三角帆蚌不同蚌龄外套膜细胞的增殖能力及其矿化功能

研究了淡水珍珠贝——三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)在不同蚌龄下外套膜组织的细胞增殖及生物矿化相关因子活性。选择5组不同蚌龄三角帆蚌(0.5龄、1龄、2龄、3龄、4龄),通过流式细胞技术分析了外套膜细胞的增殖指数(proliferation index,PrI)和胞内Ca~(2+)浓度,并应用实时荧光定量PCR检测了与生物矿化相关的碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)基因的表达并测定其酶活性。结果表明, 2龄蚌的外套膜细胞PrI及胞内Ca~(2+)浓度显著高于其他蚌龄(P0.05);生物矿化相关基因在不同蚌龄的外套膜组织中表达量不同, 1龄三角帆蚌CA基因表达量和CA酶活性最高(P0.05), ALP基因表达量和ALP酶活在0.5龄三角帆蚌中显著高于其他蚌龄(P0.05)。本研究旨为深入探讨三角帆蚌外套膜细胞增殖能力及人工育珠过程中供体蚌的选择奠定基础。     

三角帆蚌hcSRCR1基因的克隆及在不同壳色选育系中的表达模式

清道夫受体(SR)是一类对化学修饰的脂蛋白具有很强结合活性的糖蛋白家族。本研究通过RACE方法克隆得到三角帆蚌hcSRCR1基因cDNA序列,该序列全长1 000 bp,其中开放阅读框819 bp,编码272个氨基酸,预测分子量为28.16 ku,理论等电点为5.55;预测含有2个SRCR结构域和6个保守的半胱氨酸残基。qRT-PCR和Western blot结果显示,hcSRCR1 mRNA和蛋白表达模式基本相同,均在三角帆蚌外套膜中表达量最高,在其他组织中的表达量普遍较低,且在紫色选育系外套膜组织中的表达量显著高于白色选育系。外套膜原位杂交结果显示,hcSRCR1基因主要在外套膜外褶的内、外上皮细胞层以及腹膜处的上皮细胞层中表达。研究表明,三角帆蚌hcSRCR1基因与贝壳珍珠质颜色形成具有一定相关性,可为进一步研究该基因在珍珠颜色形成过程中的调控机理提供基础资料。     

三角帆蚌溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1HcLPCAT1基因功能分析及壳色性状相关SNP筛选

溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 1(LPCAT1)是一种重要的脂质代谢酶。为明确三角帆蚌(Hyriopsis cumingii) HcLPCAT1 基因在类胡萝卜素代谢中的功能, 探究该基因与三角帆蚌壳色的相关性, 本研究采用 RACE 技术克隆获得 HcLPCAT1 基因 cDNA 全长 1675 bp, ORF 区 1296 bp 编码 431 个氨基酸; 实时荧光定量分析发现 HcLPCAT1 基因在紫色三角帆蚌各组织中表达量均高于白色三角帆蚌相应组织, 且在肝胰腺、外套膜中的表达量差异显著 (P＜0.05); 原位杂交检测到的阳性信号主要定位在外套膜的外褶、背膜区、腹膜区, 外褶与中褶连接处以及部分中褶; 紫色三角帆蚌补充投喂 β-胡萝卜素后, HcLPCAT1 基因在肝胰腺、中央膜、边缘膜各组织中表达量极显著上调 (P＜0.01), 同时相应组织中总类胡萝卜素含量(TCC)极显著升高(P＜0.01)。采用直接测序法鉴定出三角帆蚌 HcLPCAT1 基因 5 个 SNP 位点的基因型与内壳色存在显著相关性(P＜0.05), 单倍型分析发现 H1、H2 两种单倍型为紫色三角帆蚌优势单倍型, H3、H5、H6 三种单倍型为白色三角帆蚌优势单倍型。本研究鉴定的 HcLPCAT1 基因可为解析三角帆蚌类胡萝卜素代谢和壳色形成的机制提供研究基础, 筛选的与内壳色相关 SNP 及单倍型可用于分子辅助育种。     

三角帆蚌钙网蛋白基因cDNA的分子特征与表达分析

为研究淡水珍珠形成相关基因及调控机理,以三角帆蚌为研究对象,借助cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了三角帆蚌的钙网蛋白基因(calreticulin,HcCRT) cDNA序列,该序列长1 437 bp,包含231 bp的5'非编码区(untranslated region,UTR)和615 bp 3'UTR以及591bp的开放阅读框(ORF),共编码196个氨基酸残基,包含一段由21个氨基酸组成的信号肽和一段由175个氨基酸的成熟肽,分子量约为22.4 ku,理论等电点5.01.氨基酸序列分析表明,该序列不存在跨膜结构,疏水性分析显示该蛋白整体为亲水性蛋白.氨基酸列比对分析显示,HcCRT具有保守的钙网蛋白家族结构,具有2个保守的钙网蛋白家族标签序列:KHEQNIDCGGGYLKVF和IMFGPDICG,与其他已知物种的CRT具有较高保守性,其中与斑马鱼的相似度为77％,与长牡蛎和马氏珠母贝的相似度为70％.对三角帆蚌HcCRT蛋白序列的二级结构和三级结构进行预测分析,显示该蛋白同时含螺旋和折叠.实时荧光定量PCR分析结果显示,HcCRT在外套膜、血液、鳃、斧足、肝脏、肾脏、肠和闭壳肌等8个组织中均有表达,其中在外套膜中表达量最高,血液次之,在其他组织的表达量极少.初步推测HcCRT参与了三角帆蚌珍珠形成的生物矿化过程.     

三角帆蚌alpha-2巨球蛋白cDNA全长的克隆及表达特征

alpha-2巨球蛋白是河蚌体内重要的天然免疫因子,参与广泛的免疫防御和调节.通过RACE法克隆了三角帆蚌α2M全长cDNA序列,提交Genbank,获得核苷酸序列登陆号:DQ 993157.1.同时,采用生物信息学方法对alpha-2巨球蛋白进行了系统分析.该基因cDNA全长5 124 bp,其中编码区4 836 bp,5'端非编码区35 bp,3'端非编码区为253 bp(含polyA尾31 bp),该基因能编码1 611个氨基酸,其中前23个氨基酸残基为信号肽序列,成熟蛋白分子量为177 571.8 u,等电点为5.49.蛋白的不稳定系数为39.53,表明该蛋白是稳定的.在此基础上,以18 S作为内标,利用半定量RT-PCR法检测α2M基因在三角帆蚌不同组织和不同生理状态下的表达情况.结果表明,alpha-2巨球蛋白仅在血细胞中有表达,而在外套膜、闭壳肌、肠和性腺中没有表达.经注射大肠杆菌和嗜水气单胞菌12 h后,三角帆蚌体内α2M的表达水平都有一定量的升高,证明α2M是三角帆蚌基础免疫系统中的组成部分.本研究丰富了软体动物免疫学研究内容,为三角帆蚌抗病机理提供理论资料.     

三角帆蚌EFCB1基因cDNA序列克隆及表达研究

为了发掘更多三角帆蚌具有EF-hand结构域的功能基因及其蛋白质,本研究运用RACE-PCR技术,克隆得到了三角帆蚌包含EF-hand结构域钙结合蛋白1基因(EF-hand calcium-binding domain-containing protein 1,EFCB1)的cDNA全长并进行了生物信息学分析;通过real-time Q-PCR技术,分析了EFCB1基因在三角帆蚌10个组织,以及内脏团、外套膜插核后不同时间点的时空表达特点。结果表明三角帆蚌EFCB1基因cDNA序列全长981 bp,ORF为531 bp,编码176个氨基酸残基,5'-UTR 239 bp和3'-UTR 211 bp。EFCB1分子式为C₈₇₇H₁₃₄₈N₂₃₈O₂₇₀S₁₀,分子量约19.9 ku,等电点为4.70,不稳定系数为62.65,属亲水蛋白。其序列无信号肽序列,存在1个跨膜区域和2个EF-hand结构域,EF-hand模块分别为DLNDDKLISPEE(98-109)和DTNGDDKLDGEE(129-140)。荧光定量结果显示三角帆蚌EFCB1基因在各组织中均有表达,其中在肠和鳃中表达量最高(P<0.05),外套膜中表达量显著高于内脏团(P<0.05)。EFCB1基因在插核后不同时期的外套膜和内脏团育珠部位组织中表达具有显著差异(P<0.05),在外套膜中的表达量均显著高于内脏团(P<0.05),在插核后第20 天时表达量显著高于各时期(P<0.05)。研究表明,EFCB1在三角帆蚌Ca²⁺的吸收过程中发挥调节作用,在珍珠囊形成过程中以及珍珠形成初期具有重要功能。     

三角帆蚌种质资源研究进展

三角帆蚌是我国优良的淡水育珠蚌,具有重要的经济价值。本文从我国三角帆蚌种质资源调查、搜集与保护出发,介绍了三角帆蚌RAPD、SSR及线粒体基因片段等不同分子标记开发状况,重点讨论了这些分子标记分析三角帆蚌遗传多样性的情况。比较了我国五大淡水湖泊三角帆蚌种质及3个优秀种质9个F1后代的生长性能,比较了三角帆蚌雌雄生长差异。简述了三角帆蚌珍珠质形成相关基因、免疫相关基因、贝壳及珍珠颜色相关基因的研究现状。从三角帆蚌与其他蚌类种间杂交、三角帆蚌种内杂交,介绍了培育康乐蚌新品种的过程及三角帆蚌家系选育的进展情况。对今后进一步开展三角帆蚌种质资源研究提出了意见和建议,为三角帆蚌遗传改良提供了基础资料。     

插核手术对三角帆蚌血淋巴中 3 种免疫防御因子的影响

对三角帆蚌(Hyriopsls cumingii Lea)进行内脏团插核手术,并对术后机体免疫相关因子基因alpha-2巨球蛋白(α2M)、酶酸性磷酸酶(ACP)和超氧化物歧化酶(SOD)的变化情况进行研究,旨在为三角帆蚌内脏团育珠实践提供理论依据.实验选取100只健康三角帆蚌分为2组(各50只,每组各设5个重复,每重复各10只蚌),一组在蚌体内脏团进行插核手术(实验组),一组未经处理(对照组),分别饲养于相同条件恒温(24℃)淡水缸内.两组分别于插核后1天、2天、3天、5天及10天采集淋巴血,通过RT-PCR及酶活测定法研究α2M基因表达和ACP、SOD在术后活性的变化.结果发现,α2M基因在手术后表达量增加,在插核后第3天和第5天与对照组差异显著(P＜0.05);实验组血清和血细胞中ACP活性均显著高于对照组;实验组血清中SOD活性在第3天、5天、10天高于对照组(P＜0.05);实验组血细胞中SOD的活性低于对照组.本研究表明,内脏团插核手术后三角帆蚌机体的免疫防御调节增强,血液中免疫相关基因α2M的表达水平和免疫相关酶ACP和SOD活性均有明显变化.     

Ca2+在三角帆蚌体内沉积效应的研究

设计5种不同Ca^2 浓度的人工养殖水体，每1种浓度梯度又划分为2个不同的类别：添加藻类的水体和不添加藻类的水体。用EDTA滴定法测定三角帆蚌的肝脏、外套膜、斧足中钙含量。①水体藻类的丰富程度对三角帆蚌外套膜中钙的沉积作用并不大；②外界水体的钙浓度过高时三角帆蚌肝脏吸收钙的水平反而下降；③在不同外界水体钙浓度作用下，钙在外套膜中的沉积量没有差异。     

三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术构建了三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库。经检验，差异表达基因均被富集了 2¹⁰倍左右，证明构建的 cDNA 消减文库具有很强的消减效率。PCR 鉴定发现，在随机挑取的阳性克隆中，95% 的克隆均含有 0.2～1.0 kb 的插入片段，这些片段可能是三角帆蚌瘟病病毒感染后差异表达基因的cDNA片段。测序共获得 214 个有效 cDNA 序列，分别属于8 大类，共 98 个基因。其中细胞分裂基因 2个、细胞结构与运动基因 9 个、代谢基因 10 个、信号传导基因 7 个、细胞防疫基因 10 个、基因与蛋白表达基因 20 个、未知功能蛋白基因 26 个，GenBank中找不到任何同源序列的基因 14 个。结果说明，构建的差异表达cDNA文库，可较好地反映三角帆蚌瘟病病毒对三角帆蚌影响的基因信息。     

3种淡水蚌消化酶活力的初步研究

对褶纹冠蚌、背角无齿蚌、三角帆蚌的淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶进行了测定和研究。结果显示,3种蚌的3种消化酶的比活力大小顺序均为:褶纹冠蚌>背角无齿蚌>三角帆蚌。3种消化酶比活力在3种蚌的胃、肠部大小顺序均为:淀粉酶>纤维素酶>蛋白酶,且胃部3种酶比活力都大于肠部。A/P值比较显示,背角无齿蚌适合投放到淀粉物质含量较高的藻类富集水域,褶纹冠蚌适合用来控制蛋白质含量丰富的藻类,三角帆蚌对淀粉类和蛋白类食物消化能力介于二者之间,对蓝绿藻食物源都有很好的适应性。     

M、F型COII基因在雌雄三角帆蚌不同发育时期的表达差异研究

与传统的母系遗传不同,双壳贝类线粒体有M和F型2种mt DNA,称为双单亲遗传(doubly uniparental inheritance,DUI)。为了探究DUI的形成机制,实验利用RACE方法得到三角帆蚌M、F-type COⅡ基因的cDNA全长;荧光定量检测各时期各组织中M、F-type COⅡ基因的表达。结果发现,(1)M-type COⅡ基因的cDNA序列全长1244 bp,F-type COⅡ基因的cDNA序列全长808 bp,M型3′端较F型有一段546 bp的特异性延长序列;跨膜结构预测显示M-type COⅡ基因3′特异性延伸区域有4个跨膜结构,推测这段延伸序列具有一定的功能性;(2)早期幼龄(胚胎期-5月龄)三角帆蚌的组织团中,M、F-type COⅡ基因均能检测出,且同时期中F-type COⅡ基因的表达量显著高于M-type COⅡ;(3)6月龄蚌各组织中,F-type COⅡ基因在各组织中表达量明显高于M型的表达量,而M-type COⅡ基因在性腺中表达明显高于其他组织;(4)一龄雌性各组织中,M、F-type COⅡ基因均有表达;而一龄雄性各组织中,M-type COⅡ基因仅在性腺中表达;(5)二龄雌性各组织中,M、F-type COⅡ基因均有表达;二龄雄性各组织中,F-type COⅡ基因除性腺外的其他组织中均有低量表达,M-type COⅡ基因仅在性腺中表达,且表达量较高。研究表明,在三角帆蚌雌雄个体发育过程中,M-type mt DNA在组织中选择性降解或聚集。     

三角帆蚌活化蛋白激酶C受体1基因(HcRACK1)的克隆及表达分析

为了探究RACK1基因在三角帆蚌免疫系统中的调控机制,采用RACE技术克隆得到三角帆蚌RACK1基因(命名为HcRACK1)的c DNA全序列,并对该序列进行分析。结果显示,HcRACK1基因全长为1249 bp,其中开放阅读框957 bp,编码318个氨基酸。蛋白质结构域分析显示HcRACK1含有RACK1家族特有的7个WD40结构域。运用荧光定量PCR技术分析HcRACK1在正常组织中及受到嗜水气单胞菌侵染和重金属镉暴露后相关组织表达量的变化。结果显示,HcRACK1在各个组织中均有表达,其中闭壳肌中表达量最高;嗜水气单胞菌侵染后,HcRACK1在血淋巴中的表达量逐渐上升,24 h时达到峰值,随后下降;暴露在100μg/L浓度的重金属镉中,HcRACK1在肝胰腺中的表达量逐渐上升,在第3天达到峰值;血淋巴在第2天达到峰值,随后下降;鳃中HcRACK1的表达量无明显变化。上述结果表明,Hc RACK1与细菌及镉引起的机体的氧化应激反应有关,并能参与到机体的免疫反应中。     

小片与蚌间的关系对珍珠质量的影响

本研究采用褶纹冠蚌同一个体自体外套膜小片育珠,结果珍珠质量明显提高。采用三角帆蚌制取外套膜小片植入褶纹冠蚌。结果珍珠质量极差,大多数蚌产不出珍珠;采用褶纹冠蚌制取外套膜小片植入三角帆蚌,结果三分之一的蚌能得到质量高于褶纹冠蚌,产量高于三角帆蚌的珍珠。作者认为供片蚌和受片蚌间相适关系影响珍珠质量,研究如何提高褶纹冠蚌小片在三角帆蚌体内成珠的比率,在生产上是很有意义的。     

体外培养三角帆蚌外套膜细胞的生物学特性及有核珍珠培育

通过光学显微镜、透射电镜、流式细胞仪等方法对体外培养的三角帆蚌(Hyriopsis cumingiiLea)外套膜细胞进行观察和检测,证明其具有与蚌体内细胞相同的生物学结构、分裂增殖能力和分泌珍珠质的生物活性。在此基础上,对三角帆蚌有核珍珠培育技术进行探讨。将培养细胞黏附在表面经过促黏壁物质处理的珠核表面,再插入育珠蚌体内培育,120 d后,蚌体内可形成完备的珍珠囊,并在珠核表面有明显的珍珠质沉积;6个月后,珍珠质可将整个珠核包裹起来形成有核珍珠。本研究初步证明了细胞法培育有核珍珠的可行性。[中国水产科学,2007,14(1):149-154]     

应用激光共聚焦显微技术研究Ca2+在三角帆蚌组织内的积累与分布

为了探讨淡水贝类Ca2+吸收和转运信号传递机理,采用激光共聚焦技术研究了三角帆蚌不同组织细胞在静息状态下细胞内游离Ca2+浓度,以及水体Ca2+浓度对外套膜组织细胞内钙沉积的影响。试验选取10只健康的三角帆蚌,分别获得外套膜外膜、内膜、斧足、腮及内脏团上表皮组织细胞,短期培养后用Fluo-3/AM荧光探针孵育细胞1 h,观察细胞内Ca2+荧光强度。研究结果表明,蚌不同组织细胞内Ca2+荧光强度存在显著差异,外套膜外膜细胞内Ca2+荧光强度最高,内脏团上表皮细胞的最低(P<0.05);育珠三角帆蚌在相同Ca2+浓度的孵育水平下,外套膜细胞内Ca2+荧光强度比非育珠蚌都有增加的趋势,其中在1.25 mmol/L添加组中,两组外套膜内膜细胞内Ca2+荧光强度差异达到显著水平(P<0.05);不同Ca2+孵育水平对细胞内Ca2+荧光强度有显著影响(P<0.05),随着Ca2+在孵育液中浓度的升高,外套膜细胞内Ca2+荧光强度显著增强(P<0.05),表明外套膜是从外界吸收Ca2+的主要组织,蚌体珍珠的培育增强了其对Ca2+的沉积,并且水体Ca2+浓度在1.25～3.00 mmol/L有助于蚌体内Ca2+的贮藏,这对进...     

Microarray analysis of differential utilization of plant-based diets by rainbow trout

Microarray analysis was conducted using liver samples from two families of rainbow trout that differed in their growth responses when compared between individuals fed a fishmeal or plant protein-based diet. Differential expression relating to dietary utilization between the two families found significant changes in expression of 33 expressed sequence tags (ESTs). Eight of the differentially expressed ESTs had identified mammalian homologs that had been previously researched with identified cellular interactions and functions. Utilizing pathway analysis software to analyze sequences annotated with known mammalian genes, we were able to map gene pathways and process interactions. From this information, we were able to infer that the metabolic changes associated with utilization of plant protein versus fishmeal were associated with differential regulation of genes related to cell oxidative stress, proliferation, growth and survival. Furthermore, we inferred from the changes we observed in immune response gene expression that ingestion of this plant-based diet upregulated the expression of genes involved in immunoregulatory processes.     

嗜水气单胞菌感染翘嘴鳜头肾转录组分析

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是严重危害翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)养殖生产的主要病原之一，为揭示嗜水气单胞菌感染翘嘴鳜后宿主基因表达水平的变化，筛选免疫相关基因，解析翘嘴鳜应答病原细菌感染的分子机制，本研究以病原嗜水气单胞菌感染翘嘴鳜，于感染24 h后，采集感染组与对照组翘嘴鳜头肾组织，采用Illumina Hiseq 2000进行了RNA-Seq分析，原始数据拼接后组装共获得53 040个单基因(unigene)。基因差异表达分析结果显示，感染组和未感染组翘嘴鳜存在526个差异表达基因，包括254个上调基因和272个下调基因，其中，免疫相关的显著上调的差异基因主要有炎症和免疫原性细胞因子白介素、补体系统、MHCⅠ型抗原提呈、溶菌酶、丝氨酸蛋白酶抑制因子、泛素蛋白连接酶等。GO富集分析发现，差异基因主要涉及免疫应答反应和炎症反应等，经KEGG富集分析显示，89个通路富集显著，免疫相关的代谢通路主要有内吞作用和吞噬体等。此外，实时荧光定量PCR验证结果表明，所选取7个差异表达免疫相关基因与RNA-seq结果具有相似的表达趋势。本研究为揭示翘嘴鳜对病原微生物感染的防御分子机制奠定了理论基础。