牙鲆连续四代减数分裂雌核发育家系的遗传特征分析

为了研究纯合度和遗传相似度在牙鲆(Paralichthys olivaceus)连续四代减数分裂雌核发育家系中的变化规律，本研究利用分布在不同连锁群上的24个高重组率微卫星标记对牙鲆连续减数分裂雌核发育二代(G2)、三代(G3)、四代(G4)家系及普通家系对照组进行了遗传分析。结果显示，24个微卫星位点在对照组、G2、G3、G4家系中，分别检测到96、42、32和32个等位基因，平均等位基因数分别为4.00、1.98、1.33和1.33；期望杂合度分别为0.6416、0.3472、0.1694和0.1492；纯合度分别为0.3503、0.6528、0.8306和0.8508；遗传相似系数分别为0.5822、0.9238、0.9890和0.9988。24个位点中已有17个纯合，但尚有7个保持杂合状态。同时，将上述结果和已发表的减数分裂雌核发育一代(G1)家系的数据进行分析，结果表明，诱导连续减数分裂雌核发育不仅能提高个体的纯合度，同时也可提高子代个体间的遗传相似度；纯合度和遗传相似度在G1、G2和G3家系中能够得到逐步提高，代际之间差异显著(P<0.05)；但在G4家系中趋于稳定，与G3家系差异不显著。G4家系的遗传相似性(0.9988)已高于连续20代全同胞交配所获得的理论值(0.9860)，连续诱导减数分裂雌核发育是快速建立鱼类近交系的良好方法。     

牙鲆减数分裂与有丝分裂雌核发育的遗传差异

利用同一尾牙鲆亲鱼的同一批卵子诱导减数分裂雌核发育二倍体和有丝分裂雌核发育二倍体,同时用牙鲆精子做人工授精制备普通二倍体,作为对照组。利用10对微卫星引物对普通二倍体和两种雌核发育二倍体进行遗传分析。结果表明,母本基因型在8个位点为杂合,2个位点为纯合。普通二倍体有6种基因型,等位基因均来自父母本的随机结合,类型丰富;母本与子代、子代个体之间的遗传相似系数分别为0.452 8和0.560 3,接近随机交配群体的遗传相似度。减数分裂雌核发育二倍体有3种基因型,除在1个位点出现异于母本的纯合基因型外,其他所有位点的基因型与母本完全一致;母本与子代、子代个体之间遗传相似系数分别为0.976 6和0.959 5,接近近交系的遗传相似度。有丝分裂雌核发育二倍体有2种基因型,且全部为纯合型;母本与子代、子代个体之间遗传相似系数分别为0.806 2和0.742 5,有丝分裂雌核发育二倍体全部为纯合个体。减数分裂雌核发育二倍体具有高度的遗传相似性,适于固定母本性状;有丝分裂雌核发育二倍体纯合度高,适于作为制备克隆的亲本;两者具有明显不同的遗传特性,均可作为特征不同的育种材料。     

基于M-C作图鉴定牙鲆不同二倍体的遗传特征

为了分析连锁群上不同位置的微卫星标记对鉴定牙鲆二倍体遗传特征的作用,实验以牙鲆选育基础群体为亲本,选择性腺发育良好的个体制备普通二倍体(ND),减数分裂雌核发育二倍体(MGD-1)、连续两代减数分裂雌核发育二倍体(MGD-2),并利用MGD-1发育达性成熟的雌鱼与同时诱导的性反转伪雄鱼交配制备近交二倍体(MGD1H)。从牙鲆遗传连锁图谱选择均匀分布于24个连锁群的72个微卫星标记,用4个MGD-1家系估计微卫星标记与着丝粒之间的相对距离。在假设无交叉干涉的情况下,17个标记位于着丝粒区域,19个标记位于连锁群中部,36个标记位于远着丝粒区域。分别选择上述区域的微卫星标记鉴定牙鲆4种二倍体的遗传特征。结果显示,4种二倍体的等位基因数(A)和多态信息含量(PIC)在不同区域变化范围较小,ND的A和PIC均为最高,MGD1H则表现为最低。随着标记与着丝粒之间距离的增加,4种二倍体的观测杂合度逐渐升高,纯合度逐渐降低。纯合个体比例在着丝粒区域最高,为8.8%～29.1%;在远着丝粒区域最低,为2.4%～23.2%。其中,MGD-1和MGD-2的变化幅度显著高于其余二倍体。结果表明,选择连锁群上不同位置的微卫星标记对鉴定牙鲆不同二倍体的遗传特征具有显著影响。     

团头鲂“浦江2号”连续2代雌核发育群体的微卫星遗传结构

为获得团头鲂(Megalobrama amblycephala)的纯合品系, 本研究以团头鲂“浦江 2 号”作为亲本, 采用紫外线灭活的鲤鱼精子刺激团头鲂卵子, 经冷休克抑制第二极体排出的方法获得异源雌核发育一代群体(Meio-G1)和雌核发育二代群体(Meio-G2)。利用筛选出的 20 对微卫星引物, 研究分析了团头鲂“浦江 2 号”正常群体、雌核发育一代群体(Meio-G1)和雌核发育二代群体(Meio-G2)的遗传特征。结果表明, 正常群体、Meio-G1 和 Meio-G2 中, 分别扩增出 129、99、84 个等位基因, 平均等位基因数(Na)分别为 4.30、3.30、2.80, 平均有效等位基因数(Ne)分别为 3.23、 2.24、1.76, 平均观测杂合度(Ho)分别为 0.8067、0.4067、0.1733, 平均纯合度(H)分别为 0.2035、0.6000、0.8263, 平均多态信息含量(PIC)分别为 0.6198、0.4701、0.3628, 表明 Meio-G1 和 Meio-G2 相较于正常群体其遗传多样性下降, 其中 Meio-G2 的遗传多样性最小。Hardy-Weinberg 平衡遗传偏离指数表明 Meio-G1 和 Meio-G2 出现杂合子缺失的现象, 而正常群体则表现为杂合子过剩。聚类分析显示, 正常群体与 Meio-G1 共同汇聚成为一支, 而 Meio-G2 单独成为一支, 产生了一定程度的遗传分化。本研究结果表明, Meio-G2 的纯合度高、遗传多样性低, 是良好的育种材料, 可为团头鲂的选育工作提供重要参考依据。     

鲤雌核发育子代基因的杂合度分析

通过热休克法抑制第一次有丝分裂(抑制第一次卵裂)和减数分裂(抑制第二极体排除),分别获得鲤(Cyprinus carpio L.)的2个雌核发育家系.利用13对具有高多态性的微卫星分子标记,分别对2个雌核发育家系的观测杂合度(Ho、期望杂合度(He)、等位基因频率(P)和有效等位基因数(Ne等进行遗传背景调查.结果表明,抑制第一次有丝分裂家系的等位基因频率为0.063～1.000,平均观测杂合度为0.22,平均期望杂合度为0.24,平均有效等位基因数为1.41,该家系在6个微卫星座位上表现为纯合子,在7个微卫星座位上表现为杂合子,其中位点MFW4完全表现为杂合子;抑制减数分裂的等位基因频率为0.056～0.889,观测杂合度的平均值为0.37,期望杂合度的平均值为0.47,平均有效等位基因数为1.93,该家系中没有得到完全纯合的个体,其中在2个位点上全部表现为杂合子.在所分析的鲤雌核发育群体中,有3个基因座位(HLJ034、HLJ044和HLJ071)有重组现象,重组率为20.00%.综合上述结果推断,鲤2个雌核发育家系在个体和群体上都具有一定的基因杂合性.[中国水产科学,2009,16(1):47-53]     

微卫星评价栉孔扇贝雌核发育二倍体纯合性

采用筛选获得的5对多态性微卫星引物对栉孔扇贝（Chlamys farreri）减数分裂雌核发育家系A和家系B、有丝分裂雌核发育家系A和家系B各30个个体、双亲及对照组40个个体进行了遗传变异分析，并对减数分裂和有丝分裂雌核发育后代的纯合性进行了比较。电泳结果表明，5对微卫星引物在减数分裂雌核发育和有丝分裂雌核发育个体中均能稳定重复地扩增出相应的序列；各雌核发育家系中均有部分个体出现父本基因，表明精子遗传物质失活不彻底，雌核发育组中存在正常受精个体；有丝分裂雌核发育二倍体在所有检测位点全部纯合，减数分裂雌核发育二倍体在部分位点纯合，但未发现在所有位点全部纯合的个体，在CFMSP007、CFMSP075、CFMSM009、CFMSM014和CFMSM020位点，杂合子比例分别为0．3400、0．3611、0．4884、0．4750和0．7500，平均杂合子比例为0．4829。研究结果显示，栉孔扇贝有丝分裂雌核发育二倍体均为纯合子，如精子的灭活率达到100％，有丝分裂雌核发育二倍体一代即可实现纯合，如再进行一次减数雌核发育即可建立纯系；减数分裂雌核发育二倍体由于具有较高的重组率，其与母本的遗传同质性较高。     

牙鲆三个同源纯系的生长和遗传性状比较

利用同一牙鲆(Paralichthys olivaceus)家系F09119的母本,建立了减数雌核发育系(F1324)、卵裂雌核发育系(F1346)及近交家系(F1313)3个纯系,对3个纯系群体的生长和遗传性状进行比较分析。在受精后85~388 d对3个家系的体长、体宽、体重及成活率进行测定比较,结果显示:F1346生长最快,388 d时体长、体宽和体重分别为(28.89±2.77)cm、(10.00±1.21)cm和(254.91±83.11)g,F1313次之,F1324最慢(P0.05)。388 d时F1324成活率最高(46.50%),F1313次之(38.00%),F1346最低(26.80%)。F1346、F1324和F1313平均等位基因数(Na)分别为2.0、2.0和2.35,平均有效等位基因数(Ne)分别为1.87、1.95和2.1,多态信息含量(PIC)分别为0.35、0.36和0.4,平均观测杂合度分别为0、0.8155和0.6366;卵裂雌核发育系和减数雌核发育系的遗传多样性明显低于近交系。平均期望纯合度F1313(0.503)F1324(0.5105)F1346(0.532);平均期望杂合度正好相反,F1313(0.4967)F1324(0.4894)F1346(0.4679)。卵裂雌核发育系纯合度是减数雌核发育系的1.0421倍,是近交系的1.0577倍;减数雌核发育系纯合度是近交系的1.0149倍。F1346与F1313之间的遗传距离最大(0.1568),遗传相似度最小(0.8549);F1346与F1324之间的遗传距离最小(0.0406),遗传相似度最大(0.9602)。本研究结果为牙鲆纯系构建及解析卵裂雌核发育系、减数雌核发育系和近交系的遗传区别提供了理论依据。     

半滑舌鳎养殖群体和减数分裂雌核发育群体的微卫星标记遗传多样性分析

利用24对微卫星分子标记对半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis的养殖群体和减数分裂雌核发育群体进行遗传多样性分析。结果表明,两个半滑舌鳎群体平均等位基因数分别为7.0和4.8,平均有效等位基因数分别为3.935和2.411,平均观测杂合度(HO)分别为0.713 5和0.586 5,养殖群体的遗传多样性明显高于减数分裂雌核发育群体。有1个位点在养殖群体中偏离哈代-温伯格平衡,13个位点在减数分裂雌核发育群体中偏离哈代-温伯格平衡。群体间基因分化系数(GST)为0.093 6,遗传距离为0.420 0,表明两群体间遗传分化显著。     

雌核发育草鱼的遗传结构分析和微卫星鉴别方法的建立

采用微卫星标记检测草鱼群体的遗传多样性,并根据纯合度的变化建立了雌核发育草鱼的鉴别技术。结果显示,8个位点共扩增出33个等位基因;在普通草鱼中,平均纯合度和PIC分别为0.203 1和0.552 8;在雌核发育群体中,则为0.716 1和0.357 2;2个群体间遗传相似度为0.873 3。其中,5个位点在雌核发育草鱼中纯合度明显提高,雌核发育草鱼在这5个位点的扩增总条带数为5~7个,普通草鱼则为8~10个,由此可100%区分2个草鱼群体。通过概率计算,理论鉴别概率达到99.92%。研究表明,雌核发育技术对草鱼的群体遗传结构改变较大,是快速建立纯系、固定优良性状的有效手段;根据群体遗传纯合度的改变、扩增条带数目差异,应用多态性微卫星分子标记可以简单、有效地区分雌核发育群体(或与之相似的高度近交群体)与普通群体。     

有丝分裂雌核发育牙鲆的微卫星鉴定

通过静水压抑制卵裂方法获得多个牙鲆(Paralichthys olivaceus)有丝分裂雌核发育家系,在仔鱼阶段经历大批死亡后,将各个家系残存的个体混合饲养,24个月后获得1批存活个体。利用11对微卫星分子标记,对173尾有丝分裂雌核发育牙鲆进行分析,结果表明,其中111尾在11位点全部纯合,62尾在部分位点杂合,平均杂合子比例为0.2338。11个位点的等位基因数为4～8,平均等位基因数为5.0336,有效等位基因数为2.0421～5.1268,平均有效等位基因数为3.2815。采用NJ法对111尾纯合牙鲆的亲缘关系进行聚类分析,可分为4群。微卫星标记鉴定结果表明,通过静水压抑制卵裂法可以获得完全纯合的牙鲆,但有部分杂合个体出现。分析其原因,可能是由于某些卵子发育不同步,静水压抑制其第二极体排出而非全部抑制卵裂,导致减数分裂雌核发育所致。     

黄姑鱼异质雌核发育子代的遗传分析

为了解黄姑鱼（Nibea albiflora）异质雌核发育子代的基因纯合情况，利用微卫星标记（SSR）和扩增片段长度多态性标记（AFLP）对黄姑鱼异质雌核发育家系进行遗传鉴定和分析。结果显示：（1）雌核发育家系在4个SSR位点和5对AFLP引物组合扩增出的位点均未发现父本特异性等位条带，表明雌核发育体比率为100%。（2）用于遗传分析的7个SSR位点在雌核发育家系和正常交配家系中均未见完全纯合的情况，雌核发育家系7个SSR位点的平均纯合度为0.382，是正常交配家系（0.161）的2.37倍。雌核发育家系各个体的纯合位点数为0~6个，纯合位点所占比例为0~85.7%。（3）5对AFLP引物共扩增出182条清晰的扩增条带，其中有21条父本特异性条带和16条母本特异性条带。16条母本特异性条带中有7个条带在雌核发育家系中显著偏分离（P<0.05）。雌核发育家系和正常交配家系多态性条带比例分别为14.7%和20.3%。（4）雌核发育家系与母本的遗传相似度高于与正常交配家系的遗传相似度，正常交配家系同父本和母本的遗传距离大致相同。研究结果表明，黄姑鱼异质雌核发育二倍体家系的遗传纯合度显著高于正常交配家系，人工诱导雌核发育是促进基因纯合的一个有效途径，它不仅可以加速有利基因的纯合固定，还可以加速有害基因的淘汰，从而有效提高育种效率。     

Fast development of genetically uniform strains by gynogenesis in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)

The Japanese flounder is a major species in both aquaculture and research. Inbred strains of Japanese flounder were developed efficiently in our laboratory by meiotic and mitotic gynogenetic reproduction techniques. To determine the induction efficiency of gynogenesis and the rate at which full homozygosity is produced, six meiotic gynogenetic females (G1–G6) that had experienced meiotic gynogenesis once and three common females (C1–C3) were selected for production of mitotic gynogenesis in our experiments. Of the nine adult females, all six gynogenetic fish successfully produced viable offspring. However, only one of the three common fish did. Using microsatellite markers, we estimated the homozygosity of gynogenetic fish induced by mitotic gynogenesis. We found that the homozygosity of seven lines (C1, G1–G6) increased quickly, individually from 43%, 72%, 69%, 71%, 78%, 69% and 58% to 100%, 100%, 100%, 90%, 100%, 100% and 90% offspring complete homozygosity. Under mitotic gynogenesis, individuals with higher homozygosity had a higher induction rate. The G4 line showed the highest induction rate, achieving 44.59% convert hatching rate and 29.28% convert normality rate. We conclude that meiotic gynogenesis may be a feasible method to produce DH genetic material in Japanese flounder.     

牙鲆雌核发育近交系、杂交系的遗传分析与生长比较

建立牙鲆(Paralichthys olivaceus)雌核发育近交系和杂交系, 以两性生殖家系作为对照组, 对3个群体的遗传特征和生长进行比较。结果表明, 雌核发育近交系、杂交系和对照组的等位基因数分别为41、55、78, 平均等位基因数为1.7、2.3、3.3, 平均观测杂合度为0.419 2、0.654 9、0.916 7, 雌核发育杂交系的上述参数明显高于近交系, 但低于对照组。3个群体的平均纯合度分别为0.580 7、0.345 1、0.083 3, 个体之间的遗传相似度分别为0.831 2、0.826 1、0.672 7, 杂交系小于近交系, 但明显高于对照组(P<0.05)。在生长方面, 雌核发育杂交系比近交系和对照组生长快, 差异极显著(P<0.01)。从结果可以看出, 雌核发育杂交系具有比近交系高的杂合度, 但具有与近交系相似的遗传相似度; 生长上比近交系明显快, 表现出明显的杂交优势。结论认为雌核发育家系杂交方法可以作为一种育种手段, 用于发挥杂交优势和提高遗传相似度。

     

ENU诱变草鱼及其雌核发育后代的微卫星遗传分析

为了获得雌核发育ENU诱变草鱼(Cetpharyngodon idellus)群体的相关遗传参数,实验采用Partec Cy Flow倍性分析仪测定ENU诱变草鱼群体(Q群体)和雌核发育ENU诱变草鱼群体(E群体)相对DNA含量分别为24.02和23.80,二者的DNA含量接近,均为二倍体。选取28个微卫星标记对Q群体和E群体多样性进行了检测。结果表明,E群体和Q群体的平均等位基因分别为3.7143、5.1786,平均有效等位基因分别为2.1857、4.0028,平均期望纯合度分别为0.5122、0.2814,平均期望杂合度分别为0.4878、0.7186,多态信息含量(PIC)平均值分别为0.4282、0.6606。从个体在微卫星位点的纯合率分析,在E群体中,每个个体的纯合度均小于1.00,说明没有完全纯合的个体。从每个微卫星位点在群体的纯合率分析,除了微卫星位点5476,HLJC118和HLJC81外,其他位点的纯合度以不同的速率得到明显的提高。综上所述,经过减数雌核发育方法,ENU诱变草鱼群体的各微卫星位点的纯合度以不同的速率得到提升,遗传多样性明显降低,此方法可以获得纯合度较高的雌核发育ENU诱变草鱼个体,为ENU诱变草鱼良种选育提供了重要的遗传数据资料。     

Use of microsatellite loci and AFLP markers to verify gynogenesis and clonal lines in Nile tilapia Oreochromis niloticus L.

To develop an effective system for parentage analysis in gynogenetic and clonal progeny of Nile tilapia, Oreochromis niloticus L., polymorphic microsatellite loci and amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) were investigated in several gynogenetic families and clonal lines. Six microsatellite loci were screened in two meiotic gynogenetic families to look for loci with high gene–centromere recombination rates, which can be used to discriminate meiotic from mitotic gynogenetics. Microsatellite loci UNH189 and UNH211 showed 96.7% and 92.0% heterozygosity, respectively, in these families, while other loci showed lower recombination frequencies. Scoring both UNH189 and UNH211 would give a very low probability of an individual meiotic gynogenetic being homozygous for both loci. Multiplex polymerase chain reaction of microsatellite loci was used to verify parentage in four families of mitotic gynogenetics and five fully inbred clonal lines. The genotype of each clonal line should serve as a unique identifier. Twelve AFLP primers were also investigated and 26 diagnostic AFLP bands were identified to follow inheritance in mitotic gynogenetic individuals. Amplified fragment length polymorphisms were found to be effective for this purpose but microsatellites were more appropriate since they are co‐dominant, while AFLPs are dominant markers. A multiplex of the microsatellite loci used in this study would be useful for general parental assignment as well as for the analysis of the products of chromosome set manipulations.     

牙鲆回交、全同胞近交及其亲本家系的微卫星研究

应用10对微卫星引物对2007年建立的抗病家系之一(将其定义为亲本家系)及其回交家系和全同胞近交家系进行分析,结果发现10个位点的等位基因数为1.7～3.0,平均等位基因数为2.3,有效等位基因数为1.553 2～2.887 8,平均有效等位基因数为2.054 1,杂合度观测值为0.307 0～0.664 8,平均杂合度观测值为0.487 0,无偏期望杂合度值为0.200 0～0.606 8,平均无偏期望杂合度值为0.606 8,多态信息含量为0.233 4～0.579 4,平均多态信息含量为0.399 5,3个家系均为中度多态,多态信息含量从大到小依次为:亲本家系、回交家系、全同胞近交家系,其中Poli194TUF位点在全同胞近交家系中发生纯合.家系间的遗传分化系数为0.067 1,表明遗传变异有6.71%来自于家系间,家系间分化较低.根据家系间的遗传距离,利用UPGMA法进行聚类,亲本家系和全同胞近交家系聚为一类.全同胞近交家系纯化基因速率较快,适合牙鲆品系的快速建立.     

Genetic variability in meiotic gynogenetic muskellunge,Esox masquinongy (Mitchell), estimated from segregation of microsatellite alleles

Muskellunge, Esox masquinongy, is an important recreational freshwater fish native to North America. Since muskellunge populations are often maintained through stocking efforts, advances in muskellunge reproductive technologies are of direct relevance to fishery enhancement. We evaluated the efficiency of inbreeding through induced meiotic diploid gynogenesis. Eggs from six female muskellunge were manually stripped and activated using ultra violet‐irradiated yellow perch, Perca flavescens, sperm. Hydrostatic pressure shocking regimes (48 263 kPa) were then applied to the eggs to prevent second polar body expulsion producing unambiguous meiotic gynogens. Six female dams and samples of 12–20 of their gynogenetic progeny were genotyped at seven polymorphic microsatellite loci. Chromosomal recombination frequencies of microsatellite loci based on retention of heterozygosity among gynogens ranged from 0.043 to 0.839 (0.576 ± 0.237). There were no statistical differences in recombination frequency among females at any of the loci. The average inbreeding coefficient (F‐value) ranged from 0.581 to 0.979, equivalent to three to fourteen generations of full‐sibling crosses respectively. The average F‐value overall was 0.712, equivalent to between five and six generations of full‐sibling crosses. Centromere map distances of the seven microsatellite loci ranged from 2.15 to 41.95 cM and meiotic gynogenesis was useful in eliminating heterozygosity at loci proximal to the centromere, but not distal. Since the age at maturity of female muskellunge is approximately 5 years, gynogenesis may pose an expeditious alternative to traditional breeding strategies for creation of homozygous pedigrees for some loci that may be outcrossed to introduce positive heterozygosity effects in the offspring.