对DNA含量分别为24.02和23.80,二者的DNA含量接近,均为二倍体。选取28个微卫星标记对Q群体和E群体多样性进行了检测。结果表明,E群体和Q群体的平均等位基因分别为3.7143、5.1786,平均有效等位基因分别为2.1857、4.0028,平均期望纯合度分别为0.5122、0.2814,平均期望杂合度分别为0.4878、0.7186,多态信息含量(PIC)平均值分别为0.4282、0.6606。从个体在微卫星位点的纯合率分析,在E群体中,每个个体的纯合度均小于1.00,说明没有完全纯合的个体。从每个微卫星位点在群体的纯合率分析,除了微卫星位点5476,HLJC118和HLJC81外,其他位点的纯合度以不同的速率得到明显的提高。综上所述,经过减数雌核发育方法,ENU诱变草鱼群体的各微卫星位点的纯合度以不同的速率得到提升,遗传多样性明显降低,此方法可以获得纯合度较高的雌核发育ENU诱变草鱼个体,为ENU诱变草鱼良种选育提供了重要的遗传数据资料。     

牙鲆连续两代减数分裂雌核发育家系的遗传特征

对牙鲆(Paralichthys olivaceus)减数分裂雌核发育二倍体(Meio-G1)再次诱导减数分裂雌核发育,获得连续两代雌核发育二倍体家系(Meio-G2),以Meio-G1亲本与1尾普通牙鲆雄鱼人工授精获得的家系作为对照组(control)。利用15个微卫星标记对3个家系进行遗传特征分析。结果显示,15个微卫星位点在Meio-G1、Meio-G2和对照组3个家系中,分别扩增到30、28、50个等位基因,平均等位基因数为2.0、1.9、3.3,平均观测杂合度(Ho)分别为0.875 3、0.774 2、0.908 3,平均纯合度分别为0.124 7、0.221 5、0.091 7。3个家系个体间的平均遗传相似系数分别为0.891 7、0.923 8、0.520 2,亲代与子代之间的平均相似系数分别为0.916 6、0.930 4、0.560 3。高重组率的Poli9-8tuf、Poli18tuf、Poli107tuf 3个位点在Meio-G1和Meio-G2中观测杂合度均为1.0,低重组率的Poli33tuf、Poli24MHFS两个位点在Meio-G1和Meio-G2中均全部纯合,观测杂合度为0。结果表明,Meio-G2的纯合度、个体间平均相似系数以及亲子之间的平均相似度均略高于Meio-G1,显著高于对照组家系,证明连续两代诱导减数分裂雌核发育,能提高鱼类纯合度和遗传相似度,具有固定母本遗传性状的作用。     

半滑舌鳎养殖群体和减数分裂雌核发育群体的微卫星标记遗传多样性分析

利用24对微卫星分子标记对半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis的养殖群体和减数分裂雌核发育群体进行遗传多样性分析。结果表明,两个半滑舌鳎群体平均等位基因数分别为7.0和4.8,平均有效等位基因数分别为3.935和2.411,平均观测杂合度(HO)分别为0.713 5和0.586 5,养殖群体的遗传多样性明显高于减数分裂雌核发育群体。有1个位点在养殖群体中偏离哈代-温伯格平衡,13个位点在减数分裂雌核发育群体中偏离哈代-温伯格平衡。群体间基因分化系数(GST)为0.093 6,遗传距离为0.420 0,表明两群体间遗传分化显著。     

剑尾鱼RW-H近交系的遗传结构分析

筛选31条随机引物对剑尾鱼的第8代近交RW-H系A、B、C3窝共11尾剑尾鱼个体基因组DNA进行RAPD扩增，计算近交系个体间及不同窝间的相似系数及遗传距离。结果筛选的31条引物共扩增出383条带，扩增片段的大小在0．2～3kb。其中多态性带30条，多态性带频率在0～58．33％，平均为7．83％。近交系剑尾鱼不同个体拥有相同条带的比率较高。计算得到近交系的平均相似系数(S)为0．9829(0．9716～0．9960)，平均等位基因频率(q)为0．8692，最低平均杂合率(H)为0．1308。同时，用5个微卫星标记对非选育剑尾鱼和近交系RW-H系的基因组进行分析，检测等位基因的个数和大小，结果5个微卫星座位在非选育剑尾鱼中显示为多态，而在近交系RW-H系除1个位点出现等位基因外，其余均为纯合子，计算得到近交系的平均遗传相似系数为0．9345，两种方法均证明近交RW-H系第8代剑尾鱼有较高的遗传纯合度。     

异精雌核发育草鱼F1与普通草鱼的SCAR标记鉴别初报

以赤眼鳟生理失活精子诱导的雌核发育草鱼F1群体(CC)和与之母本同源的普通草鱼群体(PC)为材料,采用RAPD和SCAR分子标记相结合的技术,在100条RAPD随机引物扩增的16条有效引物中扩增筛选出7条群体差异条带,其中1条为异精雌核发育草鱼群体中特有,其余均表现为异精雌核发育草鱼群体缺失;对7条RAPD特异条带的回收中仅得到S32和S336的特异条带。经回收、克隆、测序后根据序列信息设计了4对SCAR引物,其中S336的2对SCAR引物在两群体间扩增出的条带一致,特异性消失;S32的2对SCAR引物能扩增出两群体间的特异条带;对S32-Scar1F/S32-Scar1R扩增出的SCAR标记S321643进行大样本检测结果表明:该标记在异精雌核发育草鱼群体中的出现频率为0(0/55),在普通草鱼群体中出现频率为76.7%(46/60)。     

牙鲆连续四代减数分裂雌核发育家系的遗传特征分析

为了研究纯合度和遗传相似度在牙鲆(Paralichthys olivaceus)连续四代减数分裂雌核发育家系中的变化规律，本研究利用分布在不同连锁群上的24个高重组率微卫星标记对牙鲆连续减数分裂雌核发育二代(G2)、三代(G3)、四代(G4)家系及普通家系对照组进行了遗传分析。结果显示，24个微卫星位点在对照组、G2、G3、G4家系中，分别检测到96、42、32和32个等位基因，平均等位基因数分别为4.00、1.98、1.33和1.33；期望杂合度分别为0.6416、0.3472、0.1694和0.1492；纯合度分别为0.3503、0.6528、0.8306和0.8508；遗传相似系数分别为0.5822、0.9238、0.9890和0.9988。24个位点中已有17个纯合，但尚有7个保持杂合状态。同时，将上述结果和已发表的减数分裂雌核发育一代(G1)家系的数据进行分析，结果表明，诱导连续减数分裂雌核发育不仅能提高个体的纯合度，同时也可提高子代个体间的遗传相似度；纯合度和遗传相似度在G1、G2和G3家系中能够得到逐步提高，代际之间差异显著(P<0.05)；但在G4家系中趋于稳定，与G3家系差异不显著。G4家系的遗传相似性(0.9988)已高于连续20代全同胞交配所获得的理论值(0.9860)，连续诱导减数分裂雌核发育是快速建立鱼类近交系的良好方法。     

团头鲂良种雌核发育群体的建立及其遗传变异

为了巩固经15年选育而成的团头鲂良种－浦江一号的成果，并建立纯系以供进一步研究和开发，1999年和2000年，先后对团头鲂选育系三龄鱼（F5）和二龄鱼（F6）进行了雌核发育（抑制第二次成熟分裂）研究。利用UV照射遗传失活的鲤鱼精子诱导，采用冷,凶制团头鲂第二体排出；探索了适合团头鲂二龄及三龄鱼卵的休克温度、起始时间和持续时间，结果发现：二龄鱼和三龄鱼诱导起始时间均在受精后3min效果最好，而在体温度和持续时间上稍有差异，其中三龄鱼在0－2℃冷休克处理30min、二龄鱼在4－6℃冷休克处理20min效果较好。2年期间，建立了源于选育系3尾雌亲鱼的3个雌核发育群体，共获得正常的雌核发鱼后代1000余尾。RAPD分析发现，选育系群体具有引物S8扩增的1100bp条带，而雌核发育群体具有引物S18扩增的860bp条带；雌核发育群体内遗传相似度显著高于选育系群体，其遗传距离仅为选育系群体内遗传距离的54％。     

Verification of mitotic gynogenesis in ornamental (koi) carp (Cyprinus carpio L.) using microsatellite DNA markers

The Japanese ornamental (koi) carp is a popular decorative fish all over the world. In koi, clones have not yet been obtained, although production of fish with identical colour patterns could be of commercial interest. Mitotic gynogenetic progenies are essential for subsequent production of clones in fish. However, resulting late‐shocked progenies may be contaminated with meiotic gynogens from spontaneous suppression of the second meiotic division in eggs. In this study, microsatellite DNA markers were used to confirm mitotic gynogenetic origin of obtained late‐shocked progenies. Recombination rate (y) and mapping distance relative to centromere (M‐C) of 10 microsatellite loci were determined based on percentage of heterozygotes in meiotic gynogenetic progenies. The range of y varied from 0.01 to 0.96 and the M‐C map ranged from 0.5 to 48 cM. The mean value of y over the 10 loci was 0.481. Six loci, which had y 0.47 and higher, were used as markers in two late‐shocked gynogenetic progenies. Complete homozygosity was revealed at all six microsatellite loci indicating mitotic gynogenetic origin of analysed progenies.     

Microsatellite–centromere mapping in bighead carp ( Aristichthys nobilis) using gynogenetic diploid families

Gene–centromere mapping using half‐tetrad analysis is a powerful tool for understanding chromosomal behaviour and determining the position of centromeres in relation to genes or markers in fish. In this study, eight gynogenetic diploid families induced by inhibiting of the second meiotic division were genotyped at 66 microsatellite loci for microsatellite–centromere (M‐C) mapping in bighead carp ( Aristichthys nobilis). The absence of paternal alleles verified the success of gynogenetic development in all gynogenetic families. All loci were consistent with Mendelian segregation in control families. The estimated recombination frequency (y) ranged from 0.057 to 0.875 with an average of 0.477 ± 0.222. Seventeen loci (25.76%) showed high M‐C recombination frequencies of over 0.667. M‐C distances ranged from 2.85 to 43.75 cM under the assumption of complete interference. Thus, these loci are distributed from the centromeres to the telomeres of their respective chromosomes, while mainly in the intermediate region. Information on centromere mapping could serve as a starting point to consolidate the genetic linkage groups in bighead carp.     

长江草鱼多态微卫星位点的分离及后备亲鱼的遗传多样性分析

本研究采用磁珠富集法分离了10对具有多态性的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)微卫星位点,并对140条长江野生草鱼组成的后备亲鱼群体的遗传结构进行了分析。结果显示:本试验得到的草鱼微卫星序列主要是以2个碱基为重复单位、重复次数在5～22之间的多重复单元,重复次数在10次以上的微卫星序列较易得到多态性;77个微卫星座位中,完美型、非完美型和混合型微卫星标记所占的比例分别为87.01%、2.60%和10.39%;群体遗传分析显示,10个多态性微卫星座位中,除了GC39座位外,其它座位都符合哈迪-温伯格平衡,适用于草鱼群体的遗传结构分析;每个座位检测到3～8个等位基因,平均有效等位基因数为3.9302,多态信息含量在0.4129～0.8107之间变动,平均为0.6678,除了GC78座位为中度多态外,其他9个座位均为高度多态。基因分化系数、Shannon指数、平均观测杂合度和平均期望杂合度的平均值分别为0.3457、1.4262、0.9511和0.7193,表明该群体的遗传多样性比较丰富。     

基于微卫星评估草鱼放流亲本对野生群体遗传多样性的影响

利用筛选的13对草鱼多态性微卫星标记,开展了2011至2015年长江中游草鱼亲本增殖放流对野生群体遗传多样性的影响评估。通过对各位点的遗传多样性分析,13个微卫星位点的多态信息含量为0.8622(0.657~0.950),基因多样度为0.8555(0.675~0.936)。15个群体的有效等位基因数为7.4503~10.1536,等位基因丰度为11.483~15.204,说明15个草鱼群体的遗传多样性水平总体较高。遗传分化指数分析表明,群体间不存在显著遗传分化(FST5%)。通过贝叶斯聚类分析和主成分分析可将草鱼群体分为4个组群,根据分组结果以及来源划分分别对草鱼群体进行AMOVA分析,发现遗传变异大部分来自于群体内个体间,组间及组内群体间的分化水平较低(FCT5%,FSC5%),与FST分析结果一致。研究表明,当前草鱼亲本增殖放流模式对野生群体遗传结构影响不明显。     

有丝分裂雌核发育牙鲆的微卫星鉴定

通过静水压抑制卵裂方法获得多个牙鲆(Paralichthys olivaceus)有丝分裂雌核发育家系,在仔鱼阶段经历大批死亡后,将各个家系残存的个体混合饲养,24个月后获得1批存活个体。利用11对微卫星分子标记,对173尾有丝分裂雌核发育牙鲆进行分析,结果表明,其中111尾在11位点全部纯合,62尾在部分位点杂合,平均杂合子比例为0.2338。11个位点的等位基因数为4～8,平均等位基因数为5.0336,有效等位基因数为2.0421～5.1268,平均有效等位基因数为3.2815。采用NJ法对111尾纯合牙鲆的亲缘关系进行聚类分析,可分为4群。微卫星标记鉴定结果表明,通过静水压抑制卵裂法可以获得完全纯合的牙鲆,但有部分杂合个体出现。分析其原因,可能是由于某些卵子发育不同步,静水压抑制其第二极体排出而非全部抑制卵裂,导致减数分裂雌核发育所致。     

人工雌核发育鲢近交F_2微卫星DNA变异分析

采用17对鲢微卫星引物,以野生鲢、养殖鲢、雄鲤作对照对人工雌核发育鲢近交F2及其亲本进行了微卫星分析。结果表明:人工雌核发育鲢近交F2、养殖鲢和野生鲢群体的平均等位基因数范围为2.1～4.0;平均观测杂合度范围为0.2762～0.9588;期望杂合度范围为0.2774～0.7360;遗传多样性指数范围为0.4500～1.2258,人工雌核鲢近交F2为0.4500,显著低于养殖鲢(1.0273)和野生鲢(1.2258),揭示人工雌核发育鲢近交F2遗传多样性水平较低,纯合度较高。从遗传距离来看,人工雌核发育鲢近交F2与对照群体之间的遗传距离都要大于野生鲢与养殖鲢群体之间遗传距离,表明人工雌核发育鲢近交F2发生了一定程度的遗传分化。