水稻GA20ox-2基因mRNA的TaqMan荧光定量RT-PCR检测

成功建立了一项基于TaqMan 实时荧光定量的RT-PCR技术,定量分析水稻半矮化关键基因之一GA20ox-2转录水平.该技术体系中重组质粒标准品的制备方法具有很好的实用性;质粒标准品对基因GA20ox-2表达的实时定量准确、可靠、便捷.标准曲线表明,所建立的GA20ox-2基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,灵敏度高,可达102拷贝;线性范围广,可达102～107拷贝;扩增效率高(E=100.3%);稳定性、重复性好,可靠性高,批内和批间变异系数仅分别为0.12%～0.31%和0.21%～0.34%;循环阈值与PCR 体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r＝0.999),可对GA20ox-2基因表达进行准确实时定量.     

水稻低丰度表达基因OsAMT1;3实时荧光定量PCR方法的建立及其应用

采用实时荧光定量PCR技术,通过使用特异引物,对水稻中的低丰度表达基因OsAMT1;3进行了转录水平上的定量分析,成功建立了可检测低丰度表达基因的SYBR Green实时荧光定量PCR技术平台。该方法具有很好的准确性和实用性。获得的荧光定量PCR扩增曲线,基线平整,指数区明显,斜率大且固定;线性范围广,17～36个循环都能测出;稳定性、重复性好,变异系数仅为0.47%;标准曲线表明,循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,可对基因表达进行相对定量;缺氮条件下OsAMT1;3 与纯NH4+处理相比表达量增加4倍以上。     

半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。     

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)实时荧光定量PCR检测方法的优化及应用

选用茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)基因组中序列特异性很高的p16基因为目标基因,通过设计引物、PCR扩增、目的片段与载体连接转化获得含p16基因的重组质粒进行测序,进而以经测序鉴定的p16基因的PCR纯化产物作为实时荧光定量PCR标准品模板,稀释后建立SYBR Green I荧光定量标准曲线,统计分析显示标准品浓度的对数值与Ct值之间存在良好的线性关系(R2=0.9981)。该方法的检测灵敏度为102,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间变异系数均小于3%。同时分别对含有其他茶树害虫病毒和不同浓度的茶尺蠖病毒产品的样品进行检测,能明确样品中是否含有EoNPV及含量。根据已建立的方法对感染病毒后不同时间段的茶尺蠖幼虫进行检测,每克幼虫样本内p16基因拷贝数的增殖倍数对数值与感染时间呈正相关(R2=0.9935),可以获得茶尺蠖幼虫感染病毒后不同时间的增殖动态。上述结果表明,该方法能定性定量鉴定茶尺蠖核型多角体病毒,可用于茶尺蠖核型多角体病毒类生物农药的检测和感染过程检测。     

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)实时荧光定量PCR检测方法的优化及应用

选用茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)基因组中序列特异性很高的p16基因为目标基因,通过设计引物、PCR扩增、目的片段与载体连接转化获得含p16基因的重组质粒进行测序,进而以经测序鉴定的p16基因的PCR纯化产物作为实时荧光定量PCR标准品模板,稀释后建立SYBR Green I荧光定量标准曲线,统计分析显示标准品浓度的对数值与Ct值之间存在良好的线性关系(R2=0.9981)。该方法的检测灵敏度为102,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间变异系数均小于3%。同时分别对含有其他茶树害虫病毒和不同浓度的茶尺蠖病毒产品的样品进行检测,能明确样品中是否含有EoNPV及含量。根据已建立的方法对感染病毒后不同时间段的茶尺蠖幼虫进行检测,每克幼虫样本内p16基因拷贝数的增殖倍数对数值与感染时间呈正相关(R2=0.9935),可以获得茶尺蠖幼虫感染病毒后不同时间的增殖动态。上述结果表明,该方法能定性定量鉴定茶尺蠖核型多角体病毒,可用于茶尺蠖核型多角体病毒类生物农药的检测和感染过程检测。     

茶树新梢不同叶片中β-葡萄糖苷酶和β-樱草糖苷酶基因表达的实时定量PCR分析

在建立茶树基因表达绝对定量实时PCR检测方法后,检测了龙井43新梢不同部位叶片中的β-葡萄糖苷酶和β-樱草糖苷酶基因的表达情况,结果表明β-葡萄糖苷酶在一芽五叶新梢的第四叶中表达活性最高,为2.86E+08拷贝/μl,第四叶>第三叶>第五叶>第二叶>一芽一叶;而β-樱草糖苷酶基因在一芽一叶中最高,为4.31E+06拷贝/μl,一芽一叶>第二叶>第三叶>第四叶>第五叶。与茶叶香气密切相关两个基因在茶树不同部位的叶片中表达量和表达类型存在明显差异。本实验建立的实时荧光定量PCR可有效地用于茶树基因表达的定量分析。     

无芒稗质体ACCase基因Real-time PCR定量方法的建立

为研究一种抗精喹禾灵无芒稗的抗药性机理，建立了一种以β-actin为内参基因利用实时荧光定量PCR技术测定抗性无芒稗质体ACCase基因相对表达水平的方法。分析结果表明，设计的实时定量引物特异性非常好，内参基因、目的基因的扩增效率分别为103.2％、104.3％，线性相关系数分别为0.993 0、0.991 2，完全满足Real-time PCR定量方法的要求。所建立的无芒稗质体型ACCase基因 Real-time PCR定量方法将为研究质体型ACCase基因的表达和杂草对ACCase抑制剂的抗药性机制     

利用qPCR法检测OsPIMT1转基因水稻中的外源片段拷贝数

水稻转化过程中,多个拷贝数整合到基因组中影响遗传稳定性和基因表达。传统的Southern杂交检测法鉴定费时费力,不适合目前高通量和自动化的检测要求。因此研究通过比较定量除草剂草铵膦抗性基因(bar)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH2,建立了基于实时荧光定量PCR的拷贝数检测法。利用此体系对9个独立的异天冬氨酸甲基转移酶OsPIMT1转基因T0代植株进行了荧光定量分析,其中6个为单拷贝,3个为双拷贝,经过Southern杂交和分离比分析验证,表明该方法能够快速,准确的鉴定水稻含有草铵膦抗性基因的水稻转基因植株。     

富含多糖甜玉米幼穗RNA提取及高温胁迫基因表达分析

以改良Trizol试剂法从富含多糖的甜玉米幼穗中提取高质量、完整的总RNA,利用实时荧光定量PCR对高温胁迫下粤甜13雌穗发育的8个差异表达基因进行分析。结果表明,8个基因分为上调表达和下调表达,实时荧光定量PCR和测序法基因表达谱检测的基因上调或下调表达的趋势一致,上调表达基因ZM2G058057和下调表达基因ZM2G059964、ZM2G044670相对表达量较高,可能在高温胁迫影响甜玉米幼雌穗发育过程中起更重要的作用。     

马铃薯环腐病菌Real-time Taqman-PCR检测体系的建立

本研究根据环腐病菌16S rRNA保守序列设计特异性引物及探针,建立了马铃薯环腐病菌实时定量荧光PCR检测体系。研究表明,该体系可以准确、稳定、定量的检测出样品中最低浓度为1fg·μL-1(即3.21×103copies·μL-)1的目的基因,检测极限可以达到几个拷贝。该检测体系可对马铃薯环腐病菌进行微量检测,对于保证马铃薯各级种薯、商品薯及其相关产品的质量,提高市场竞争力具有重要意义。     

HSA转基因水稻二重微滴数字PCR定量检测方法研究

重组人血清白蛋白（HSA, Human serum albumin）基因工程水稻是我国自主研发的可规模化生产水稻重组人血清白蛋白（OsrHSA）的转基因品系，具有极高的推广价值和应用前景，但是目前缺乏对其进行精准定量检测的方法。微滴数字PCR（ddPCR, droplet digital PCR）是近年来新兴的前沿PCR技术，不依赖标准物质即可实现对DNA分子的绝对定量，在转基因产品定量领域被广泛应用。本研究基于ddPCR平台建立了适用于重组人血清白蛋白基因工程水稻（114-7-2品系）的二重ddPCR精准定量检测方法。通过对引物探针的特异性进行验证、对引物探针工作浓度和反应退火温度进行优化，获得最佳反应条件。进而对该方法检测限、定量限和结果重复性做了测定。最后通过对不同含量的重组人血清白蛋白转基因水稻样品进行定量检测，分析比较传统实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和二重ddPCR的优劣，结果表明本研究建立的转基因水稻HSA/PLD二重ddPCR方法稳定性更好、灵敏度高、成本低廉，精准可靠，适用于不依赖标准物质的精准定量HSA转基因水稻转化体含量分析，可取代qRT-PCR方法进行HSA转基因水稻的绝对定量检测，完善了我国转基因水稻成分精确定量检测技术体系。     

一种基因编辑位点特异性PCR方法的开发和应用

为了对基因组编辑产品进行精准定性和定量检测，以水稻SP1 基因的编辑植株为材料，在编辑位点上下 游设计通用引物，在编辑位点处设计基因编辑位点特异性TaqMan探针，建立了编辑位点特异性PCR方法。利用该 方法可准确鉴定特异基因组编辑产品，检测灵敏度达到5~10拷贝，可在实时荧光PCR（qPCR）和微滴数字PCR （ddPCR）平台上对基因组编辑产品进行定量检测。由于数字PCR的微反应单元可消除野生型DNA对通用引物的 竞争性消耗，与qPCR的定量结果相比，ddPCR定量结果具有更高的定量准确性。     

赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）对不同水稻品种生长和生理特性及GA20ox2、GA3ox2基因表达的影响

 以5个水稻品种4叶1心期的幼苗为材料,比较研究了1 μmol/L GA₃和10 mg/L ABA处理对不同水稻品种生长发育、生理特性及基因表达的影响。结果表明,GA3处理能够促进水稻地上部分伸长生长,抑制根伸长生长;同时,5个品种叶片的叶绿素含量、可溶性蛋白质含量和细胞膜透性呈上升趋势。10 mg/L ABA处理则严重抑制种子萌发和地上部伸长生长;5个品种叶片的叶绿素含量、可溶性蛋白质含量和细胞膜透性则呈现下降趋势。 用RT PCR方法对GA20ox2和GA3ox2基因表达水平的变化进行检测,结果表明GA₃处理后,日本晴GA20ox2基因表达略微下调,其余4个品种的GA20ox2基因表达上调。ABA处理抑制GA20ox2基因表达。GA3ox2基因表达也受GA3和ABA调控。在南粳44、关东194和日本晴中,GA3诱导GA3ox2表达,ABA显著抑制GA3ox2表达。性     

稻曲病菌分生孢子实时PCR定量检测方法的建立及初步应用

 根据稻曲病菌核糖体转录间隔区（ITS）序列的特异性,设计了2对引物及相应TaqMan探针用于建立稻曲病菌实时PCR定量检测技术。结果表明,uvr292rf/uvr397rr/uvrp333组合建立的体系可特异性检测出稻曲病菌,扩增基线平整,指数扩增期明显,重现性好,最低可检出24 fg的稻曲病菌基因组DNA模板量;以梯度稀释分生孢子液提取的基因组DNA为模板,建立孢子数量常用对数值与Ct值的线性关系,理论上最低可检测出0.67个分生孢子。对3个时间点的田间孢子捕捉样品进行检测,结果显示不同月份间稻曲病菌孢子数量存在差异。     

高温胁迫下水稻胚乳淀粉分支酶各同工型基因的表达特征

 以稻米品质温度敏感型的早籼稻品种浙辐49为材料,利用人工气候箱控温处理试验和实时荧光定量PCR技术,探讨了水稻发育胚乳中淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)的3种主要同工型基因 (SBEⅠ、 SBEⅢ和SBEⅣ) 在不同温度处理下的相对表达量差异及动态变化特征。结果表明,高温处理对水稻胚乳中SBE基因的表达调控因其同工型的种类而异,SBEⅣ基因在高温处理下呈上调表达,而SBEⅠ和SBEⅢ基因在高温处理下的相对表达量则明显降低,表现为下调表达;与SBEⅣ等同工型相比,水稻胚乳中SBEⅠ基因对高温胁迫的表达响应相对更敏感。     

受GA_3诱导的一个水稻伸长相关基因的初步鉴定

采用 m RNA差异显示技术对受 GA3诱导的水稻伸长相关基因进行了分离和鉴定。经 10 0个引物组合差异显示 ,在获得 2 1个受 GA3诱导表达的 c DNA片段的基础上 ,对其中的 GA15 b片段克隆进行了序列测定。其序列经国际联网BLAST查询表明 GA15 b为伸展蛋白类似蛋白的候选基因片段。定量 PCR进一步确证 GA15 b受 GA3所诱导。Southern杂交表明 GA15 b以多拷贝形式存在     

转基因玉米MON87427/zSSIIb 二重微滴数字PCR方法建立及应用

实施转基因产品定量标识制度需要建立准确可靠的定量检测技术和方法。数字PCR（dPCR）不依赖标准 物质，实现对DNA分子的绝对定量，已成功用于转基因含量检测和标准物质定值。为建立可靠的dPCR方法，获得 准确测量结果，本研究以耐除草剂玉米MON87427为材料，探索建立二重微滴数字PCR（ddPCR）的策略。以构建的 聚合MON87427转化体和5个玉米内标基因的重组质粒pUC57-M为质控样品，将5个不同的玉米内标基因分别与 MON87427组合，通过优化退火温度，根据阳性微滴与阴性微滴分辨率、中等信号强度雨滴数量及测量值与理论值 的一致性等，确定了二重ddPCR组合为MON87427/zSSIIb，最适退火温度为58.4℃。MON87427/zSSIIb 二重ddPCR的 动力学范围为10～60 000拷贝。对盲样进行定量检测，二重ddPCR的定量结果与荧光定量PCR有良好的可比性， 表明MON87427/zSSIIb 二重ddPCR可取代qPCR方法进行转基因玉米MON87427的定量检测及标准物质定值。     

水稻高产精确定量栽培

探求能满足高产、优质、高效、生态、安全五个方面综合要求的,先进的、适用的水稻精确定量栽培是水稻栽培科学技术发展的方向,是水稻科学栽培的创新发展。详述了水稻叶龄模式、水稻高产群体质量指标、水稻高产优质群体培育的总途径和分阶段的诊断的定量指标。从播栽期、培育壮秧、合理基本苗、行株距、施肥、水分等方面进行了水稻栽培技术的精确定量。实践证明,水稻精确定量栽培理论与技术体系,具有广泛的指导作用和适用价值。