水稻脆秆突变体bc16的鉴定和基因精细定位

脆秆突变体是一类研究植物机械强度的重要材料。利用EMS(甲基磺酸乙酯)诱变粳稻品种日本晴,筛选获得一个脆秆突变体,命名为bc16(brittle culm16)。与野生型植株相比,bc16茎秆、叶片和根明显变脆,而株高、穗粒数降低,穗长和主根长变短。茎秆细胞壁成分分析表明,bc16纤维素含量显著低于野生型植株,半纤维素含量则显著增加,而木质素含量差异不显著。突变体bc16薄壁细胞形状无规则、排列紊乱,表皮层下厚壁细胞次生壁和薄壁细胞壁变薄。遗传分析表明bc16突变体由隐性单基因控制,位于水稻第2染色体长臂端InDel标记2-F和2-H间66.6kb的区间内。该区间共有7个候选基因,其中Os02g0738900是bc3脆秆基因的等位基因。测序结果表明,bc16突变体中的Os02g0738900基因从ATG开始第5113位,在第13内含子近末端发生了T→A的置换,导致转录过程中该内含子末端6个核苷酸被剪切到mRNA中,最终导致翻译提前终止。实时荧光定量PCR结果表明Os02g0738900基因在bc16脆秆突变体根、茎、叶中的表达量降低。bc16基因可能通过调控厚壁组织次生细胞壁和薄壁细胞初生壁的合成来影响水稻茎秆机械强度。     

水稻脆秆突变体bc1-wu3的鉴定与基因克隆

【目的】茎秆机械强度与植株抗倒伏性直接相关。发掘脆秆突变体,克隆其相关基因有助于了解茎秆机械强度遗传机制,为抗倒伏育种提供理论依据。【方法】在经~(60)Co-γ诱变的粳稻品种武育粳3号后代群体中获得一个脆秆突变体,命名为bc1-wu3(brittle culm 1 from Wuyujing3),以突变体bc1-wu3为母本,Kasalath为父本构建相应的F_2分离群体,采用图位克隆的方法定位相应脆秆基因。【结果】与野生型相比,突变体的叶片、叶鞘、茎秆等组织在全生育期始终表现为脆性,易折断;穗长和粒长显著降低,粒宽显著增加。茎秆细胞细胞壁糖成分测定表明,细胞壁中纤维素含量极显著下降,而木糖、葡萄糖及阿拉伯糖含量则显著增加。茎秆切片观察发现突变体茎秆的厚壁细胞层数减少,厚壁细胞细胞壁极显著变薄。遗传分析表明,bc1-wu3脆性性状受1对隐性核基因控制。采用图位克隆的技术将该基因定位于第3染色体标记MK12与MK18之间,物理距离为57 kb,在此定位区段内包含1个已克隆的脆性基因BC1(LOC_Os03g30250)。测序结果表明,突变体bc1-wu3中BC1基因第2外显子内(CDS 659处)有1个碱基的替换(G-T),导致编码氨基酸由半胱氨酸变异为苯丙氨酸。实时荧光定量PCR结果表明,BC1基因在脆秆突变体bc1-wu3茎秆中的表达量显著降低。【结论】据此推断本研究中定位的脆秆基因bc1-wu3为BC1新等位基因。相关结果加深了对BC1基因功能的认识,有助于阐明水稻茎秆强度遗传机制。     

水稻脆茎突变体的主要性状比较研究

以利用重离子辐照诱变获得的7个水稻脆茎突变体为材料,对其主要农艺性状、茎秆脆性和细胞壁组分等进行了比较研究。结果表明,与野生型对照相比,脆茎突变体部分农艺性状存在显著差异,成熟期秸秆粉碎率大幅提高,茎秆抗折力显著下降,细胞壁中纤维素含量显著下降,而半纤维素含量显著产加。茎秆抗力与纤维素含量呈极显著正相关,与半纤维素含量呈极显著负相关。水稻脆茎突变体cef2成熟期茎秆表现脆性,农艺性状和产量优于野生型对照,后期不易倒伏,收获时秸秆易粉碎,秸秆纤维素降解效率高于野生型对照,是一个优良的水稻脆茎材料。     

水稻同源异型域转录因子OsHox9的反向遗传学分析

同源异型域(Homeobox,HB)转录因子对于植物的生长发育具有重要的调控作用,主要涉及细胞分化、形态建成、内外环境信号应答等多个方面。为了研究该转录因子家族成员在水稻中的功能,构建了该家族成员OsHox9基因的RNAi表达载体,利用反向遗传方法分析该基因的功能。与野生型对照植株相比,RNAi转基因植株株高变矮,分蘖数减少。实时PCR表达分析表明OsHox9基因在有表型转基因植株中的表达下调,但在没有表型转基因植株中OsHox9表达量与野生型植株差异不显著,说明RNAi载体起到了干涉作用,转基因植株的表型是由RNAi造成的。组织特异性表达分析表明OsHox9在水稻的根、茎、叶、茎顶端分生组织及不同时期的幼穗中均有表达,但在茎顶端分生组织及幼穗中表达量较高。为了查明OsHox9的亚细胞定位,构建了OsHox9与绿色荧光蛋白GFP的融合载体并导入烟草叶片中进行瞬时表达,结果表明OsHox9定位于细胞膜上,在细胞膜上起作用。     

水稻磷脂酰丝氨酸合酶SUI1在烟草叶肉细胞中的定位

在克隆水稻编码磷脂酰丝氨酸合酶的短穗颈基因SUI1的基础上,利用Gateway方法分别构建了N端和C端两种GFP融合载体pMDC45-SOVT和pMDC201-SOV。利用农杆菌侵染烟草叶片的方法,观察SUI1蛋白在烟草叶肉细胞中的瞬时表达情况,结果显示GFP-SUI1定位于质膜和核上,而SUI1-GFP定位于质膜和核膜上,并且两种融合蛋白在质膜上的分布都是不连续的。由于N端融合可能改变了目标蛋白的折叠方式及跨膜方式,从而影响蛋白的正确定位,因而SUI1蛋白主要定位于烟草叶肉细胞的质膜和核膜中。     

水稻OsDUF393基因编辑突变体的创建

DUFs家族是一类未知功能结构域蛋白家族,转录谱和蛋白谱分析发现,DUFs蛋白在生物的生长和发育中发挥着至关重要的作用,因此对DUFs基因功能的研究将有助于了解生物体复杂的生长发育机制。目前该家族基因功能仍鲜见报道。为了探究水稻(Oryza sativa)OsDUF393(Domains of Unknown Function 393)基因的生物学功能,利用CRISPR/Cas9技术构建了水稻DUFs家族基因OsDUF393的载体,同时利用农杆菌介导的遗传转化将构建的CRISPR/Cas9载体转化水稻品种中花11中,经潮霉素抗性基因鉴定,获得了100株T0代转基因植株。对转基因植株的靶位点进行测序分析后发现有单碱基插入和大片段DNA序列缺失2种类型。通过RT-PCR分析突变体中OsDUF393基因的表达水平,结果表明,目的基因在不同纯合编辑突变体中转录水平均有下降。上述结果表明,CRISPR/Cas9重组载体成功实现了对OsDUF393基因的定向编辑。这些编辑突变体材料为后续该基因功能研究奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除水稻NRR基因促进根系生长的研究

水稻营养应答和根生长基因NRR(Nutrition response and root growth)是一个多效基因,负调控水稻根系生长并参与调控营养组织淀粉合成。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻品种空育131的NRR基因进行编辑,获得2个NRR基因敲除的非转基因纯合突变体。突变体植株在各种营养条件下(有氮磷钾、无氮、无磷、无钾、无氮磷以及无氮磷钾)其幼苗主根长度、单株根数和根鲜重都显著高于野生型,这说明敲除NRR基因能够显著改良水稻的根系生长,为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术快速改良水稻品种的根系生长提供了一种有效策略。     

水稻花期特异表达基因的cDNA和RNA阵列检测

用水稻孕穗期、开花期总mRNA为探针与含有2200个独立基因的cDNA阵列杂交,以检测开花期群体基因的表达谱。结果发现,在所获得的1720个有效克隆当中,有472条基因表达下调（占27.44％）,892条为持家基因（占51.86％）,356条基因表达上调（占20.70％）。表达上调的基因中有250个功能已知（占14.53％）,106个是功能未知的新基因（占6.16％）。其中S 腺苷甲硫氨酸还原酶、查尔酮合酶、酰基载体蛋白Ⅱ基因、过敏反应蛋白、醇溶蛋白、3-酮脂酰载体蛋白合酶Ⅲ和β-D-(1→3)-葡聚糖外水解酶等基因参与水稻开花和胚胎发育过程。为了进一步验证它们与开花过程的相关性,选取查尔酮合酶、酰基载体蛋白Ⅱ、醇溶蛋白、S-腺苷基甲硫氨酸还原酶和过敏反应蛋白等5个基因为探针,与755个水稻RNA斑点阵列进行杂交。结果证实醇溶蛋白和过敏反应蛋白基因受发育调节在乳熟成穗中高表达,查尔酮合酶和S-腺苷基甲硫氨酸还原酶基因在叶片中受光诱导、在根中受缺氮胁迫时高表达。在所有表型中,查尔酮合酶、S-腺苷基甲硫氨酸还原酶和酰基载体蛋白Ⅱ基因有相近的表达趋势,过敏反应蛋白和醇溶蛋白基因的表达趋势也相近。     

水稻OsF-box基因表达的初步研究

为研究水稻中OsF-box基因的功能,构建了该基因的RNAi表达载体转化水稻日本晴,通过PCR、Southern-blot鉴定出阳性植株.与野生型植株相比,阳性植株抽穗期延迟,且在进入生殖生长期后出现很多高位分蘖.进一步克隆了OsF-box基因的启动子序列,构建与GUS报告基因融合表达载体转化水稻,染色结果表明,该基因在水稻茎秆和花药部位有明显的表达,而根和叶片中没有检测到明显的表达活性.     

水培茶树累积铅在细胞内分布的TEM-EDS超微定位表征

应用水培茶树模式,采用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)和X射线能谱仪(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)相结合的手段,对铅盐水培茶树根、茎、叶细胞内Pb2+的累积部位与分布水平进行观测与分析。结果表明:茶树根细胞中的铅均匀地分布于细胞壁上,且数量最多,质膜、细胞质和液泡膜上的铅较少,细胞间隙等部位的铅最少;嫩茎细胞壁中的铅颗粒小、数量多,质膜、液泡膜及叶绿体上数量较少;叶片细胞中的铅则主要分布在质膜和液泡膜上,细胞壁中的铅较少。     

磷对水稻耐铝性及根尖细胞壁组分的影响

 为阐明外源磷供应引起水稻体内磷代谢和根尖细胞壁组分变化进而阐述磷、铝间的相互作用,以水稻菲优多系1号(耐铝毒基因型)和红良优166(铝毒敏感基因型)为材料,水培条件下先用0.5、10和30 mg/L磷预处理9 d,然后用50 μmol/L Al处理48 h,研究铝毒胁迫下磷对水稻根尖的防护效应及磷作用下根尖细胞壁组分变化与水稻耐铝性的关系。结果表明,50 μmol/L Al处理抑制水稻总根长,尤其是在0.5 mg/L磷预处理后用铝交替处理时该作用更为明显。铝毒胁迫下,0.5 mg/L磷预处理时两基因型水稻叶片的丙二醛(MDA)、抗坏血酸(ASA)、游离脯氨酸(Pro)含量显著高于其他处理,10 mg/L和30 mg/L磷预处理显著降低两基因型水稻叶片的MDA、ASA和Pro含量,表明充足的磷供应减轻了铝对水稻的伤害。耐铝毒水稻根尖的果胶和半纤维素2含量在30 mg/L磷与铝交替处理时显著低于0.5 mg/L 和10 mg/L 磷与铝交替处理,根系的酸性磷酸酶(ACP)活性在0.5 mg/L磷与铝交替处理时显著高于10 mg/L与30 mg/L磷与铝交替处理。而铝毒敏感水稻的根尖细胞壁多糖组分含量、ACP活性在不同浓度的磷、铝交替处理间无显著差异。表明铝耐性水稻在缺磷条件下通过提高ACP活性以提供更多的Pi与铝结合钝化铝,在磷充足条件下通过降低细胞壁多糖含量以减少铝结合位点,进而提高铝毒耐性。     

水稻抗倒伏性状的分子机理研究进展

倒伏是水稻高产稳产的一个重要限制因素。水稻倒伏主要受植株形态、茎秆结构与细胞壁成分的影响。近年来,随着水稻基因组学和分子生物学的发展,水稻抗倒伏性状的研究已逐渐从植株表型分析发展到分子水平调控机理解析。本文综述了水稻株型、茎秆特性与细胞壁化学组成对水稻抗倒伏性状影响的分子机理。这些研究为水稻抗倒伏分子育种奠定了重要的理论基础。     

水稻白化致死突变体abl4的鉴定和基因定位

 从60Co诱变的粳稻中花11 M2代中发现了一个白化致死突变体,该突变体从发芽后至3叶期一直表现白化,3叶后逐渐死亡,根据随后的基因定位研究结果,将该白化突变体暂定名为albino lethal 4 (abl4)。与野生型相比,abl4突变体的叶绿素含量与类胡萝卜素含量极低,几乎难以检测到。叶绿素荧光分析结果表明,abl4叶片中的电子传递速率和实际光化学效率都为0,而最大光化学效率也极低,显示突变体没有光化学活性。abl4突变体中包括过氧化物酶、超氧化物歧化酶在内的抗氧化酶活性显著升高,过氧化氢酶（CAT）活性显著下降,脂质过氧化产物丙二醛含量显著提高,提示abl4突变体受到氧化胁迫。电子显微镜观察表明abl4不能形成完整的叶绿体,只有类似前质体结构。遗传分析表明,该突变表型受一对隐性核基因控制。利用abl4突变体与籼稻品种龙特甫B杂交获得的F2分离群体进行基因定位,首先将该基因定位于水稻第4条染色体上的SSR标记RM3785和RM303之间。随后,利用新开发的STS和dCAPS标记,进一步将ABL4 基因定位在RH46 31和RH46 33之间,物理距离约为201 kb。      

水稻显性脆秆突变体Bc18的鉴定和基因定位

从三交组合Ⅱ-32B//协青早B/Dular的F₂群体中获得了1个脆性突变体,整个植株表现全生育期脆性。根据该突变体的表型,将其命名为Bc18(Brittle culm 18)。为了更好地鉴定该突变体,用正常茎秆强度品种中9B作轮回亲本与Bc18杂交,创制了Bc18脆秆近等基因系中脆B和中9B。表型鉴定显示,突变体Bc18在生育期、株高、单株穗数、每穗粒数、结实率和千粒重等主要农艺和产量性状上与野生型中9B 无显著差别,但茎、叶的机械强度分别下降了70.70%和47.16%。细胞壁组分分析表明,突变体Bc18茎、叶的纤维素和木质素含量与野生型中9B 无显著差异,但半纤维素含量分别提高了31.84%和17.35%。6个杂交组合F₂和12个回交BC₁F₁群体的遗传分析证明Bc18 脆性突变由单显性基因控制。采用图位克隆技术,构建了Bc18/02428和Bc18/9311的F₂定位群体,并利用网上公布的SSR标记和新设计的InDel标记,最终将Bc18基因定位在第1染色体长臂端InDel标记PBC22与PBC33之间约154 kb的区间内。     

Biocontrol of rice blast by the phenaminomethylacetic acid producer of Bacillus methylotrophicus strain BC79

Strain BC79, isolated from primeval forest soil in Qinling, Mountains, China, was identified as Bacillus methylotrophicus based on morphological, biochemical, physiological and chemotaxonomic analyses as well as phylogenetic 16S rDNA sequencing data. This strain was able to suppress mycelial growth and conidial germination of numerous plant pathogenic fungi in dual cultures on solid media. For exploring potential biocontrol activity, we assessed fermentation conditions for studying B. meth1ylotrophicus BC79. The active substance of BC79, phenaminomethylacetic acid, was extracted by TLC and HPLC, and identified as the strongest inhibitory substance described in B. methylotrophicus. Experiments in a greenhouse showed that application of BC79 culture filtrates 24 h before inoculation of Magnaporthe oryzae, the causal agent of rice blast, had 89.87% biocontrol efficiency. B. methylotrophicus BC79 colonized rice plant tissues and at 10 days after filtrate application, its population in leaves (1.65 × 10⁸ CFU/g) was much larger than in stems (6.78 × 10⁷ CFU/g) or roots (3.56 × 10⁷ CFU/g). Field trials indicated that BC79 culture filtrate (4000 g/667 m²) showed the highest efficiency for M. oryzae, with 84.8% biocontrol effect, followed by of 15% phenaminomethylacetic acid extract (75.5%) and 20% tricyclazole (76.1%). Seedling and post-transplant stages were the best periods to apply BC79 for control of rice blast. The B. methylotrophicus BC79 strain hence has enormous potential as an agricultural agent for biocontrol of rice blast.     

Cadmium Accumulation and Its Toxicity in Brittle Culm 1 （bcl）, a Fragile Rice Mutant

Cadmium （Cd） accumulation and toxicity in rice plants were characterized and identified by using brittle culm 1 （bcl）, a fragile rice mutant and its wild type （Shuangkezao, an indica rice） as materials by hydroponics. The low Cd level didn＇t obviously affect the growth parameters in both rice genotypes, but under high Cd levels （1.0 and 5.0 μmol/L）, the growth of both rice plants were substantially inhibited. Moreover, bcl tended to suffer more seriously from Cd toxicity than Shuangkezao. Cd accumulation in both rice plants increased with the increase of Cd levels. There was a significant difference in Cd accumulation between the two rice genotypes with constantly higher Cd concentration in bcl, which also accumulated more Cd at 0, 0.1, and 1.0 μmol/L Cd levels. The same case was found in the two rice plants grown on Cd-contaminated soil. This suggested that cell wall might play an important role in Cd accumulation in rice plants by the physiological mechanisms. The malondialdehyde （MDA） content, superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） activities in rice plants were affected differently under Cd treatments, and which implied that POD might play the main role in detoxifying active oxygen free radical. A significant difference in antioxidative system between the two rice genotypes was found with constantly higher MDA content, SOD and POD activities in bcl. In summary, bcl accumulated more Cd and appeared to be more sensitive to Cd stress compared with its wild type.     

云南元阳哈尼梯田水稻地方品种月亮谷的遗传变异分析

 为了揭示云南元阳哈尼梯田持续大面积种植的水稻地方品种月亮谷的遗传变异,利用20个表型性状和48个SSR标记,对采自元阳哈尼梯田11个村寨的98份月亮谷和8份对照品种进行分析。结果显示,98份月亮谷的质量性状变异系数较小;数量性状变异系数较大,变异系数范围为2.55%~24.90%;48个标记共检测出114个等位变异,平均为2.38个,变幅为1~4个;有效等位变异为87.65个,平均为1.83个,变幅为1~3.02;Nei遗传多样性（I）指数平均为0.64。表型聚类将月亮谷与对照品种分成两大类,所有月亮谷为一类,8个对照品种为另一类;SSR聚类则将所有月亮谷与4份籼型对照品种聚为一大类,4份粳型对照品种单独为一大类;分子方差分析（AMOVA）表明,月亮谷村寨之间变异（67.18%）大于村寨内（37.82%）。11个村寨月亮谷可以分成5个居群,这5个类群与其村寨间地理位置的距离相关,相邻村寨之间月亮谷遗传距离小,遗传相似度高。月亮谷这种特殊的遗传变异是由于独特的哈尼梯田及其传统文化长期作用的结果,月亮谷可作为优异基因资源进一步发掘和利用。     

有序摆抛栽对超级稻植株抗倒伏能力的影响

以粳型超级稻武运粳24和南粳44为试材,设置摆栽、点抛和撒抛三种抛栽方式,并以机插为对照,从茎秆抗折力、茎秆壁厚、节间长度、粗度、干质量等方面系统研究了有序摆抛稻的茎秆特性及其抗倒伏能力,结果如下:1)超级稻不同抛栽方式间抗倒伏能力差异显著,茎秆倒伏指数不同抛栽方式间表现为摆栽点抛撒抛、机插,基部节间抗折力、弯曲力矩和抗倒伏能力均表现为摆栽点抛撒抛、机插。就各抛栽方式下不同连孔处理而言,基部N1节间倒伏指数差异不显著,N2、N3、N4抗倒伏能力表现为2连孔、3连孔单孔。2)有序摆抛栽水稻相对重心高度稍低,成熟期茎鞘干物质量大,单穗干质量大,尤其2连孔和3连孔植株优势明显。不同抛栽方式间基部节间粗度、壁厚、节间质量和单位干质量表现为摆栽点抛撒抛,不同连孔处理间为2连孔3连孔单孔。除基部第1节间外,节间长度在抛栽方式间表现为摆栽点抛撒抛的趋势,不同连孔节间表现为2连孔、3连孔单孔的趋势。2连孔、3连孔钵苗有序摆抛在高产条件下稻株茎秆粗壮,节间短粗,节间壁厚,茎秆单位节间重,基部节间抗折力大,抗倒伏能力强,是一种利于提高水稻抗倒能力的新型水稻轻简高产栽培方式。