闽南地区斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)神经坏死病毒的基因型与分子进化研究

本研究以闽南地区具有典型神经坏死病症状的斜带石斑鱼为材料,采用RT-PCR法对其进行病毒检测,对检测到的阳性序列进行双向测序和构建系统发育树,对病毒颗粒进行分离纯化,并通过分子进化模型分析病毒衣壳蛋白基因所受的选择压力。结果显示,采集到的6个石斑鱼样品均呈NNV阳性,系统树分析发现6个样品的PCR扩增片段均为RGNNV基因型序列,表明闽南地区感染石斑鱼的神经坏死病毒主要为RGNNV基因型病毒;通过PEG法对病毒进行分离提纯,获得直径为25~28 nm、呈二十面立体对称结构的无囊膜病毒颗粒;分子进化分析显示NNV外壳蛋白基因经历了纯化选择,表明病毒在进化过程中没有出现遗传变异并以相对恒定保守的速率进化。     

鱼病毒性神经坏死病病毒（VNNV）不同基因型鉴别方法的建立及在VNN检疫和监测中的应用

从GenBank中查找出乙型野田村病毒组中海水鱼类各病毒的序列,并用Sequencher多重序列比较软件将其分到条纹踢神经坏死病毒(striped jack nervous necrosis virus,SJNNV)组、条纹星鲽神经坏死病毒(barfin flounder nervous necrosis virus,BFNNV)组、红点石斑鱼神经坏死病毒(redspotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)组和虎斑东方纯神经坏死病毒(tiger puffer nervous necrosis virus,TPNNV)组4个基因型的组别中。用DNAsis序列比较软件比较同一基因型各基因序列之间的同源性,均在815％以上;不同基因型之间序列的同源性,均在66％以下。结合Premier引物设计软件和Sequencher序列多重比较软件,设计了4对引物,采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)来鉴别这4个不同的基因型。对从深圳口岸进境的产地为台湾的海水鱼苗和广东、福建两省养殖的主要海水鱼类进行检疫和监测,结果在进境的海水鱼苗中检出有RGNNV基因型的VNNV,在福建和广东省养殖的石斑鱼成鱼和鱼苗的病鱼体内均检测到RGNNV基因型的VNNV,对上述扩增产物基因序列进行比较,相似性均在96．5％以上,推导出的氨基酸序列与玛拉巴石斑鱼神经坏死病毒(MNNV)序列相似性均为100％。     

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测5种养殖石斑鱼的神经坏死病毒

神经坏死病毒(Nervous necrosis virus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原.发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染.2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E. malabaricus)、青石斑鱼(E. awoara)、赤点石斑鱼(E. akaara)和云纹石斑鱼(E. moara)中检出5个神经坏死病毒分离株.检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%.对这些病毒的RT-PCR产物421 bp核酸进行了测序和序列分析,其相同的序列超过99%.将这些序列与GenBank的石斑鱼(Epinephelus spp.)神经坏死病毒相关基因序列作比较,同源性在97%以上.对神经坏死病毒在石斑鱼体内的分布也进行了分析,在脑和眼组织的检出率最高,部分病鱼的肝、脾和肾组织也能检出病毒.结合流行病学特征,可确认神经坏死病毒为该传染病的主要致病原.RT-PCR方法是检测NNV等病原的一种理想的诊断方法.     

谷氨酰胺对斜带石斑鱼GF-1细胞中C-Myc蛋白的表达与神经坏死病毒复制的影响

为探讨C-Myc表达、谷氨酰胺代谢和神经坏死病毒复制三者之间的关系,本研究首先克隆了斜带石斑鱼鳍条细胞(GF-1)中的C-Myc基因(GF-1-C-Myc),结果显示GF-1-CMyc基因cDNA全长814 bp,开放阅读框(ORF)为285 bp,编码95个氨基酸(aa),有亮氨酸拉链结构域与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域。实验表达和纯化了GF-1-C-Myc蛋白,并制备其多克隆抗体。采用实时定量PCR技术(qRT-PCR)与免疫印迹法(WB)检测了GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒的复制。结果显示,缺乏谷氨酰胺会同时抑制GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒(NNV)的复制,添加谷氨酰胺可同时促进GF-1-C-Myc的表达和NNV的复制;此外,NNV感染可上调GF-1-C-Myc基因的表达,并显著消耗GF-1细胞培养液中的谷氨酰胺。研究表明,GF-1-C-Myc基因可调控宿主谷氨酰胺代谢,从而有利于神经坏死病毒的复制。本结果为防控NNV的感染提供了参考。     

斜带石斑神经坏死病毒外壳蛋白基因克隆与序列分析

从患病毒性神经坏死病的斜带石斑鱼(Epinephelus coioids)的头部提取总RNA，根据已发表的神经坏死病毒外壳蛋白基因设计引物进行RT-PCR扩增，得到预期大小的基因片段。将此基因片段转入pET载体进行序列测定和分析，结果表明：编码斜带石斑神经坏死病毒(Orange-spoued grouper nervous necrosis virus，OGNNV)外壳蛋白基因的阅读框核苷酸数为1017bp，编码338个氨基酸；基因的核苷酸序列与野田村病毒科(Nodaviridae)的几种病毒的外壳蛋白基因序列比较结果显示，该病毒与p野田村病毒属(Betanodavirus)中的赤点石斑神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)的同源性最高(99％)，说明该病毒株是RGNNY血清型的成员。     

斜带石斑鱼甘露糖受体基因的克隆表达及其功能

为了研究斜带石斑鱼甘露糖受体(Epinephelus coioides mannose receptor, Ec MR)在抗赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)感染中的免疫功能,实验成功克隆与表达了EcMR。结果显示,EcMR cDNA全长4 793 bp,共编码1 446个氨基酸。Ec MR的蛋白结构域包括1个信号肽(signal peptide)、1个富含蓖麻类β型三叶草结构域(RICIN)、1个Ⅱ型纤维连接蛋白结构域(FNⅡ)、8个串联的C-型凝集素样结构域(CLECTs)以及1个跨膜结构域(transmembrane region)。实时定量PCR(qRTPCR)和细胞免疫荧光(IF)分析结果显示,Ec MR在斜带石斑鱼的8个组织中均有表达,其mRNA的相对表达量顺序为鳃头肾脑脾脏肝脏外周血心脏肌肉。在研究Ec MR是否参与RGNNV入侵过程中时发现,RGNNV可以在GF-1细胞系中快速增殖,同时显著激活Ec MR的表达。为进一步探究RGNNV对GF-1细胞系的影响,本实验通过双染色法检测了RGNNV感染GF-1细胞系后的细胞凋亡情况,研究表明,RGNNV感染可以促进GF-1细胞系的凋亡,并且细胞凋亡率随着RGNNV感染时间延长而增加。同时,qRT-PCR和酶活性检测结果显示,RGNNV的感染可以显著促进凋亡相关基因的转录水平以及Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的酶活性水平。综上所述,本研究成功克隆了EcMR,并揭示了其在RGNNV入侵过程中一定的相关性。本研究结果将为石斑鱼病毒性疾病的防控提供参考。     

鱼类神经坏死病毒研究进展与发展趋势

神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)是一种世界范围内流行、严重危害多种海水和淡水鱼类的传染性病原。NNV为单一正链、2节段RNA病毒,基因组由RNA1(3.1 kb)和RNA2(1.4 kb)组成。在病毒复制过程中,会合成亚基因组RNA3。RNA1编码RNA聚合酶。RNA2编码衣壳蛋白,为病毒的唯一结构蛋白。RNA3编码B1和B2两种非结构蛋白。根据病毒衣壳蛋白的基因序列,神经坏死病毒可以分成4种基因型,分别为拟鲹、红鳍东方鲀、条斑星鲽和赤点石斑神经坏死病毒基因型。但是,目前只发现A、B、C三种病毒血清型,A对应拟鲹神经坏死病毒基因型,B对应红鳍东方鲀神经坏死病毒基因型、C对应条斑星鲽神经坏死病毒和赤点石斑神经坏死病毒基因型。病毒存在垂直和水平两种传播途径,而且广泛分布于养殖和野生鱼类中。阻断病毒在野生与养殖鱼类之间的传播和开展新型鱼类疫苗研发是将来研究趋势。     

同步检测7种鱼类病毒的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立和应用

淋巴囊肿病毒(LCDV)、肿大细胞病毒属虹彩病毒(Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原,危害巨大。为实现这7种病原的高通量、同步检测,本研究在分析这7种病毒基因序列的基础上,设计了9组扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)引物,并对扩增体系中的Taq酶、Mg2+、dNTP、Primer Mix浓度及退火温度等参数进行调整和优化,结合基因芯片检测技术,建立了同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR体系为：Taq酶(2.5 U/μl)1.0μl,10×PCR Buffer(含20 mmol/L的Mg2+)5μl,dNTP(各2.5 mmol/L)5μl,10×Primer Mix(各2μmol/L)9μl,模板1μl,ddH2O补足至50μl,退火温度为56℃。研究结果显示,该方法可以在1支反应管内对上述7种病毒的9个致病基因同步进行扩增和检测,检测灵敏度分别为101 copies/μl (RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA)、102 copies/μl (LCDV、Mega、IHNV、IPNV)和103 copies/μl (大菱鲆红体病虹彩病毒,TRBIV)。该方法特异性强,与半滑舌鳎、石斑鱼、大菱鲆和牙鲆基因组DNA不产生交叉反应。本研究建立的可同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法具有高通量、高灵敏度、高准确性的优势,能有效提高工作效率,在鱼类病毒的筛查和流行病学调查领域有广泛的应用前景。     

石斑鱼病害防治

本文结合国内外资料介绍了近年来石斑鱼养殖过程中发现的主要疾病及其防治方法，供广大业者参考。 1石斑鱼苗培育过程常见病害 1．1病毒 石斑鱼苗培育过程，极易遭受病毒性病原的侵害，而简称为NNV的病毒性神经坏死症（Nervous Necrosis Virus），是造成石斑鱼苗培育中经常发生的主要病毒性疾病。神经坏死病毒（NNV）主要感染寸苗前期的多种类石斑鱼苗，感染后的鱼体出现异常泳姿，     

鱼类神经坏死病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列，选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针，通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化，建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒，结果只能检测到目的病毒，表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现，其最低检测限可达1．2pg／μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明，其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测，在组内及组间的变异系数分别为0．9％以及1．5％，证实其重复性极好，并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神经坏死病毒检测，结果发现有40份阳性样品。这些结果表明，本研究所建立的实时荧光RT-PCR能对鱼类神经坏死病毒进行准确、快速的检测，具有特异性好、灵敏度高的优点，是开展鱼类神经坏死病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。[中国水产科学，2008，15（3）：506-510]     

一株大黄鱼虹彩病毒的分离鉴定及多克隆抗体的制备

2021年7月,浙江省象山某养殖场养殖的大黄鱼（Larimichthys crocea）出现类似大黄鱼虹彩病毒引起的疾病。采用鲤上皮瘤细胞培养和病毒主要衣壳蛋白测序分析的方法,从患病的大黄鱼中分离到一株病毒。该病毒接种到鲤上皮瘤细胞（EPC）后出现空斑、脱落的细胞病变症状。根据虹彩病毒MCP和ATPase基因保守序列设计特异性引物对病毒组织样本进行PCR扩增,得到分别为1 367 bp和740 bp的目的基因片段。将MCP基因扩增片段测序,经BLAST对比及系统发育树聚类分析,确定该分离的病毒属虹彩病毒科细胞肿大病毒属。通过蔗糖密度梯度离心纯化,用透射电镜观察该病毒粒子呈正六边形,直径为120～150 nm。用纯化病毒作为抗原免疫小鼠获得抗大黄鱼虹彩病毒的多克隆抗体,效价为1∶7 000;通过SDS-PAGE和Western blotting初步确定3个免疫蛋白。本研究为大黄鱼虹彩病毒纯化提供一种新方法,并初步分离出免疫蛋白,为该病毒相关分子生物学研究、蛋白研究以及疫苗制备等提供理论依据。     

神经坏死症病毒对长缟鲹仔鱼的感染及在体内的传播

以长缟鲹(Pseudocaranx dentex)孵化仔鱼为材料，通过神经坏死病毒(Nervous Necrosis Virus，NNV)浸浴感染实验，明确病毒浓度越高，供试鱼被病毒感染的时间越早，病毒检出率越高；运用细胞组织病理学和酶联免疫(Enzyme-1inked immunosorbent assays，ELISA)的原理和方法，了解了神经坏死病毒的侵入、感染和在神经组织中的扩散方式；利用ELISA技术，结合电子显微镜对NNV感染细胞进行超显微观察，确认育苗水环境中神经坏死病毒可水平感染供试鱼皮肤上皮的基底细胞；病毒感染细胞发生细胞质内质网膨胀、细胞核变性、细胞小器官数减少等病理变化；病毒感染细胞质中病毒粒子有散布、类结晶和二者兼有3种存在形式。本研究成果可为了解海水鱼类人工育苗的病毒性神经坏死症感染途径、传播和预防病毒性神经坏死症的发生提供科学依据。     

大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因序列分析及PCR快速检测方法的建立

为了早期快速诊断近年来流行于广东省养殖大口黑鲈(Micropterussalmoides)中的病毒性溃疡综合征,本研究用基因组步移的方法获得了大口黑鲈溃疡综合征病毒(Largemouthbassulcerativesyndromevirus,LBUSV)主要衣壳蛋白(MCP)基因,该基因编码区全长1392bp。通过序列比较分析,在MCP基因内确定了一段241bp的特异性较强的片段作为靶序列,设计并合成引物,经过优化PCR反应条件,建立了可以快速检测大口黑鲈溃疡综合征病毒的PCR方法。实验表明,在PCR进行到30个循环反应时可以检测到的质粒最小浓度是104拷贝数/μL,相当于104个病毒粒子。利用该方法,从天然感染LBUSV的大口黑鲈脾脏组织DNA可扩增出241bp的片段,而健康大口黑鲈和感染了传染性脾肾坏死病毒样病毒的大口黑鲈脾脏组织则没有扩增条带。本研究建立的PCR检测方法具有检测快速、成本低、准确性高的特点,适用于大范围早期病害诊断的推广应用。     

大黄鱼肿大细胞病毒不同毒株的细胞培养及主要衣壳蛋白基因比较

为建立大黄鱼肿大细胞病毒的培养方法,明确其分类地位,用肿大细胞病毒检测呈阳性的大黄鱼幼鱼病料 (FD201807和SA201808)肾组织匀浆液感染鳜仔鱼细胞系 (mandarin fish fry cell line-1,MFF-1)并连续传代,从病料组织匀浆液和细胞冻融液中提取病毒DNA,克隆病毒主要衣壳蛋白基因 (mcp),测序后与NCBI GenBank中的虹彩病毒科肿大细胞病毒属病毒mcp以及2018—2020年所检出的15株大黄鱼肿大细胞病毒mcp进行比对分析。结果显示,病毒传至第4代才可引起MFF-1细胞病变,细胞病变的主要特征为细胞脱壁、变圆、折光度增强;感染时间越长脱壁细胞越多,同时培养液中的颗粒增加;透射电镜下可见感染细胞的细胞质散在大小为130~150 nm的六边形病毒粒子和空壳。感染细胞的病变周期随传代代次的增加而缩短,第15代次的FD201807株感染细胞80%细胞病变的时间为3 d,第15代次的SA201808株感染细胞80%细胞病变的时间为7~8 d。mcp序列比对和聚类分析发现,SA201808株与FD201807株的mcp序列存在21个碱基差异,二者的mcp序列分别与大黄鱼虹彩病毒(large yellow croaker iridovirus, LYCIV) LYCIV-Zhoushan (GenBank: MW139932.1)和花鲈虹彩病毒 (Lateolabrax maculatus iridovirus, LMIV) (GenBank: MH577517.1)相近。15株从大黄鱼病料检出的肿大细胞病毒中,12株的mcp序列与SA201808株聚类;3株与FD201807聚类。本研究利用MFF-1细胞系分离培养了大黄鱼肿大细胞病毒,揭示了大黄鱼肿大细胞病毒存在差异,为更好地了解大黄鱼肿大细胞病毒提供了数据参考。     

引起半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)鱼苗大规模死亡的神经坏死病毒病

2012和2013年,山东某育苗场15–20日龄的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)鱼苗出现暴发性大规模死亡,7 d内死亡率高达90%–100%。本研究调查了疾病的发生情况和临床特征,采集病鱼样品进行了组织病理学检查,并运用RT-PCR方法进行了病原的检测和基因序列分析。结果发现,半滑舌鳎鱼苗一般在7月和8月发病,发病时养殖水温为22–24℃。病鱼游泳行为异常,表现为上下翻游、螺旋性游动、全身大幅度波浪状浮动症状,但病鱼体表无出血和溃疡症状。组织病理检查发现,病鱼脑和视网膜组织出现严重的空泡化及坏死。病鱼样品的RT-PCR检测结果全部呈鱼类神经坏死病毒阳性。对得到的RT-PCR产物测序,进行BLAST比对,发现该病毒与鱼类神经坏死病毒的赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)基因型的相似性达98%以上,而与鱼类神经坏死病毒的其他3个基因型:黄带拟鲹神经坏死病毒(Striped jack nervous necrosis virus,SJNNV)、红鳍东方鲀神经坏死病毒(Tiger puffer nervous necrosis virus,TPNNV)和条斑星鲽神经坏死病毒(Barfin flounder nervous necrosis virus,BFNNV)的相似性仅为71%–78%。由此可以判定,本研究发现的引起半滑舌鳎鱼苗大规模死亡的神经坏死病毒为RGNNV基因型,半滑舌鳎也是鱼类神经坏死病毒的天然宿主。该发现在半滑舌鳎疾病防治和鱼类神经坏死病毒的流行机制研究方面都具有重要意义。     

大口黑鲈肝脾肿大病病原研究

为了查明2009年10月广东省佛山地区养殖大口黑鲈(Micropterus salmoides)中暴发的传染性疾病的病原,对病鱼的肝脏、脾脏和腹隔膜进行切片电镜观察,发现细胞质中有大量病毒颗粒,切面为六角形,直径约145～150 nm,病毒为二十面体对称结构、无囊膜、似虹彩病毒的病毒粒子.用除菌的病鱼组织滤液感染健康大口黑鲈,被感染鱼死亡率达90%以上.根据已知虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因序列设计特异引物,提取人工感染发病鱼的肝脏、脾脏、肾脏组织的DNA进行PCR扩增,将扩增片段进行序列测定与分析,结果表明该序列与已报道的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)MCP基因同源性为98%.电镜观察和MCP基因测序分析结果显示,该病毒的分类地位为虹彩病毒科(Iridoviridae)细胞肿大病毒属(Megalocytivirus).     

引起半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)鱼苗大规模死亡的神经坏死病毒病

2012和2013年,山东某育苗场15–20日龄的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)鱼苗出现暴发性大规模死亡,7 d内死亡率高达90%–100%。本研究调查了疾病的发生情况和临床特征,采集病鱼样品进行了组织病理学检查,并运用RT-PCR方法进行了病原的检测和基因序列分析。结果发现,半滑舌鳎鱼苗一般在7月和8月发病,发病时养殖水温为22–24℃。病鱼游泳行为异常,表现为上下翻游、螺旋性游动、全身大幅度波浪状浮动症状,但病鱼体表无出血和溃疡症状。组织病理检查发现,病鱼脑和视网膜组织出现严重的空泡化及坏死。病鱼样品的RT-PCR检测结果全部呈鱼类神经坏死病毒阳性。对得到的RT-PCR产物测序,进行BLAST比对,发现该病毒与鱼类神经坏死病毒的赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)基因型的相似性达98%以上,而与鱼类神经坏死病毒的其他3个基因型：黄带拟鲹神经坏死病毒(Striped jack nervous necrosis virus,SJNNV)、红鳍东方鲀神经坏死病毒(Tiger puffer nervous necrosis virus, TPNNV)和条斑星鲽神经坏死病毒(Barfin flounder nervous necrosis virus,BFNNV)的相似性仅为71%–78%。由此可以判定,本研究发现的引起半滑舌鳎鱼苗大规模死亡的神经坏死病毒为RGNNV基因型,半滑舌鳎也是鱼类神经坏死病毒的天然宿主。该发现在半滑舌鳎疾病防治和鱼类神经坏死病毒的流行机制研究方面都具有重要意义。     

一株鳢科鱼源弹状病毒的分离及鉴定

为研究近来鳢科鱼类疫病频发的病因,实验对采集的患病杂交鳢病料分别从细菌学和病毒学两方面进行病原分离和鉴定。排除细菌感染的可能后,通过细胞培养技术、回归感染实验、电镜技术、分子生物学技术等进行病毒学分析,最终分离到一株弹状病毒,命名为HSHRV-C1207(Hybrid Snakehead Rhabdovirus-C1207)。实验结果显示,该病毒在EPC、FHM、GSB、SFC、CIK等 8种细胞中都能复制,并对其中6种细胞产生明显的细胞病变效应(CPE)。用分离的病毒进行回归感染实验,可使感染的杂交鳢复制出自然发病鱼的相同症状,且死亡率达90%。感染病料组织液的EPC细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量子弹状病毒聚集,直径约60 nm,长度约为160 nm,形态和排列方式与已报道的鱼类弹状病毒相似。参考OIE中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的检测引物及根据乌鳢弹状病毒(SHRV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)、比目鱼弹状病毒(HIRRV)的G蛋白基因设计特异性引物,分别对自然发病病料组织、接种病料组织的细胞进行RT-PCR扩增,仅针对SCRV的引物能扩增出大小约350 bp 的片段。对HSHRV-C1207株的G基因进行序列测定和分析,结果表明其核苷酸序列同SCRV和SHRV的同源性分别为93.8% 和 20.4%,推导的氨基酸序列同源性分别是93.7%和18.3%。用G基因推导氨基酸序列与其它弹状病毒的G蛋白进行系统进化树分析,表明该毒株与水泡性病毒属聚为一支,其中与SCRV的亲缘关系最近,而与属于诺拉弹状病毒属的SHRV相距甚远,可能为SCRV的变异株或一个新的毒株。     

大黄鱼过氧化氢酶基因的克隆及其对鳗弧菌感染的响应

为探究过氧化氢酶(catalase,CAT)对大黄鱼机体的保护作用,实验基于大黄鱼基因组序列数据库克隆获得CAT基因1584 bp的完整开放阅读框(GenBank登陆号:KKF-14425.1),该序列编码527个氨基酸残基,包含与其他动物高度保守的酶活性中心序列FDRERIPERVVHAKGA、亚铁血红素结合信号序列RLFSYPDTH、3个催化位点残基His75、Asn148和Tyr358,以及12个NADPH结合位点等,理论分子量为59.98 ku,等电点为8.37。多序列比对显示,大黄鱼CAT氨基酸序列与其他鱼类具有较高的一致性,与同属于石首鱼科的军曹鱼和条石鲷同源性高达94%,在进化树中也聚类于同一进化分支,说明该序列为CAT家族成员。实时荧光定量PCR检测显示,大黄鱼CAT基因在所检测的7种组织(肝脏、脾脏、脑、肾、肌肉、鳃、肠)中均有表达,但在肝脏中表达水平最高(为肌肉中的6.68倍)。鳗弧菌感染后,大黄鱼肝组织中CAT基因的表达随着时间的推移而变化明显,感染后12 h,达到最高(7.48倍),随后逐渐下降,到72 h已基本恢复到原始水平,注射PBS的对照组,CAT基因表达只略有上调,说明病原菌侵染可能引起鱼体产生大量活性氧自由基及H2O2,CAT基因则可以清除体内过量的活性氧,进而防止它们对细胞造成损伤。