Construction and characterization of cpsE-and neuA-deleted mutants of Streptococcus agalactiae isolated from Nile tilapia

为探究尼罗罗非鱼无乳链球菌(GBS)荚膜多糖合成基因cpsE和neuA对菌株生物学特性的影响,本研究利用同源重组的方法,构建了GBS的cpsE与neuA的单基因缺失突变株.具体方法为:用Infusion-PCR的方法分别构建带有氯霉素抗性基因的cpsE与neuA基因敲除重组质粒pSET4s-cpsE和pSET4s-neuA.将构建好的质粒电转化入GBS感受态细胞中,通过改变培养温度实现双交换和质粒丢失,最后经氯霉素抗性筛选获得疑似敲除株.通过菌落PCR、RT-PCR及DNA测序等方法对疑似敲除株进行验证.结果显示GBS的两个突变株△cpsE和△neuA被成功构建.在此基础上,通过生物学功能分析比较基因缺失突变株△cpsE、△neuA与野生株在菌株生长速率、荚膜多糖厚度、唾液酸含量和毒力方面的差异.结果发现缺失突变株△cpsE和△neuA的生长速度与野生株无显著差异,但荚膜多糖厚度、唾液酸含量和菌株毒力均显著低于野生株.进一步研究显示,cpsE是鱼源GBS荚膜多糖合成的关键基因,neuA基因则是荚膜多糖唾液酸化的关键基因,它们的缺失导致了GBS荚膜唾液酸含量的降低,且显著降低了菌株的毒力.     

尼罗罗非鱼无乳链球菌基因缺失株ΔcpsE和ΔneuA的构建及其生物学特性

为探究尼罗罗非鱼无乳链球菌(GBS)荚膜多糖合成基因cpsE和neuA对菌株生物学特性的影响,本研究利用同源重组的方法,构建了GBS的cpsE与neuA的单基因缺失突变株。具体方法为:用Infusion-PCR的方法分别构建带有氯霉素抗性基因的cpsE与neuA基因敲除重组质粒pSET4s-cpsE和pSET4s-neuA。将构建好的质粒电转化入GBS感受态细胞中,通过改变培养温度实现双交换和质粒丢失,最后经氯霉素抗性筛选获得疑似敲除株。通过菌落PCR、RT-PCR及DNA测序等方法对疑似敲除株进行验证。结果显示GBS的两个突变株ΔcpsE和ΔneuA被成功构建。在此基础上,通过生物学功能分析比较基因缺失突变株ΔcpsE、ΔneuA与野生株在菌株生长速率、荚膜多糖厚度、唾液酸含量和毒力方面的差异。结果发现缺失突变株ΔcpsE和ΔneuA的生长速度与野生株无显著差异,但荚膜多糖厚度、唾液酸含量和菌株毒力均显著低于野生株。进一步研究显示,cpsE是鱼源GBS荚膜多糖合成的关键基因,neuA基因则是荚膜多糖唾液酸化的关键基因,它们的缺失导致了GBS荚膜唾液酸含量的降低,且显著降低了菌株的毒力。     

拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能及所介导的致病作用

为了探明拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能,利用同源重组技术敲除基因组中OmpU基因,并构建其互补株,再经组合PCR方法和序列测定,证实了OmpU基因的缺失和互补。对野生株、缺失株和互补株进行了遗传稳定性、生长特性、生化特性、细胞黏附性、致病性等方面比较研究。结果显示,缺失株具有遗传稳定性;在相同的培养条件下,与野生株相比,突变株的培养特性和生化特性没有明显变化,生长速率略减慢,对实验草鱼的毒力降低了4倍,对鲤上皮瘤细胞(EPC)的黏附能力显著降低,下降了66.6%,而互补株的黏附能力和毒力又得到恢复,与野生株无明显差异。研究首次确证了拟态弧菌OmpU蛋白具有黏附功能,OmpU蛋白通过黏附参与致病作用。     

哈维弧菌vhh基因缺失株的构建及其相关生物学特性研究

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是水生动物的重要病原,为研究哈维弧菌溶血素基因vhh缺失后对其生物学特性的影响,该研究利用同源重组技术构建了V.harveyi 345的vhh基因缺失突变株,并比较了野生株和突变株的生物学特性变化。结果显示,vhh基因的缺失不影响菌株的生长、胞外蛋白酶分泌、过氧化氢(H2O2)和铜离子(Cu2+)的压力感应、铁的吸收利用、15种抗生素抗性和生物膜形成等生物学特性,但会导致菌株游动和涌动显著增强;另发现,vhh基因虽然在野生菌株内高表达,对绵羊红细胞却未表现出溶血活性。结果表明该基因负调控着菌株的运动能力。该研究为认识哈维弧菌vhh基因功能研究提供新的资料。     

溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗的构建及其免疫效果评价

为了研究溶藻弧菌双组分调控系统KdpDE减毒活疫苗对鱼体的免疫保护作用,本研究采用Overlap PCR和同源重组技术,构建了kdpD/kdpE（kdpDE）基因无标记基因框内敲除突变株。对野生株和缺失突变株的生物学特性及致病性进行了比较研究,发现kdpDE的缺失对溶藻弧菌的生长速率和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力、生物被膜形成能力较野生株下降。斑马鱼致病性实验结果显示,突变株毒力下降78.5倍,表明减毒株构建成功,可以作为减毒活疫苗的候选菌株。突变株在鱼体内存活能力实验结果显示,注射免疫7 d后,鱼体内不能检测到该菌。以突变株ΔkdpDE为抗原,分别用注射和浸泡的方式免疫斑马鱼,免疫后第28天用溶藻弧菌和哈维氏弧菌攻毒,评估该减毒活疫苗及不同免疫方式对斑马鱼的保护效果。实验结果表明,免疫后的斑马鱼能够抵抗溶藻弧菌的感染,其中注射免疫组的免疫保护率达83.3%,浸泡免疫组次之（66.7%）;同时,该减毒活疫苗能刺激斑马鱼对哈维氏弧菌产生交叉保护效应,其中注射免疫组的免疫保护率为65.5%,浸泡免疫组为55.2%。以上结果表明,kdpDE基因敲除突变株可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的候选减毒活疫苗。     

杀香鱼假单胞菌Ⅲ型分泌系统转录调控蛋白ExsA突变株的构建及其对大黄鱼的毒力特征分析

杀香鱼假单胞菌是大黄鱼内脏白点病的致病菌,感染该菌常会导致养殖大黄鱼很高的死亡率和严重的经济损失。病原株NB2011编码典型的Ⅲ型分泌系统,可能是该菌重要的毒力因子,ExsA是控制此分泌系统表达的重要调控蛋白。为确认ExsA在NB2011致病过程中的作用,开发有效疫苗,实验采用双交换同源重组法构建了ExsA内部序列被卡那霉素基因替换的突变株,检测突变株与野生株对鼠巨噬细胞J774的黏附、内化和胞内增殖特性,并比较对大黄鱼的毒力变化,同时,通过透射电子显微镜观察人工感染后大黄鱼内脏组织的病理变化。研究表明,巨噬细胞对突变株的内化率降低,内化的细菌在12 h内被清除,野生株在内化后虽然一段时间内数量稍有下降,12~24 h期间数量急剧上升;突变株对大黄鱼的96 h LD_(50)为2.59×10~7/mL,比野生株高数百倍;电镜切片中未观察到组织内有菌体的存在,表明突变株的毒力明显减弱,可以作为弱毒疫苗的开发对象。     

鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白ompF基因的分子克隆、生物信息学与免疫原性分析

为筛选潜在的保护性抗原基因研制鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)基因工程疫苗,实验利用特异性引物扩增分离自斑点叉尾(Ictalurus punctatus)的Y.ruckeri外膜蛋白omp F基因并对其进行分子克隆,应用相关软件和程序对其核苷酸及氨基酸序列进行生物信息学分析,并进行了omp F蛋白的表达和免疫原性检测。结果显示,omp F基因全长1 095 bp(Gen Bank登录号KP159420),包含一个编码364个氨基酸的完整开放阅读框,其氨基酸序列具有极高保守性,与Y.ruckeri外膜穿孔蛋白omp F(Gen Bank登录号ADK27779.1)亲缘关系最近,序列一致性为99.2%,进化树聚为一支;具有1个革兰氏阴性菌穿孔蛋白保守结构域,存在1个信号肽和1个跨膜区,是一种跨膜蛋白;具有12个与免疫相关的抗原决定簇区域。SDS-PAGE分析发现该蛋白主要以包涵体形式表达在沉淀,经Western-bolt显示omp F蛋白具有较好的免疫原性。以上结果表明omp F基因可作为Y.ruckeri基因工程疫苗的候选抗原基因。     

QseB在嗜水气单胞菌响应去甲肾上腺素中的作用

为探明嗜水气单胞菌QseB在病原菌对鱼体应激激素去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)的识别和响应过程中的作用,实验采用同源重组方法构建了嗜水气单胞菌NJ-35的qseB缺失突变株(AqseB),比较分析了 NE诱导后,野生株和突变株之间其生物膜形成能力、溶血活性和运动能力等与细菌毒力有关的生物学功能的变化...     

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种dly基因缺失株构建及其生物学特性研究

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae, PDD)是广泛分布于全球海洋环境中的一种致病菌。本研究以实验室保存的一株高致病性PDD菌株(PDD1608)作为对象,初步探究毒力基因dly对PDD菌株的生物学特性和致病力的影响。利用λRed重组技术成功构建毒力基因dly缺失株Δdly PDD1608::Cm,比较野生株和缺失株的生长、涌动性、药物敏感性、生理生化特性、生物被膜形成能力、菌株及胞外产物(extracellular products, ECP)的溶血性和磷脂酶活性等生物学特性。选用海水青鳉鱼(Oryzias melastigma)作为实验动物,通过人工感染实验测定野生株和缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性。结果显示,毒力基因dly缺失后导致PDD菌株生长变慢,涌动性、溶血性和磷脂酶活性均降低;野生株和缺失株的药物敏感性和生理生化特性未产生变化;与野生株相比,缺失株的生物被膜形成能力有显著差异(P<0.05);人工感染实验表明,缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性降低。毒力基因dly影响PDD菌株的生长、涌动性、溶血性和磷脂酶活性等多种生物学特性,并且与PDD菌株及其ECP的致病力强弱密切相关。     

溶藻弧菌ZJ-T小RNA srvg17985缺失突变株的构建及该小RNA功能的初步分析

利用同源重组技术构建了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) ZJ-T小RNA srvg17985的缺失突变株,并比较研究了野生株和srvg17985突变株在LBS中的生长特性、运动性、胞外蛋白酶分泌、对铁的吸收利用、对抗生素的抗性以及生长代谢等生物学特性。结果表明,小RNA srvg17985缺失后不影响溶藻弧菌在LBS中的生长、运动性、胞外蛋白酶分泌、对铁的吸收利用、对抗生素的抗性以及对测定的多数碳源、氮源的代谢;但srvg17985突变株对昆布多糖(laminarin)、果胶(pectin)以及二羟基丙酮(dihydroxyacetone)的利用增强,并转变为可利用丙氨酸-天冬氨酸(Ala-Asp)作为单一氮源。     

The use of a real-time PCR primer/probe set to observe infectivity of Yersinia ruckeri in Chinook salmon, Oncorhynchus tshawytscha (Walbaum), and steelhead trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum)

Yersinia ruckeri is the causative agent of enteric redmouth disease (ERM), a common pathogen affecting aquaculture facilities and implicated in large losses of cultured fish. Fisheries scientists continue to gain a greater understanding of the disease and the pathogen by investigating methods of identification and pre- and post-infection treatment. In this study, a real-time PCR probe set for Y. ruckeri was developed to detect daily changes in the bacterial load during pathogen challenges. Two species of fish, Chinook salmon, Oncorhynchus tshawytscha, and steelhead trout, Oncorhynchus mykiss, were exposed to two strains of Y. ruckeri (Hag and SC) during bath challenges. A subset of fish was killed daily for 14 days, and the kidney tissue was biopsied to enumerate copies of pathogen DNA per gram of tissue. While Chinook exposed to either the Hag or SC strains exhibited similar pathogen loads, those exposed to the Hag strain displayed higher mortality (～66%) than fish exposed to the SC strain (～24% mortality). Steelhead exposed to the Hag strain exhibited a greater pathogen load and higher mortality (～42%) than those exposed to the SC strain (<1% mortality). Steelhead challenged with either strain showed lower pathogen loads than Chinook. The study illustrates the efficacy of the probe set to enumerate Y. ruckeri bacterial growth in the kidneys of fish. Also, strains of Y. ruckeri display species-specific growth patterns that result in differential mortality and pathogen load.     

从许氏平鲉体表分离海分枝杆菌的鉴定及其脂多糖的抗原性分析

从许氏平鲉粘液、背鳍、鳃等部位分离筛选到同一菌株FZ09,经形态学观察、生理生化特性及热激蛋白65(HSP65)基因序列分析,鉴定菌株FZ09为海分枝杆菌。分别用酚-氯仿-甲醇法、乙醇-酚水法和传统热酚水法提取菌株FZ09的脂多糖(LPS),分析了LPS的组成和抗原性差异。SDS-PAGE结果表明,3种方法提取的LPS条带分布基本相同,主要条带分子量分别为14、16和23 ku,其中以乙醇-酚水法提取的LPS含量和纯度最高,热酚水法提取的LPS条带最多,抗原性最好。Western-blotting显示,海分枝杆菌抗血清主要与LPS的14 ku条带发生特异性免疫反应。高碘酸氧化免疫印迹结果表明,仅传统热酚水法提取的LPS在14 ku分子量区域有弱的阳性条带出现,其他方法提取LPS与抗血清的免疫反应呈阴性。高碘酸氧化ELISA反应显示,LPS经高碘酸氧化后与海分枝杆菌FZ09抗血清的反应活性降低,OD₄₀₅明显减弱。     

鳖源柠檬酸杆菌属新种的分离鉴定与多位点序列

为确定2020年10月湖北一中华鳖发病的病原体及病原特征，实验从该养殖场患病中华鳖个体肝脏中分离获得1株优势菌A3，经理化性状及16S rRNA序列鉴定，表明菌株A3属于柠檬酸杆菌。进一步通过recN序列鉴定，发现A3与布氏柠檬酸杆菌recN碱基一致性为95.58%～96.01%，与柠檬酸杆菌属其他种的recN碱基一致性均低于93.72%，表明菌株A3为柠檬酸杆菌属潜在新种。人工回归感染实验证实菌株A3是引起本次中华鳖患病的病原菌。与嗜水气单胞菌相比，A3感染病程偏慢但致死率较高。药敏实验结果显示，菌株A3对美罗培南等10种抗生素敏感，对氟苯尼考等9种抗生素耐药。多位点序列分型(MLST)鉴定显示，菌株A3属于新序列型(ST)。对柠檬酸杆菌多位点序列分型的7个管家基因序列进行级联并构建系统发育树，结果显示，柠檬酸杆菌的进化与菌株的分离源及分离地点没有明显关系；菌株A3与分离自欧洲人源的ST120型菌株Citfre2580亲缘关系最近。本研究对中华鳖的病原进行了分离鉴定，并阐述了一种更可靠的柠檬酸杆菌鉴定方法，旨在引起人们对柠檬酸杆菌致病性的重视，为水产品健康养殖提供一定的参考依据。     

Potential use of a Yersinia ruckeri O1 auxotrophic aroA mutant as a live attenuated vaccine

The aroA gene of Yersinia ruckeri, which encodes 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase, was insertionally inactivated with a DNA fragment containing a kanamycin resistance determinant and reintroduced by allelic exchange into the chromosome of Y. ruckeri 21102 O1 by means of the suicide vector pIVET8. The Y. ruckeri aroA::Kan(r) mutant was highly attenuated when inoculated intraperitoneally into rainbow trout, with a 50% lethal dose of >5 x 10(7) CFU. The mutants were not recoverable from the internal organs 48 h post-inoculation or later. The vaccination of rainbow trout with the AroA mutant as a live vaccine conferred significant protection (relative percentage survival = 90%) against the pathogenic wild-type strain of Y. ruckeri.     

虹鳟肠炎红嘴病病理模型的构建

为探讨鲁氏耶尔森菌侵染虹鳟的致病机制,本实验建立了鲁氏耶尔森菌感染虹鳟引起的肠炎红嘴病的病理模型,制定相应的临床症状及组织病理学评分系统,并对该模型进行研究。将43尾平均体质量约为12 g的健康虹鳟随机分成5组:3个实验组(n=30)、对照组(n=10)和哨兵组(n=3)。3个实验组分别采用2.0×106、2.0×107和2.0×108 CFU/m L的鲁氏耶尔森菌感染浓度,通过腹腔注射方式进行人工感染试验。对感染鲁氏耶尔森菌的虹鳟肠、肝脏、脾脏和肾脏组织进行镜检及临床症状、剖检病变判断,结合细菌学检测,按制定的评分系统评价各组肠炎红嘴病造模效果,确定最佳造模方案。结果显示,各攻毒组虹鳟感染后72 h均出现不同程度死亡,临床症状表现为红嘴、肛门红肿、鳍(胸鳍、腹鳍、臀鳍)等出现不同程度充血,下颌部、腹部出现出血点等。组织病理学可见肝脏、脾脏、肾脏及肠组织均有炎性细胞浸润现象出现,肝细胞、肠上皮细胞和肾小管上皮细胞等实质细胞变性、坏死,脾脏部位淋巴细胞减少、红细胞死亡堆积。综合各组得分发现,2.0×107 CFU/m L组的鲁氏耶尔森菌感染虹鳟造模效果最佳,患病虹鳟的临床症状显著且组内差异较小,病程迁延较长,便于研究。研究表明,对体质量约12 g的虹鳟幼鱼腹腔注射0.1 m L浓度为2.0×107 CFU/m L的鲁氏耶尔森菌可成功构建肠炎红嘴病病理模型。     

Molecular cloning of Yersinia ruckeri aroA gene: a useful taxonomic tool

The aroA gene of Yersinia ruckeri , which encodes 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate (EPSP) synthase was cloned by complementation of the aroA mutation in Escherichia coli AB2829 by using pUC18 plasmid as a vector. Nucleotide sequence of the aroA gene revealed an open reading frame of 427 amino acids showing a high degree of homology to other bacterial AroA proteins. A pair of primers with 23 and 20 nucleotides were selected from the 5' and 3' termini, respectively, and formed the basis of a specific polymerase chain reaction (PCR) assay. A 1165-bp deoxyribonucleic acid (DNA) fragment was amplified from all lysed Y. ruckeri strains. An identical size fragment was also amplified from lysed Y. pseudotuberculosis , Y. aldovae , Salmonella enteritidis and E. coli , but not from other enterobacteria. Alu I restriction fragment length polymorphism (RFLP) of the PCR amplified products allowed for differentiation between Y. ruckeri and the other bacteria. Specificity and sensitivity make this PCR assay a useful method for rapid identification and diagnosis of Y. ruckeri infections.     

大口黑鲈致死性结节病病原的分离、鉴定及组织病理学观察

2018年4月四川邛崃地区某养殖场大口黑鲈感染致死性结节病,死亡率高达80%。为明确病因,通过常规微生物分离、鉴定,从患病鱼皮肤溃疡灶、鱼鳔腔积液和肝脏组织中分离到同一株优势菌,命名为HSY-NS02。经菌体形态观察、革兰氏染色和抗酸染色镜检、生理生化实验、16S rDNA序列扩增及系统发育分析和特异性PCR扩增,确定该菌为诺卡氏菌。进一步对健康大口黑鲈进行分离菌的人工感染实验以确定其致病性,结果显示,人工感染鱼出现与自然发病相似症状,且从人工感染鱼体中再次分离到相同菌。组织病理学观察显示,皮肤溃疡灶、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和鳃发生不同程度的慢性炎性肉芽肿病变,其中脾脏病变最为严重。对菌株HSY-NS02进行药物敏感性实验,结果显示,该菌对庆大霉素、新霉素和制霉菌素3种药物敏感,对其他18种药物耐受,呈多重耐药性。     

三角帆蚌HcTyr基因内壳色性状相关SNP筛选及图谱定位

为研究三角帆蚌HcTyr基因与内壳色性状的相关性,本实验根据已分离的三角帆蚌HcTyr基因进行引物设计和片段扩增,并用144只三角帆蚌对其多态性进行筛选和验证,卡方检验分析了SNP位点和三角帆蚌内壳色相关性,并对HcTyr基因进行了图谱定位。结果显示,在HcTyr基因上筛选出8个SNP位点,其中有7个SNP位点与三角帆蚌内壳色L、a及d E呈显著相关性,用这7个SNP位点做单倍型构建和分析,发现Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ这3种单倍型在白色群体中出现的频率极显著高于在紫色群体中出现的频率,而Ⅴ和Ⅶ这2两种单倍型在紫色群体中出现的频率极显著高于白色群体。进一步在商业养殖群体中验证发现,Ⅳ和Ⅶ这2种单倍型可分别作为白色和紫色群体的优势单倍型。研究表明,三角帆蚌HcTyr基因可作为内壳色相关的候选基因,其部分SNP位点可用于三角帆蚌分子辅助育种。另外本实验还将HcTyr基因定位在三角帆蚌LG16连锁群上,这为进一步解析该基因调控珍珠颜色形成的分子机制奠定了基础。     

美洲鳗鲡致病性鲍曼不动杆菌的分离、鉴定及致病性分析

为确定海南某鳗鲡养殖场患病美洲鳗鲡大量死亡的原因,从患病美洲鳗鲡肝脏和脾脏中分离获得1株优势菌株AB01,回归感染证实该菌株为导致此次美洲鳗鲡患病的病原菌。经生理生化鉴定、16S rDNA基因序列比对及系统发育分析,判定菌株AB01为鲍曼不动杆菌。致病性分析结果显示,菌株AB01对美洲鳗鲡的半致死浓度为4.63×106CFU/mL。组织病理学观察显示,患病美洲鳗鲡的肝脏、脾脏均发生不同程度的病变,其中,肝脏中部分肝索排列紊乱,细胞肿胀,胞核溶解,胞质疏松,结构模糊,有大量大小不等的空泡;脾脏中胞质多处稀疏,伴有大面积损伤。药敏检测显示,鲍曼不动杆菌AB01对头孢噻吩、头孢唑啉、阿奇霉素、丁胺卡那霉素、利福平、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星敏感,对氟苯尼考、氨苄西林等9种抗生素中度敏感,对氨曲南和四环素等20种抗生素有多重耐药性。     

怀头鲇体表溃烂症病原鉴定及致病性分析

为探讨黑龙江流域怀头鲇体表溃烂症的病因及防控措施,本研究采用常规方法从患病鱼的肝脏、脾脏和肾脏等部位分离病原菌,通过人工感染试验确定分离菌株的致病性,并对菌株的基本形态、理化特性、分子特征、毒力基因携带情况及耐药性等进行了系统研究。结果显示,从患病鱼体内分离得到3株病原菌,分别命名为NY-8、NY-9和NY-12;人工感染试验发现,NY-8和NY-9株对试验鱼有较强的致病力,NY-12株毒力较弱;3株细菌混合感染后,鱼体发病症状与临床自然发病症状一致,试验鱼死亡率高达到100%。综合理化特征和16S r RNA基因序列分析结果,确定NY-8、NY-9和NY-12株分别为气单胞菌属的维氏气单胞菌、杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌。5种毒力基因在3株气单胞菌中的分布表现为两种基因型,h l y+/a e r+/a c t+/a l t+/G C A T+和h l y+/a e r-/act+/alt+/GCAT+,同时携带5种毒力基因的NY-8和NY-9分离株致病性显著高于NY-12株。3株细菌在耐药谱上有一定差异性,NY-8和NY-9株均对4种氟喹诺酮类药物敏感,对氨基糖苷类、呋喃类等药物耐药;NY-12株仅对左氧氟沙星和氟苯尼考等2种药物敏感。