坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

蛋白质样品的制备是双向电泳分析的关键。为探索适用于坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品的制备方法,实验对3种常用植物蛋白质分离方法进行了优化和改进,并分别同3种蛋白质裂解液联用,比较了9种方法的总蛋白质得率及双向电泳图谱效果。结果发现,采用三氯乙酸/丙酮沉淀法与裂解液C(7 mol/L 尿素,2 mol/L 硫脲,2%CHAPS,2%TritonX-100,2% IPG Buffer pH 3~10,65 mmol/L DTT)联用的方法,坛紫菜叶状体的蛋白质得率最高,且双向电泳图谱显示此法获得的蛋白质点数最多,蛋白点形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。实验结果还发现,在进行双向电泳分析时,采用pH 4~7的胶条可以使坛紫菜叶状体蛋白质得到更为有效的分离。     

海带蛋白的提取和活性研究

采用5%NaOH、0.15 mol/L NaCl、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液、0.15 mol/L NaCl及0.06%纤维素酶和1%SDS溶液提取新鲜海带中的蛋白质,并采用Brrddford的方法测定提取的蛋白质含量.结果表明,采用5%NaOH 0.06%纤维素酶浸泡,然后经超声波破碎,离心取上清液进行100%饱和度的(NH4)2SO4沉淀,对所得沉淀透析后冻干所得海带蛋白质的含量较多.时间飞行质谱表明蛋白质分子量为872～7705 m/z.抑菌试验表明海带蛋白对大肠杆菌、产气杆菌、金色葡萄球菌具有抑制作用.同时,以海带蛋白(5 mg/kg)对高血压模型大鼠灌胃具有良好的降压作用.     

海参中单糖检测方法的建立及含量测定

本研究建立了高效阴离子交换–脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)分析海参(Apostichopus japonicus)多糖的单糖组成及含量测定。通过比较3种蛋白去除法对海参多糖含量的影响,优化海参多糖纯化方法;比较淋洗液浓度对单糖分离效果的影响,优化海参中单糖分离的色谱条件。结果显示,Sevag法去蛋白的效果最好,在淋洗液为20 mmol/L Na OH的条件下分离岩藻糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖和乳糖;在淋洗液为160 mmol/L Na OH和200 mmol/L Na AC的条件下分离葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。各单糖标准曲线的线性相关系数不低于0.998,检出限为2.5~50μg/L,加标回收率在83.6%~113.1%之间。该方法可测定海参多糖的中性糖、氨基糖和糖醛酸,可作为海参及其制品中的单糖分析及定量方法,为相关标准的制定提供参考。     

大菱鲆表皮蛋白质组双向电泳技术的建立及优化

通过对表皮蛋白质提取方法、不同裂解液配方、等点聚焦程序和上样量等条件的对比试 验,建立及优化了大菱鲆表皮组织蛋白质的双向电泳体系.试验采用改良的TCA/丙酮和超声波提取相结合的方法提取大菱鲆表皮组织的全蛋白,裂解液配方根据Bio-Rad公司推荐的进行调整,使用17 cm pH 4～7的IPG胶条被动水化上样,上样量为250μg.等点聚焦程序采用30 V线性6 h、250V线性2.5 h、500 V线性1.5 h、1 000 V快速2 h、4 000 V线性3 h、8 000 V快速3 h、8 000 V线性1 h、500V 24 h,凝胶银染后用Image Master 2D Platinum 7.0软件进行分析,最终得到较满意的双向电泳图谱,具有较高的分辨率和重复性,为大菱鲆蛋白质组学的进一步研究奠定了基础.     

鸭绿沙塘鳢精子生理学特征

为探究鸭绿沙塘鳢(Odontobutis yaluensis)精子生理学特征, 提高精子活力, 测定了其精液浓度、精子密度、 pH 和精子活力, 以精子激活率(activation rate, AR)、快速运动时间(fast movement time, FT)以及精子寿命(life time, LT)作为评价精子活力的指标, 检测了水温、pH、离子(NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂)、非离子(葡萄糖、Tris、甘油)、 碱度(NaHCO₃)共 10 种单因子条件下的精子活力, 并在此基础上进行 17 组复合因子精子激活液的筛选。结果表明, 鸭绿沙塘鳢精巢前段精子活力、精子密度、精液浓度均高于中后段, 精巢整体精子密度(1.83±0.03)×10⁹ 个/mL, 精液浓度 23.10%, pH 6.9±0.1。单因子精子激活液中, 鸭绿沙塘鳢在水温 20 ℃、pH 6.0、NaCl 68 mmo/L、 KCl 54 mmol/L、CaCl₂ 27 mmol/L、葡萄糖 28 mmol/L、甘油 65 mmol/L 条件下精子 AR, FT 和 LT 均最高, 在 MgCl₂ 11 mmol/L、Tris 4 mmol/L 激活液中精子激活率最高。复合因子精子激活液中, 精子在 KCl 40 mmol/L、甘油 33 mmol/L、Tris 4 mmol/L 条件下 AR, FT 和 LT 均最高, 精子活力最高。综上所述, 在进行鸭绿沙塘鳢人工授精时, 可直接使用精巢前段(生精部), 同时应用复合因子精子激活液(KCl 40 mmol/L、甘油 33 mmol/L、Tris 4 mmol/L)提高精子活力。     

栉孔扇贝精子膜蛋白的提取分离及初步鉴定

通过SDS-PAGE电泳,从提取液的倍数、提取时间、Triton X-100的浓度、SDS的有无等4个方面对提取条件进行优化,确定栉孔扇贝精子膜蛋白的最佳提取条件是:将精液150g离心去除精原细胞,0·1mol/L PBS缓冲液清洗两次,0·1mol/L Tris-HCl缓冲液清洗两次,3000g离心10min(4℃)得精子悬液;然后向精子悬液中加入3倍体积含1%Triton X-100和0.1%SDS的膜蛋白提取液中冰浴振摇1·5h;4℃,50000g离心15min,收集上清精子膜蛋白溶液。SDS-PAGE电泳后,考马斯亮蓝R-250染色检测出22种膜蛋白,分子量在23~156kDa之间,PAS染色检测出糖蛋白有13种,苏丹黑B染色检测出脂蛋白有12种,其中既为糖蛋白又为脂蛋白的有8种。此研究结果可为以后进一步分离纯化栉孔扇贝的精子膜蛋白,研究其在精子发生和受精过程中的功能及作用提供基础资料。     

对虾组织样品中RNA的铵盐常温保存法及其效果

本研究以凡纳滨对虾为研究对象,取其肌肉组织28℃下保存于不同饱和度和不同pH的铵盐保存液中,保存一定时间后,通过组织总RNA提取、RT-PCR法及荧光定量RT-PCR法鉴定比较选择方便有效的保存方法。结果显示,从含25mmol/L柠檬酸钠和20mmol/L EDTA的饱和醋酸铵保存液和饱和硫酸铵保存液中保存的组织中提取的RNA较完整。通过调节pH进行保存液的优化,提取RNA后的凝胶电泳、RT-PCR及荧光定量RT-PCR确定的基因拷贝数显示,从含25mmol/L柠檬酸钠和20mmol/L EDTA的饱和醋酸铵保存液（pH 6.0）和饱和硫酸铵保存液（pH 5.2）保存的组织中能成功地提取出大量的RNA,且RNA分子完整;通过荧光定量RT-PCR法显示新鲜组织的18S rRNA拷贝数为107Copies/mg组织,保存28d后的组织18S rRNA拷贝数可达到105Copies/mg组织,而空白对照组的18S rRNA拷贝数只有103Copies/mg组织。说明保存液对于抑制核酸降解有较好的效果。这种简便有效的保存液为样品的保存、现场采集标本及后续的分子实验奠定了基础。     

镉在海藻中的化学形态

利用化学试剂逐步提取法研究了紫菜、海带、裙带菜和羊栖菜中镉的存在化学形态。研究结果表明:镉以多种化学形态存在于4种海藻中,1 mol/L氯化钠提取态镉和 2% 醋酸提取态的镉所占比例较大,两者约占总镉含量的76.3%～92.9%。0.6 mol/L盐酸提取态、去离子水提取态和80%乙醇提取态镉所占比例较小,其中乙醇提取态(离子态镉)约仅占总镉含量的0.4%～9.2%,且对于4种海藻,紫菜中的离子态镉所占比例最低(均小于1%)。实验进一步证实以海藻中总镉含量作为检测标准不能准确反映海藻及其制品的食用安全性,因此亟需建立海藻中针对毒性较强的离子态镉的检测标准限量和快速有效的检测方法,以保障我国海藻产业和出口创汇经济的顺利发展。     

史氏鲟精子超低温冷冻保存研究

比较了史氏鲟精子在3种不同配比浓度稀释液的保存效果。试验结果表明,配方Ⅲ作为稀释液,8%甲醇作为抗冻剂,二步法超低温(-196℃)冷冻保存,5h后取出,38℃水浴解冻取得最好的冻后激活率,解冻后激活率为(52.3±3.5)%。解冻精子分别采用井水和激活液D(10mmol/L Tris+10mmol/L NaCl+25mmol/L Glu,pH 8.0)激活,进行人工授精。结果显示配方Ⅲ冻精采用激活液D激活授精获得最高受精率为68.56%,最高孵化率为52.91%。本次试验表明,1～2mmol/L范围内,低浓度K+比高浓度K+对史氏鲟精子保存有利;52～82mosmol/kg范围内,高渗稀释液有利于史氏鲟精子的保存;且激活授精方法是影响冻精受精率和孵化率的关键因素之一。     

缢蛏蛋白组分Y3的提取及抑癌活性研究

以新鲜缢蛏Sinonovacula constrzcta为材料,经25 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5,含0.14mol/L NaCl)缓冲液提取缢蛏粗蛋白、透析、DEAE离子交换层析、Sepharose CL-6B凝胶层析,得到1种具有抑癌生物活性的缢蛏蛋白组分Y3.SDS-PAGE电泳测得该蛋白组分的分子量约为64 kD.采用MTT比色法检测Y3对4种肿瘤细胞增殖的影响.结果显示,Y3对Hela和BGC803细胞有明显的抑制作用,而对SKOV3和HepG2抑制作用不明显.此外,探讨了Y3对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力.结果显示,该蛋白组分清除自由基的能力很强,在浓度为100 μg/ml时,Y3对羟基自由基清除率达到92.71％.在3μg/ml下,对超氧阴离子自由基的清除率达到59.73％.     

刺参肠组织蛋白质双向电泳体系的建立及优化

以刺参肠组织为材料,通过蛋白质提取方法、上样前处理方法、上样量以及聚焦条件的优化,建立了刺参肠组织蛋白质双向电泳技术体系.试验结果表明,采用TCA-丙酮沉淀法制备刺参肠组织蛋白质,能够得到高纯度的蛋白质提取液.刺参样品上样前不经过处理,等电聚焦电压1 000V,电流7mA,聚焦时间3h,平衡时间30min,最佳上样量25μg,pH 4～6.5、8.5cm的IPG胶条,银染能获得较好的双向电泳图谱.通过蛋白质双向电泳体系的优化,获得了刺参肠组织的蛋白质表达图谱,为进一步研究刺参差异表达蛋白的筛选及蛋白质组学研究提供技术保障     

鲤脑垂体和HCG诱导雌性日本鳗鲡性腺成熟过程中血清生化成分的变化

使用鲤脑垂体和HCG对雌性日本鳗鲡人工催熟,用临床医学检验方法,测定分析了雌性日本鳗鲡卵巢发育过程中,血清总蛋白(TP)、血清甘油三脂(TG)、血清胆固醇(TC)、血糖(Glu)、血钙(Ca)和血清无机磷(P)6项生化指标的水平及变化趋势,并与对应的不同卵巢发育阶段的性腺成熟系数(GSI)进行比较分析。结果表明,84d的注射过程中,实验组的性腺逐渐成熟,GSI显著升高,第12针时达到46.32%±1.75%;而对照组性腺GSI一直在2.42%±0.18%。实验组和对照组血清TP水平相对平稳,各组变化无显著差异(P>0.05)。实验组和对照组血脂在56d前差异显著(P<0.05):实验组血清TG,TC一直维持较高水平,平均分别为(12.67±2.83)mmol/L和(15.54±3.01)mmol/L;对照组TG和TC一直下降且水平较低,平均分别为(6.33±4.14)mmol/L和(8.53±3.30)mmol/L。实验组和对照组血清Glu均在实验初的较低水平基础上持续上升。相关分析表明,实验组血清TG与GSI水平极显著负相关(r=0.732,n=6,P<0.01)。实验组血清Ca与GSI(r=0.961,n=6,P<0.01),血清P与GSI(r=0.775,n=6,P<0.01)都呈现出极显著的相关性:血清Ca和P在28d后持续上升,GSI逐渐增大。对照组中的血清Ca和P水平则一直维持在一个较低的水平。研究结果表明:雌性日本鳗鲡卵巢发育与其脂类代谢密切相关,无机离子(Ca,P)在此过程中起到重要作用。利用繁殖鱼体营养代谢特点,检测日本鳗鲡血脂或血清Ca和P水平,可成为初步判断雌性日本鳗鲡发育情况的新方法。     

鲑鱼肉和饲料中类胡萝卜素的分析方法

鱼肉和饲料中的虾青素分析方法对于研究鲑鱼肉色质量及饲料对其影响至关重要。本研究建立了北极红点鲑鱼肉类胡萝卜素的正相高效液相色谱分析方法。该方法采用正己烷与异丙醇等度洗脱(93∶7,体积比),流速1.1mL/min,可实现18min内4种常见鲑鱼类胡萝卜素包括虾青素、角黄素、β-胡萝卜素和玉米黄素的有效分离。研究结果显示,虾青素的回收率和变异系数值分别为97%和1.5%。正己烷和异丙醇复合溶剂提取的鱼肉样品与丙酮提取并经氨基固相萃取小柱纯化后的鱼肉样品的虾青素含量接近,但比丙酮提取样品中虾青素含量略低。正相高效液相色谱法和分光光度法测定鱼肉虾青素含量分别为1.43mg/L和2.43mg/L。研究同时建立了鲑鱼饲料虾青素分析方法。研究结果表明,-80℃冷冻结合氨基固相萃取小柱纯化可去除饲料样品中的大部分脂肪。饲料中虾青素酯皂化的最佳条件为:0.10mol/L甲基化氢氧化钠,22℃,20min;或者0.12mol/L甲基化氢氧化钠,4℃,3h。研究结果表明,两种方法可用于鲑鱼肉和饲料中的虾青素分析,为相关研究带来方便。     

Optimization of cultivation conditions for enhancing biomass,polysaccharide and protein yields of Chlorella sorokiniana by response surface methodology

On the basis of multiple single‐factor studies, the best conditions for each factor were selected by comparison. Taking the biomass, polysaccharide and protein yields of chlorella as response values, the four‐factor and three‐level response surface design experiment was performed on four parameters that significantly affected the response values to further determine the optimal conditions. The optimal parameters of the culture process were nitrogen source (urea), carbon source (sodium carbonate), nitrogen concentration (15.80 mmol/L), carbon concentration (0.36 mmol/L), phosphorus concentration (0.2 mmol/L), magnesium concentration (0.33 mmol/L), calcium concentration (0.25 mmol/L), iron concentration (0.02 mmol/L), initial pH (7.0), inoculation amount (6%) and ventilation capacity (40 L/hr). According to this process, the biomass, polysaccharide and protein yield of Chlorella sorokiniana obtained from indoor culture were close to the predicted value, which were more than three times as much as before, reaching 3.58, 0.52 and 0.46 g/L respectively. Chlorella sorokiniana, which was cultured outdoor according to the optimized process, increased its biomass, polysaccharide and protein yield by more than 1.5 times. Chlorella sorokiniana was significantly different before and after optimized culture. This provides a good source for the research of polysaccharide and protein of C. sorokiniana and helps the further study of its structure and biological activity, which makes the further development of its function more possible.     

4种金属离子对宝石鲈蛋白酶活性的影响

以酶学方法研究了K+、Na+、Mg2+、Ca2+ 在浓度为50、100、150、200、250、300 mmol/L时,对宝石鲈消化器官(胃、幽门盲囊、肝脏、前肠、中肠、后肠)蛋白酶活性的影响.试验结果表明,K+、Na+对宝石鲈消化器官蛋白酶活性具有一定的促进作用,100 mmol/L时促进作用最明显;Mg2+、Ca2+对蛋白酶活性具有抑制作用,300 mmol/L时抑制作用最大;蛋白酶在宝石鲈各消化器官的分布为前肠＞幽门盲囊＞中肠＞胃＞肝脏＞后肠.宝石鲈配合饲料中添加100 mmol/L的K+、Na+可提高其消化器官的蛋白酶活性.     

长期碳酸盐碱度胁迫对脊尾白虾生长及卵巢发育的影响

为探讨碳酸盐碱度对脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）生长及卵巢发育的影响。本研究设置3 mmol/L（对照组）、5 mmol/L和8 mmol/L 3种碳酸盐碱度梯度养殖脊尾白虾60天,比较不同碳酸盐碱度胁迫对脊尾白虾生长性能、组织结构、酶活性以及卵巢发育的影响,结果显示：5 mmol/L组与对照组体长增长率、体重增长率以及成活率差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组体长增长率、体重增长率以及成活率显著低于对照组（P<0.05）。肝胰腺组织切片显示,5 mmol/L组中部分B细胞体积增大,部分转运泡内出现颗粒物质,8 mmol/L组管腔的形态结构严重变形。鳃组织切片显示,5 mmol/L组出现轻微鳃丝肿大现象,角质层略有变形,且角质层下间隙扩张变长,上皮细胞与支柱细胞排列紊乱;8 mmol/L组鳃丝肿大,排列不规则,出现血细胞肿胀现象,鳃丝上皮细胞严重破坏,毛细血管网结构形态改变,角质层下间隙变形。肌肉组织酶活性测定结果显示,5mmol/L组的碳酸酐酶活性显著高于对照组（P<0.05）,Na+/K+-ATP酶活性在肌肉中差异不显著（P>0.05）;肝胰腺组织酶活性测定结果显示,碳酸酐酶在肝胰腺组织中差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组Na+/K+-ATP酶活性显著低于其他组（P<0.05）,鳃组织中,5 mmol/L和8 mmol/L组鳃组织中和Na+/K+-ATP酶活性均显著高于对照组（P<0.05）,且两组间差异显著。卵巢发育统计结果显示,三组脊尾白虾卵巢均能发育,其发育至Ⅱ期的百分比分别为20.51%、10.52%和6.25%,其中5 mmol/L组与对照组间无显著差异（P>0.05）,8 mmol/L组显著低于对照组（P<0.05）;3 mmol/L组和5 mmol/L组均有卵巢发育至Ⅲ期的脊尾白虾,但两组差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组未见有卵巢发育至Ⅲ期的脊尾白虾。卵巢组织切片显示,8 mmol/L组卵原细胞细胞排列疏松,周围滤泡细胞排列疏松且数量较少。综上所述,脊尾白虾可以在低于8 mmol/L的碳酸盐碱度中生长发育,但高碳酸盐碱度可能会造成脊尾白虾鳃和肝胰腺组织损伤,导致其生长受到影响,同时猜测高碳酸盐碱度可能也会影响卵巢的发育速度。     

亚硝态氮胁迫下凡纳滨对虾体内亚硝态氮的积累与能量代谢响应

为探究亚硝态氮胁迫下凡纳滨对虾[体长为(6.8±0.3) cm,体质量为(4.0±0.6) g]体内亚硝态氮的时空分布与能量代谢相关酶活性的响应,实验设置0(对照组)、0.8、4.0和8.0 mmol/L 4个处理组,进行持续96 h的亚硝态氮胁迫实验和12 h的恢复实验。结果显示,凡纳滨对虾死亡率与胁迫浓度呈现显著的正相关性。胁迫6 h内,亚硝态氮在凡纳滨对虾鳃、血淋巴、肠道、肝胰腺和肌肉组织中明显积累,且积累量与胁迫浓度呈现正相关。相同胁迫浓度组,亚硝态氮在对虾鳃中积累最多,肌肉中最少,鳃中的积累量约为肌肉的3倍。Na~+-K~+-ATP酶活性在0.8和4.0 mmol/L组对虾肝胰腺和肌肉中显著升高,而在8.0 mmol/L组的肌肉中显著降低。胁迫各组对虾肝胰腺AMPK活性显著上升,且与胁迫浓度呈现正相关性。恢复期间,除血淋巴(8.0 mmol/L组)外,各组织中亚硝态氮1 h恢复效率均超过50%,且肝胰腺和鳃的恢复效率最高,达到74%以上。血淋巴、鳃、肠道中亚硝态氮恢复到对照组水平的时间最短,均在6 h以内,而水体中亚硝态氮含量显著升高。以上研究表明,胁迫下亚硝态氮会在对虾组织中迅速积累,并引起能量代谢进程的加快;胁迫解除后,积累在体内的亚硝态氮能够迅速排出体外,以减轻毒性影响。本研究结果将为缓解亚硝态氮对养殖对虾毒性效应的研究提供参考。     

太空搭载小球藻（Chlorella vulgaris）子代群体新品系的筛选、培养及其营养组成分析

本文以经过太空搭载返回地面后保存的小球藻（Chlorella vulgaris）藻种T0为实验材料,从提高小球藻生长速度和促进小球藻油脂富集两个方面考虑,对小球藻生长的环境因子和培养基成分进行探讨和研究;最终经过两次筛选获得速长-油脂高产的株系TY31.实验结果表明,小球藻在140 μmol·m-2·s-1光照强度、23℃培养温度、以3.75 mmol/L的NH2 CONH2为氮源、以0.12 mmol/L的K2HPO4为磷源的最佳培养条件下,细胞生长速度加快,生长期变长,蛋白、脂肪及脂肪酸含量增加.研究发现,以第一次筛选的小球藻藻株T9为出发株,采用改良的BG-11培养基进一步选育的速长-油脂高产株系TY31,其最终细胞密度增加11.06×106 mL-1,脂肪含量增加6.50％,脂肪酸含量增加3.76％,具有应用于生物能源研究的潜力,为海洋微藻的开发利用奠定了基础.