黄带拟鲹qRT-PCR内参基因筛选及验证

实时荧光定量PCR (qRT-PCR)是研究基因表达的一种广泛使用且有效的方法,选用黄带拟鲹(Pseudocaranx dentex)合适的内参基因,是qRT-PCR技术获得该物种基因表达可靠结果的关键。本研究首先测定了9个常用内参基因(β-actin、RPL13、EF-1α、GAPDH、HPRT、PPIA、β2M、TUB和PP2A)在黄带拟鲹成鱼组织中的表达丰度;同时,利用BestKeeper、NormFinder、geNorm和RefFinder 4种模型预测了内参基因的表达稳定性,发现其表达稳定性排序为RPL13 >EF-1α > PP2A >HPRT >PPIA >TUB >β2M >β-actin >GAPDH。进一步通过定量检测目标基因myod1在不同组织的表达情况,验证上述预测结果的准确性。研究发现,RPL13和EF-1α单独或联合作为黄带拟鲹qRT-PCR内参基因,可显著提高目标基因表达量检测结果的稳定性与可靠性。结果表明,RPL13和EF-1α可作为黄带拟鲹不同组织qRT-PCR分析的内参基因。同时,也证实了并不是管家基因的表达在所有物种中都具有良好的稳定性,需要根据实际情况筛选适宜的内参基因。本研究结果可为后续黄带拟鲹功能基因表达特征的研究提供技术支撑,有望适用于其他鲹科鱼类。     

17α, 20β 双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟相关基因表达内参基 因的筛选

本研究检测了18S rRNA(18S)、28S rRNA(28S)、组织蛋白酶Z(cathepsin Z,CTSZ)、延伸因子1-α(elongationfactor 1-α,EF-1α)、3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gapdh)、β肌动蛋白(β-actin)6个候选内参基因在17α,2β双羟孕酮(DHP)诱导鲤(Cyprinus carpio)卵母细胞最终成熟过程的表达情况,并应用不同的内参分析软件对数据进行了分析.Bestkeeper软件分析表明EF-1α的变异系数和标准差是6个候选内参基因中最低的,且Bestkeeper指数在6个候选内参基因中最高,说明其表达稳定性最高,适合做为内参基因;geNorm软件分析认为需要同时使用EF-1α和CTSZ两个内参基因来校正目标基因的表达;NormFinder软件分析同样表明EF-1α是6个候选内参基因中表达最稳定的;最后通过RefFinder软件综合比较分析,确定EF-1α相对于其他5个候选内参基因,在17α,20β双羟孕酮诱导卵母细胞最终成熟阶段表达最为稳定,可作为内参校正17α,20β双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟阶段各基因的表达情况.     

拟穴青蟹不同发育时期胚胎基因表达的内参基因的筛选

为获得适用于研究拟穴青蟹(Scylla paramamosain)不同发育时期胚胎基因表达的内参基因,本研究采用3个内参基因筛选软件geNorm、NormFinder及BestKeeper对微管蛋白α1A(Tuba1a)、核糖体蛋白L13(Rpl13)、泛素(UBQ)、核糖体蛋白S6激酶(Rps6)、精氨酸激酶(Ak)、3-磷酸甘油脱氢酶(gapdh)、28S核糖体RNA(28S)、18S核糖体RNA(18S)和延伸因子1A基因(EF-1α)等9个常用候选内参基因在拟穴青蟹不同发育时期胚胎的表达稳定性进行分析。geNorm分析表明, EF-1α和Rpl13的表达稳定性最高,并且采用2个内参基因同时校正目标基因的定量结果可以达到最优效果; NormFinder分析表明, gapdh和EF-1α是9个候选内参基因中表达最稳定的; BestKeeper分析表明,gapdh的标准偏差和变异系数是9个候选基因中最低的。综合3个内参基因筛选软件,可以选用EF-1α,或选用EF-1α和gapdh双内参同时校正拟穴青蟹不同胚胎发育时期各基因的表达情况。     

脊尾白虾GAPDH基因的克隆及其内参基因稳定性分析

为比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-actin基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)作内参基因的优劣,本研究采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾GAPDH基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KX893516),通过实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPT-PCR)技术,检测3种基因在脊尾白虾不同组织及不同蜕壳后时间点的表达量变化,在此基础上进行内参稳定性分析。结果显示,脊尾白虾GAPDH基因全长1514 bp,开放读码框1002 bp,编码333个氨基酸,二级结构预测显示GAPDH蛋白具有一个高度保守的NAD~+结合功能域(NAD binding domain)和行使糖运输和代谢的催化功能域。分析qRT-PCR结果并结合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种软件的分析发现,在不同组织和不同蜕壳后时间点,3种内参基因的稳定性由高到低依次为18S r RNA、GAPDH、β-actin。因此,在脊尾白虾不同组织和不同蜕壳后时间点的定量分析中,选取单内参基因时,推荐使用18S rRNA为内参基因,双内参时推荐18S rRNA和GAPDH,而18S rRNA、β-actin和GAPDH在其他生理条件下作内参基因的稳定性还有待进一步研究。     

内参基因在虾夷扇贝定量PCR中表达稳定性的比较

应用实时荧光定量技术,检测虾夷扇贝的β-actin、Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogen-ase、α-tubulin、Cytochrome b5、TATA box binding protein-associated factor、Elongation factor 1α共6个内参基因在饥饿胁迫下各组织、致病菌感染前后和水环境升温前后不同时间段血样中的mRNA表达情况。经geNorm程序统计分析,6个内参基因在上述处理中的表达稳定性存在差异,导致不同处理中适用的内参基因有所不同。为进一步开展虾夷扇贝基因表达的定量研究奠定了基础。     

异育银鲫中鲤疱疹病毒Ⅱ型载量测定方法的建立

异育银鲫是我国重要的淡水养殖品种,但是鲤疱疹病毒Ⅱ型对其造成了重大经济损失,该病毒致死率几乎可以达到100%。为了能够有效预防和控制该病毒,需要建立一种高效灵敏的定量方法。为此,本实验室根据CyHV-16基因序列设计引物,利用SYBR Green法建立了异育银鲫中鲤疱疹病毒Ⅱ型Realtime PCR方法,可以定量鲫鱼体内疱疹病毒载量,绘制了标准曲线,根据各个组织中病毒的拷贝数分析出该病毒在不同组织中的表达分布,其中脾、肾组织中表达量较高,鳃、肝、肠、肌肉等组织中表达量较低。这些数据为预防和控制异育银鲫Ⅱ型疱疹病毒奠定了实验和研究基础。     

合浦珠母贝实时定量PCR内参基因的稳定性比较

以合浦珠母贝（Pinctada fucata）为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术检测了甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、β-肌动蛋白（β-actin）和18S核糖体rRNA（18S rRNA）3个管家基因在合浦珠母贝不同组织、性腺发育时期、胚胎发育时期mRNA水平的表达情况。同时比较了BestKeeper、geNorm和NormFinde软件对试验数据处理的差异,从中选出合适的内参基因。结果表明β-actin在不同组织和胚胎发育不同阶段表达最稳定,18S rRNA在性腺发育不同时期表达最稳定。     

中草药饲料添加剂对异育银鲫感染Ⅱ型鲤疱疹病毒的影响

分别用添加1%穿心莲、黄芪、板蓝根、大黄4种中草药的定制饲料投喂异育银鲫,而后腹腔注射1mL定量为1.08×10~7个/mL的Ⅱ型鲤疱疹病毒,研究这4种中草药对异育银鲫感染Ⅱ型鲤疱疹病毒的影响。人工感染后采用实时荧光定量PCR的方法测定血液中的Ⅱ型鲤疱疹病毒滴度。试验结果显示,对照攻毒组鱼体临床症状为胸腹部体表大面积充血,鳃部暗红出血,脾脏肿大、内脏出血等体征,为典型的Ⅱ型鲤疱疹病毒发病症状,且用PCR方法能检测出Ⅱ型鲤疱疹病毒基因组片段。投喂含穿心莲、板蓝根、黄芪、大黄的定制饲料,异育银鲫死亡率分别为15%、30%、35%、95%,对照组死亡率为100%。对照组血液中的病毒滴度高于穿心莲、板蓝根、黄芪,大黄与对照组病毒滴度差别较小。研究结果表明,大黄定制饲料抗Ⅱ型鲤疱疹病毒效果相对较差,黄芪与板蓝根抗病毒效果稍强,穿心莲具有较好的抗Ⅱ型鲤疱疹病毒效果,或可作为抗Ⅱ型鲤疱疹病毒的抗病毒饲料产品用于疾病防控。本研究结果为利用中草药药饵防治异育银鲫感染Ⅱ型鲤疱疹病毒提供了一定的理论依据。     

异育银鲫造血器官坏死症病鱼体内鲤疱疹病毒Ⅱ型的电镜观察与超微病理学特征

为分析患鲫造血器官坏死症异育银鲫Carassius auratus gibelio体内不同器官组织中鲤疱疹病毒(CyHV-2)粒子的形态结构、分布和发生过程,采集患病异育银鲫体肾、脾脏、头肾、肝胰脏、肠道、鳃各组织样本,利用透射电镜观察疱疹病毒和组织细胞超微病理学。在所采集器官组织中均观察到鲤疱疹病毒Ⅱ型的DNA内核、空衣壳、实心核衣壳、含包膜成熟病毒共4种不同成熟时期的病毒粒子,不同时期的病毒粒子直径分别为65~90nm、90~180nm、90~180nm、170~220nm;体肾和脾脏中含有大量的Cy HV-2病毒,而头肾、肝胰脏、肠道和鳃中病毒粒子较少;CyHV-2病毒主要感染体肾、头肾、脾脏的吞噬细胞,导致机体免疫机能改变;组织细胞病理学观察发现吞噬细胞核边缘化,核内染色质变性,核膜溶解,线粒体嵴断裂,出现空泡,个别细胞溶解坏死。通过PCR检测和电镜观察病毒粒子结构特征,确诊异育银鲫感染Cy HV-2病毒,主要器官组织细胞中均有CyHV-2病毒,且在细胞核中完成复制和组装,在细胞质中获得外膜。感染Cy HV-2病毒的异育银鲫主要器官组织均受到一定的损伤。     

利用RT-qPCR技术筛选菊黄东方鲀的最适内参基因

定量PCR技术已经成为基因表达水平测定最常用的方法,选择合适的内参基因对基因表达水平的准确定量至关重要。本文检测了菊黄东方鲀β-actin、GAPDH、EF1-α和18S rRNA等4种内参基因在不同组织、生长环境和发育阶段中的表达,应用3种内参基因筛选软件(geNorm、NormFinder和Bestkeeper)综合分析了这4种内参基因表达的稳定性。结果表明内参基因在成鱼养殖和野生菊黄东方鲀内的稳定性排名均为:EF1-αβ-actin18S rRNAGAPDH;在养殖菊黄东方鲀3月龄、6月龄和12月龄三个发育阶段中内参基因EF1-α最稳定,其他各组织在不同发育阶段内参基因的选择有所差异。研究结果为不同条件下菊黄东方鲀功能基因表达的定量分析提供重要参考。     

三倍体虹鳟实时荧光定量PCR内参基因稳定性分析

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、核糖体大亚基蛋白基因(rplp2)、真核延伸因子基因(ef1-α)、β-肌动蛋白(β-actin)和18S核糖体核酸基因(18S rRNA)等5个候选内参基因在体质量约800 g三倍体虹鳟脑、眼、鳃、皮肤、心脏、肾脏(头肾、中肾、后肾...     

Effect of Chitosan on Intestinal Bacteria of Allogynogenetic Crucian Carp,Carassius auratus gibelio,as Depicted by polymerase chain reaction‐denaturing Gradient Gel Electrophoresis

A 16S rDNA‐based polymerase chain reaction‐denaturing gradient gel electrophoresis (PCR‐DGGE) method was applied to detect intestinal bacterial communities of juvenile allogynogenetic crucian carp, Carassius auratus gibelio, fed with chitosan‐containing diet. This is the first time to use the molecular method to analyze the bacterial communities in the allogynogenetic crucian carp intestine. The DGGE profile with universal bacterial primers revealed simple communities in all treatment groups. Sequencing and phylogenetic analysis of excised DGGE bands showed that the dominant bacteria belonged to class γ‐Proteobacteria and Fusobacteria. The relative abundance and diversity of detected bacteria suggested that 0.5 and 0.75% of chitosan in diet were optimum for juvenile allogynogenetic crucian carp. As in these concentrations, some detected pathogen bacteria either disappeared or decreased. However, the DGGE profile with Aeromonas‐specific primers showed a similar composition among all treatment groups, which suggested that Aeromonas was one of relative stable bacteria components in the intestine of juvenile allogynogenetic crucian carp.     

外源木聚糖酶对异育银鲫生长、超氧化物歧化酶及溶菌酶活性的影响

在基础饲料中分别添加0 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg的木聚糖酶,饲养初始体重6.71 g左右的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)56 d后,研究了木聚糖酶对异育银鲫生长、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶活性的影响。结果表明:添加100 mg/kg木聚糖酶组异育银鲫的增重率和特定生长率最大,显著大于对照组(P<0.05),同时该组异育银鲫的饲料系数最低,显著低于对照组(P<0.05)。添加50 mg/kg和100 mg/kg木聚糖酶可显著提高异育银鲫血清、脾脏、肝胰脏、头肾SOD活性以及血清、头肾、脾脏溶菌酶活性。     

5种药物对异育银鲫"中科3号"受精卵孵化的影响

在水温21~23℃,pH 6.2~6.5条件下,采用半静水试验法,按等对数间距设置药物质量浓度梯度,日换水50%,补充药物50%,24 h观察记录1次,比较美婷Ⅱ、霉灵、纳他霉素、杀毒矾和高锰酸钾5种药物对异育银鲫"中科3号"受精卵水霉抑制作用及孵化率的影响。试验结果显示,试验药物对受精卵水霉生长均有一定抑制作用,其抑霉率为美婷Ⅱ>霉灵>高锰酸钾、纳他霉素和杀毒矾,但杀毒矾对异育银鲫"中科3号"受精卵的毒副作用较大,显著降低了受精卵孵化率,不宜使用;美婷Ⅱ、霉灵、纳他霉素和高锰酸钾对异育银鲫"中科3号"受精卵的适宜使用质量浓度分别为4.90~6.50、1.97~3.87、1.50、2.50 mg/L,使用方法为长时间浸浴,可有效抑制受精卵孵化过程中水霉的生长,显著提高受精卵孵化率,适合在异育银鲫"中科3号"受精卵孵化过程中使用。     

异育银卿口服葡萄糖后血糖、血脂和肝糖原的变化

禁食 4周后对体重为 46± 5g的异育银鲫进行了葡萄糖耐量试验。口服 16 7mg·(10 0g) -1体重的葡萄糖之前及之后的 1、2、3、4、5、6、8、10、14、18和 2 4h分别抽血、取肝胰腺 ,分析血糖、血脂和肝糖原含量。实验结果表明 ,血糖在口服葡萄糖后 3h内迅速升高 ,并于 3h时达最高水平 ,以后逐渐下降。口服葡萄糖后 1h血脂含量最高 ,然后开始下降 ,并于 8h时又开始升高。口服葡萄糖后的最初 2h内肝糖原含量显著降低 ,随后开始提高 ,并在 6h时达最高峰。用体重为 (16 4± 12 )g的异育银鲫为材料禁食 4周后灌喂不同剂量的葡萄糖 ,研究葡萄糖剂量对血糖和肝糖原变化规律的影响。结果表明 ,随着口服葡萄糖剂量的增加 ,血糖升高幅度加大 ,而肝糖原含量则随葡萄糖剂量增加而减少。上述实验结果提示异育银鲫在胰岛素的分泌方面与哺乳类存在本质的不同。     

三种鲫鱼对暴发性鱼病的抗病力

本文报道彭泽鲫、异育银鲫及白鲫对嗜水气单胞菌引起的暴发性鱼病抗病力的研究结果。在菌液浓度为6.0×10~6个/ml,注射剂量为0.3ml/尾时,半数致死量(LD_(50))分别为彭泽鲫 10~(-1.?),异育银鲫 10~(-1.61),白鲫 10~(-2.21),差异极显著(P<0.01)。从三个方面进一步研究了造成以上差异的机理:(1)补体总量——彭泽鲫 6.40 单位/ml,异育银鲫 5.97 单位/ml,白鲫 2.20 单位/ml,差异极显著(P<0.01);(2)补体替代途径(C_d 旁路)杀菌能力——彭泽鲫和异育银鲫极显著优于白鲫(均值多重分析 D>D_(0.01)),彭泽鲫好于异育银鲫,但差异不显著;(3)白细胞吞噬功能——三种鲫鱼间存在极显著差异(P<.01),吞噬百分率是彭泽鲫极显著优于白鲫和异育银鲫(D> D_(0.01)),吞噬指数是彭泽鲫和异育银鲫显著优于白鲫(D>D_(0.05))。彭泽鲫是对暴发性鱼病抗病力较强的品种,白鲫是对暴发性鱼病抗病力最差的品种。     

异育银鲫耗氧率和窒息点的研究

为了解昼夜变化、体重及水温对异育银鲫耗氧量、耗氧率和窒息点的影响，应用流水呼吸室法和静水呼吸室法分别测定异育银鲫在不同条件下的耗氧量，结果表明：异育银鲫日间平均耗氧高于夜间平均耗氧，耗氧量随体重增加而增加，呈显著正相关关系；而耗氧率和窒息点随体重增加而减少，呈显著负相关关系，耗氧量、耗氧率、窒息点随水温增加而增加，呈正相关关系。