嗜水气单胞菌QseC在响应去甲肾上腺素中的作用

QseBC是一种普遍存在于细菌的双组分调控系统(two-component regulatory system,TCS),能感应细胞外环境因子信号,在调控细菌毒力中发挥着重要作用。为了研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)QseC在识别和响应宿主应激激素去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)及其对毒力因子表达的调控作用,本实验首先构建了嗜水气单胞菌NJ-35缺失突变株ΔqseC与互补株qseC+,分析了在NE诱导下野生株和突变株的体外毒力因子表达和鱼体死亡率的变化。结果表明,qseC的缺失抑制了NE对嗜水气单胞菌的促生长作用,降低了NE对生物膜形成能力和溶血活性的增强作用及其对罗非鱼的致死率,而对运动性、脂肪酶与蛋白酶活性没有产生显著影响。本实验明确了嗜水气单胞菌QseC能够响应NE,从而调节菌株的毒力,对全面认识嗜水气单胞菌的致病机理及其与宿主的互作机制有着重要意义,并为探索疾病防控新技术奠定相关理论基础。     

耐喹诺酮类药物嗜水气单胞菌的分离鉴定及电镜观察

本研究对吉林省内12个水域采集和送检的66尾病鱼进行细菌分离鉴定,共检出46株嗜水气单胞菌疑似株,通过生化试验和PCR扩增气溶素基因aer鉴定法,确定其中22株为嗜水气单胞菌。进一步采用纸片扩散法和双倍稀释法测定嗜水气单胞菌分离株对多种抗生素的耐药性,其中部分菌株存在不同程度的耐药性,22株嗜水气单胞菌中有4株对喹诺酮类药物耐药,并且为交叉耐药。其对喹诺酮类药物的抑菌圈均小于19mm。嗜水气单胞菌耐喹诺酮类药物的检出率为18 2%。将病料中分离的8株嗜水气单胞菌在电镜下观察发现,2株耐药菌表面发现均匀分布的球形结构,而6株敏感菌表面未见此结构。     

27株嗜水气单胞菌致病性及ERIC—PCR指纹图谱分析

从福建省淡水养殖鱼类体内分离到27株嗜水气单胞菌,根据嗜水气单胞菌16SrDNA基因和气溶素基因（aerolysin）的保守序列,设计2对引物,对所分离到的27株嗜水气单胞菌进行双重PCR扩增,扩增结果表明,其中18株为含有Aer毒力基因的潜在致病性嗜水气单胞菌,占总菌数的66．67％。应用ERIC-PCR分型技术对27株嗜水气单胞菌菌株进行分析,以相似度54．00％为限,所有菌株可分为Ⅰ和Ⅱ两大聚类,以76．00％相似度为界,27株嗜水气单胞菌可分为11个聚类,同一个聚类中菌株分离区域基本相同。分析结果表明,分离的嗜水气单胞菌基因型的多样性和分离地域具有一定的关联,也表明ERIC-PCR可以有效应用于嗜水气单胞茵分子流行病学调查。     

蚌嗜水气单胞菌病的预防治疗

2001年4月份我县的部分养蚌农户中发生蚌嗜水气单胞菌病,且病情严重,死亡率很高。笔者于5月份携病蚌前往湖南省水产研究所找有关专家研究防治对策,经过病原分离、转接,结果在病蚌中分离出嗜水气单胞菌病原株,确诊为蚌嗜水气单胞菌病。经过近3年的探索,已经初步掌握了蚌嗜水气单胞菌病的发病规律、诊断方法、预防和治疗措施。现向广大养蚌农户作简单的介绍。1什么是嗜水气单胞菌嗜水气单胞菌是水体中广泛存在的一种条件致病细菌。目前,我国的科学工作者已提取3个变种,即白鲢嗜水气单胞菌,牛蛙嗜水气单胞菌和甲鱼嗜水气单胞菌。珠蚌最易感染的…     

豫北地区主要淡水鱼类感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

对豫北地区嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病进行流行病学调查,分离鉴定致病性嗜水气单胞菌菌株,并对致病性嗜水气单胞菌菌株进行毒力验证和药敏试验。采集4个养殖场病鱼标本及水样,每月进行流行病学调查,利用生理生化及分子生物学方法检测嗜水气单胞菌的分布状况。结果显示,筛选出52株为嗜水气单胞菌,其中32株为致病性嗜水气单胞菌,20株为非致病性嗜水气单胞菌,且致病性嗜水气单胞菌主要分布在7—9月份,毒力验证试验表明,32株致病性菌株的毒力大小差异明显,筛选出强毒株XDMG(4),为后期试验的疫苗株做准备;药敏试验表明,不同菌株对同一种药物的药敏结果不同,但大部分药物的药敏结果基本一致,70%以上的致病性菌株对头孢哌酮、氟本尼考、菌必治、阿米卡星等抗菌药物表现为高度敏感,对青霉素类药物表现为高度耐药性,耐药率达100%,对氨基糖苷类(不包括阿米卡星)、磺胺类、四环素等药物呈现不同程度的耐药性,具有多重耐药性。本试验旨在丰富本地区的鱼类细菌性败血病的病原资料,并为该菌引起的人类疾病的防控提供科学依据。     

1株嗜水气单胞菌的拮抗菌鉴定及其特性研究

从池塘养殖的团头鲂(Megalobrama amblycephala)肠道中分离筛选出15株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)拮抗菌,其中菌株S24在平板贴片试验中对供试的嗜水气单胞菌菌株具有稳定和较高的拮抗作用。综合形态学观察、生理生化指标检测及分子序列(16S rDNA,gyrB)分析,将菌株S24确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。拮抗菌S24和嗜水气单胞菌(菌株43)的共凝集率为(36.0%±4.3%)。共培养试验可见拮抗菌S24能明显抑制嗜水气单胞菌43的增殖;共培养18 h时,嗜水气单胞菌43的细胞数量达到最低。试验结果表明,拮抗菌株S24适宜作为潜在防治嗜水气单胞菌病的益生菌。     

鲤隐性败血症病原菌的分离与鉴定

本文对东北地区流行的鲤隐性败血症进行了病原菌的分离、人工感染、病原菌生理、生化特性和药物敏感性的测定,观察了病理组织变化等。从病鱼内脏分离到场22株致病菌,其中标7株的生长及生化特性均符合嗜水气单胞菌种的特性,嗜水气单胞菌hec毒素检测呈阳性。有3株菌V—P(-)、赖氨酸(-)、葡萄糖产气(-)是区别嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及温和气单胞菌(A．Sobrie)主要特征,这三株菌符合豚鼠气单胞菌(A．Caviae)种的特征。     

二温式PCR检测罗非鱼嗜水气单胞菌的研究

根据基因库嗜水气单胞菌的脂肪酶基因序列设计1对特异性引物,用二温式PCR对从病死罗非鱼体内分离的8株嗜水气单胞菌进行扩增。特异性结果显示该引物对8株嗜水气单胞菌均能扩增出与预期大小相一致的760bp扩增产物,而对弧菌、肠炎杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增均无任何条带。二温式PCR敏感性结果表明可以检测到10pg的嗜水气单胞菌DNA模板。     

PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌

根据已发表的气单胞菌16S rDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列，设计了2对引物，建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测，发现16S rDNA引物具有高度的特异性，仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97．2％，且具有高度的敏感性，可检测最低1fg的模板。将16S rDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94．4％。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径，是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。     

鱼源气单胞菌的毒力基因检测、分型及致病力

为调查鱼源气单胞菌毒力基因与其致病力的相关性,以2009—2018年从不同患病鱼分离的173株气单胞菌为研究对象,通过检测毒力相关基因、测定溶血活性、腹腔注射感染异育银鲫等方法开展评价。通过管家基因gyrB分子鉴定结果显示,173株气单胞菌中维氏气单胞菌(119/173,68.9%)和嗜水气单胞菌(50/173,28.9%)是主要流行的菌株。10个毒力基因aer(162/173,93.64%)、act(131/173,75.72%)、ast(55/173,31.79%)、alt(58/173,33.53%)、lip(152/173,87.86%)、exu(154/173,89.02%)、fla(143/173,82.66%)、gcaT(148/173, 85.55%)、 eprCAI(41/173, 23.70%)和ahyB(51/173, 29.48%)普遍存在于173株气单胞菌中。依据检测到的毒力基因数量从多到少分布情况,这些菌株可分为7大类(Ⅰ～Ⅶ)53个毒力基因型。大部分嗜水气单胞菌检测到8～10个毒力基因,主要分布于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因型;维氏气单胞菌的eprCAI、ahyB、 ast和alt等4个毒力基因检测率低,主要分布于Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ类基因型。大部分气单胞菌(94.22%,163/173)具有溶血活性。代表性毒力基因型的38株维氏气单胞菌和20株嗜水气单胞菌腹腔注射异育银鲫攻毒结果显示,3.0×106 CFU/尾的剂量下,3株维氏气单胞菌使鲫死亡率达80%～100%,16株嗜水气单胞菌使鲫死亡率达90%～100%。研究表明,维氏气单胞菌是目前最主要流行的气单胞菌,但其检测到的毒力基因普遍少于嗜水气单胞菌,且对异育银鲫的致病力普遍弱于嗜水气单胞菌。本研究能够为气单胞菌败血症的流行病学调查和疫苗研究提供理论依据。     

三疣梭子蟹受精卵离体孵化技术

为了探究三疣梭子蟹受精卵的离体孵化技术及效果，本研究先后开展了受精卵块最适分离液种类及作用条件的筛选、分离液处理不同发育期受精卵离体孵化的差异、分离液处理对受精卵卵膜的结构影响，及分离液处理受精卵对孵化后幼体活力的影响实验。结果显示，木瓜蛋白酶是一种较为理想的分离液，在浓度为0.09 g/mL，分离时间30 min时，分离率可达到99%以上；经过分离液处理后的各期受精卵均能孵化出幼体，卵内溞状幼体期离体胚胎孵化率最高，为89.0%±3.3%，未经处理的对照组为70.0%±4.8%；卵裂期离体胚胎孵化率最低，为58.0%±3.9%，对照组为31.0%±2.3%，与对照组相比，处理组的孵化率明显提高。透射电镜结果显示，经过分离液处理的受精卵卵膜结构疏松，且厚度降低，符合处理组孵化率增加这一现象，干露、福尔马林溶液胁迫和行为学测试对不同处理组的幼体进行质量评价的结果显示，处理组和对照组幼体活力无显著差异。研究表明，实验所获得的分离液可以有效提高三疣梭子蟹受精卵的分离率和孵化率，且不影响幼体质量，可为三疣梭子蟹及其他甲壳动物受精卵的离体孵化提供参考。本研究可为三疣梭子蟹的苗种繁育提供新的技术手段，也将为基因编辑辅助育种等技术的实施奠定基础。     

卵胎生许氏平鲉胚胎离体培养及发育形态学

为了探讨许氏平鲉的离体培养发育形态学并设计出最适的体外培养液,以海水生理盐水为主要配方,设为对照(第一组),分别加入1%许氏平鲉血清(第二组),1%许氏平鲉卵巢组织匀浆(第三组),1%胎牛血清(第四组),1%许氏平鲉血清+1%许氏平鲉卵巢组织匀浆(第五组),共形成5组不同的离体培养液。分2次从妊娠许氏平鲉卵巢中获得处于不同发育阶段的胚胎,分别为高囊胚期、晶体出现期,在上述5种不同的培养液中培养,观察记录发育状况。结果发现,胚胎在体外培养的初始阶段为高囊胚期时,虽然在5组培养液中都能发育到十六肌节期,但是每组的发育时序有很大差别,第五组发育状况最好,发育最快,为60 h。第四组发育最慢,为67 h。其余组的发育时间介于第四组和第五组之间;当初始阶段为晶体出现期时,第五组中的胚胎发育速率最快,为57 h,并且有最高的孵化率,为80%。第二组虽然有很快的发育速率,但其孵化率最低,为40%。研究表明,在体外培养条件下,许氏平鲉的受精卵发育至破膜时约200 h,且第五组(1%许氏平鲉血清+1%许氏平鲉卵巢组织匀浆)是使许氏平鲉胚胎离体发育最快的培养液。     

橘色双冠丽鱼黑素皮质素受体1基因(MC1R)整胚原位杂交

为探究黑素皮质素受体1基因(MC1R)在橘色双冠丽鱼胚胎发育和体色形成过程中的表达定位及功能,本研究首先制备了MC1R基因的RNA正反义探针,T7方向转录的正义RNA探针质量浓度为447.529 ng/μL,SP6方向转录的反义RNA探针质量浓度为342.698 ng/μL。经10～20倍稀释后的探针用于原位杂交,MC1R基因探针表达定位显示,随橘色双冠丽鱼胚胎的发育杂交信号总体呈逐渐减弱趋势,原肠期和视泡期其卵黄和胚体侧卧部分有杂交信号分布;出膜期其脊柱、卵黄囊及其内容物和色素细胞内出现杂交信号;出膜期第1天,卵黄表面有信号分布。总体来看,杂交信号在脊索、卵黄囊、卵黄囊内容物质及色素细胞有特异表达,而以正义探针作为阴性对照组在5个胚胎阶段均无任何信号,杂交信号显现的MC1R表达定位说明其在橘色双冠丽鱼色素细胞的分化、迁移中起到重要调控作用,也与神经、营养、免疫功能相关,初步建立了鱼类体色相关基因功能和定位研究的整胚原位杂交方法。     

在体条件下miR-305-5p对日本沼虾MnCHT3A的靶向调控作用

为了探索miRNA对日本沼虾几丁质酶3A(Macrobrachium nipponense chitinase 3A,MnCHT3A)基因的调控作用,实验采用生物信息学方法预测并筛选与MnCHT3A靶向结合的miRNA—miR-305-5p;利用qRT-PCR、生物化学以及组织学方法,研究了在体条件下,miR-305-5p对靶基因的调控作用。结果显示,一个蜕皮周期中miR-305-5p与MnCHT3A的表达量呈负相关,前者C期最高、A期最低;而MnCHT3A的表达趋势则相反。注射miR-305-5p mimics和miR-305-5p inhibitor后,与对照组相比,MnCHT3A转录水平分别降低60%和升高166%;MnCHT酶活性分别降低39.53%和升高133%。组织学观察发现,C期的头胸甲表皮为3层结构,由外向内依次为上表皮、外表皮和内表皮(H.E染色);几丁质荧光染色结果显示,几丁质分布在内、外表皮;扫描电镜结果清晰显示了内、外表皮的板层结构。与对照组相比,miR-305-5p mimics组内表皮的板层厚度增加,呈蓝色荧光的几丁质条带有增厚趋势;而miR-305-5p inhibitor组表皮结构紊乱,几丁质荧光分布不均且部分区域明显减弱。研究表明,miR-305-5p的靶基因为MnCHT3A,在体条件下,miR-305-5p能够靶向抑制MnCHT3A的转录。     

The timing of puberty in cultured female yellowtail flounder, Limanda ferruginea (Storer): Oogenesis and sex steroid production in vivo and in vitro

This study examines puberty in female yellowtail flounder, correlating macroscopic, histological and endocrine parameters at the gonadal level. Short-term ovarian tissue incubations were used to study estradiol-17β production in relation to oogenic stage. Examining 2 year classes of young flounder demonstrated that cultured females retain phenotypic plasticity in reproductive age with pubertal onset occurring in one-year, two-year and three-year-olds. Immature ovaries were steroidogenic and capable of responding to gonadotropic stimulation. Endocrine puberty in females was detected by a peak in estradiol-17β production during the cortical alveolar oocyte stage prior to any ovarian evidence of vitellogenesis. Puberty, once initiated, proceeded to ovulation within 8 to 12 months; vitellogenic oocyte development followed the group synchronous pattern. Estradiol-17β was clearly the dominant of the two measured plasma hormones during pubertal onset and throughout vitellogenesis. Plasma testosterone was consistently detectable at low levels by mid-to late-vitellogenesis. Ovaries showed the highest sensitivity to gonadotropic stimulation in vitro during late-vitellogenesis. Variable plasma levels in both estradiol-17β and testosterone occurred in preovulatory and ovulating females during the captive spawning period. Together the results show that yellowtail flounder can mature at a young age and small size when culture conditions permit. In addition, the early sensitivity to gonadotropin by the immature ovaries may be an important physiological determinant for the timing of puberty in this species.     

模拟探究凡纳滨对虾磷脂在贮藏过程中的水解机理

为探究凡纳滨对虾磷脂(PL)在贮藏过程中的水解机理,本研究建立了磷脂相关酶与磷脂酰胆碱(PC)的体外模型,模拟凡纳滨对虾磷脂水解反应。实验分别从凡纳滨对虾体内分离纯化得到磷脂相关酶与PC,进行体外反应,并采用"鸟枪"脂质组学法及气相色谱—质谱法分析水解反应前后PC、溶血磷脂(LPL)及游离脂肪酸(FFA)的组成和含量变化,进而推断磷脂的水解机理。结果显示,凡纳滨对虾体内磷脂水解酶包括脂肪酶、磷脂酶A_1(PLA_1)、磷脂酶A_2(PLA_2)、磷脂酶C(PLC)及磷脂酶D(PLD),其中PLA2活力最高,可达177.87 U。体外模拟反应中,凡纳滨对虾PC含量由516.45显著降至146.14 mg/g,总FFA含量由36.42上升至568.57 mg/g,其中多不饱和脂肪酸(PUFA)显著增加了280.5 mg/g。通过相关性分析水解前后磷脂水解酶活力变化与PC含量变化,发现PC的变化与PLA2显著相关(R=0.91)。研究表明水产品中PC变化是磷脂相关酶催化的水解反应,其水解产物主要为FFA与LPC,且PLA_2对水产品贮藏过程中磷脂的水解影响最大。本实验建立了新型的体外水解模型,并初步探究了磷脂的水解机理,为水产品贮藏及磷脂酶的研究及应用奠定了理论基础。     

定量表达和整体原位杂交研究Doublesex基因在不同生殖状态蚤状溞的表达

为研究doublesex(dsx)基因在不同生殖状态的蚤状溞的时空表达状况,提取不同生殖状态的蚤状溞RNA,采用RT-PCR和Quantitative real-time PCR检测了dsx在不同生殖状态溞体的表达差异,并通过体外转录制备DIG标记的Doublesex的RNA探针;采用整体原位杂交方法研究dsx基因在不同生殖状态的蚤状溞的时空表达状况。结果显示,RT-PCR检测发现dsx在雌雄溞体没有性别特异性的选择性拼接,只有一种相同的转录产物。Real-time PCR显示,dsx在雄溞中表达水平最高,是孤雌溞的2.6倍,两性雌溞的4.9倍,三者之间有显著性差异,表现出性别差异性表达。整体原位杂交发现,在所取样的不同生殖状态溞体中dsx基因也均有表达,但其部位与表达量不同,且在雌雄溞体中表现出性别差异。在雄溞的第一触角和第一胸肢显现得尤为明显,且在复眼中也有表达。孤雌溞和两性雌溞对应部位表达则相对较弱。结果表明,dsx基因很有可能在调控蚤状溞生殖转换和性别分化上起到很大作用。     

不同烹饪方式及体外模拟消化对凡纳滨对虾主要过敏原原肌球蛋白免疫活性的影响

本研究选用水煮、油炸和红烧3种烹饪方式分别处理凡纳滨对虾,并且对烹饪后的虾肉进行体外模拟唾—胃—肠液连续消化,以调查烹饪处理后过敏原原肌球蛋白的免疫活性变化状况。采用电泳、免疫印迹和间接ELISA方法评价样品中主要过敏原原肌球蛋白的变化情况。SDS-PAGE结果显示,3种烹饪处理虾肉样品中TM条带无明显变化,表明TM在烹饪处理时基本不发生降解;免疫印迹和间接ELISA结果显示,水煮、油炸和红烧3种烹饪处理虾肉中TM免疫活性分别降低2.08%、11.33%、15.56%;而烹饪后虾肉的体外模拟消化产物的免疫活性丢失显著,水煮、油炸和红烧处理的免疫活性分别下降86.90%、88.94%、97.39%。研究表明,虾类TM免疫活性的降低主要发生在肠液消化阶段,3种方式烹饪处理能够使TM免疫活性降低,并且红烧处理可明显降低TM的免疫活性。本实验为过敏原消减机制的研究和低致敏性水产品的开发提供了理论依据。     

半滑舌鳎脾脏、卵巢组织细胞离体培养的初步研究

实验采用胰酶消化法,对半滑舌鳎脾脏、卵巢组织细胞进行离体培养,结果显示,脾脏、卵巢细胞能够在添加20%FBS,50 mmol/L 2-Me,100 U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,1mmol/L丙酮酸钠,10 ng/mLbFGF的MEM完全培养基中生长,两种细胞的形态均为成纤维样,脾脏细胞可传至第9代,卵巢细胞至今已传至第11代。脾脏、卵巢细胞染色体中期分裂相均为正常的二倍体核型(2n=42),且具有异型W染色体。20%的血清浓度更适用于卵巢细胞传代培养。利用脂质体可将含有RFP荧光报告基因的质粒成功转入脾脏细胞中。     

Evaluation of commercial live bakers’ yeast, Saccharomyces cerevisiae as a growth and immunity promoter for Fry Nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.) challenged in situ with Aeromonas hydrophila

This study was carried out to evaluate the use of commercial live bakers’ yeast, Saccharomyces cerevisiae as a growth and immunity promoter for Nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.). Fish (0.33 g) were randomly distributed at 25 fish per 140-L aquarium and fed a diet containing 0.0, 0.25, 0.50, 1.0, 2.0, or 5.0 g yeast/kg diet for 12 weeks. After the 12-week experimental period, fish of each treatment were challenged by pathogenic Aeromonas hydrophila, which was given by interperitoneal (IP) injection and kept under observation for 10 days to record clinical signs and the daily mortality rate. The growth-promoting influences of bakers’ yeast were observed with fish and the optimum growth, feed utilization, and protein turn-over were obtained with 1.0–5.0 g yeast/kg diet. Also, yeast supplementation increased protein deposition in fish body. Biochemical parameters were improved in fish fed yeast up to 1.0 g/kg diet. Total fish mortality 10-days after IP injection with A. hydrophila and its count after incubation with fish serum decreased with the increase of yeast level in fish diets. However, the lowest fish mortality and bacterial counts were obtained in fish fed 5.0 g yeast/kg. These results indicate that bakers’ yeast supplement is promising as an alternative method to antibiotics for disease prevention in tilapia aquaculture, and the optimum level of live bakers’ yeast is about 1.0 g per kg diet.