中国农业转基因生物环境安全检测标准体系现状与展望

农业转基因生物环境安全检测标准是农业转基因生物安全管理必不可少的技术保障。截至2021年1月,农业部/农业农村部共发布了农业转基因生物环境安全检测标准47项。本文对我国农业转基因生物环境安全检测标准体系现状进行初步总结,对国内外农业转基因生物环境安全检测标准的发展现状进行比较,探讨了今后一段时间内农业转基因生物环境安全检测标准的发展方向,以期为我国农业转基因生物环境安全检测标准的进一步完善提供借鉴,使其更好地为农业转基因生物安全管理工作提供技术支撑。     

农业转基因成分检测能力验证工作的关键点分析

能力验证是加强转基因检测机构能力水平和质量控制的重要措施。本文介绍了能力验证的概念和意义,以及农业部科技发展中心多年组织开展农业转基因成分检测能力验证工作的经验,包含实施方案确定、样品制备、结果分析过程中的关键点和注意事项,并对照当前能力验证工作存在的问题,提出了进一步完善的建议,以期对今后的能力验证工作提供参考。     

新时代中国农业科技发展新路径初探

党的十九大报告首次提出实施乡村振兴战略,这对促进社会协调发展和实现中华民族伟大复兴"中国梦"意义重大。如何发挥科技对实施乡村振兴战略的支撑和引领作用,是必须面对的一个重大课题。本文阐述了新时代中国农业农村发展的新动力和农业生产经营的新特点、新情况,对当前农业科技发展的新路径进行了初步探索。     

转基因检测标准物质研制关键环节质量控制研究

在转基因产品检测方法开发、身份鉴定和产品成分定性、定量检测过程中,标准物质是不可缺少的物质基础。本研究对标标准物质申报要求,着重对比了基体标准物质、基因组DNA标准物质、质粒标准物质三种类型转基因检测标准物质的研制过程,提出关键环节的质量控制要求,为促进转基因检测标准物质研制过程标准化、提升研制报告编制质量、提高申报通过率提供技术支撑。     

转基因玉米NK603转化体/zSSIIb内标基因二重微滴数字PCR方法的建立及应用

【目的】批准进口的转基因玉米NK603是中国转基因生物安全监管的主要对象。转基因安全监管需要标准物质和标准检测方法,建立转基因玉米NK603的数字PCR（dPCR）方法将为转基因玉米NK603的定量检测和标准物质研制提供精准测量技术。【方法】采用人工合成技术构建标准质粒分子pUC57-NK603;将NK603转化体与不同的玉米内标基因引物/探针一一组合,遴选与NK603转化体特异性PCR具有相同扩增能力的玉米内标基因PCR方法;设置二重微滴数字PCR（ddPCR）的退火温度梯度和引物/探针浓度梯度,优化二重ddPCR的反应体系和反应条件;用梯度稀释的标准质粒溶液作模板,考察二重ddPCR的检测极限、定量极限和动力学范围;将转基因玉米NK603种子粉末和非转基因玉米种子粉末混合,配制质量分数分别为100%、10%和6%的盲样,考察二重ddPCR的定量准确性。【结果】用标准质粒分子pUC57-NK603作为二重ddPCR的质控对照,通过考察二重ddPCR反应热图的微滴信号强度、阳性微滴与阴性微滴分辨率、雨滴数量、NK603转化体与内标基因拷贝数比值测量值与预期值的一致性,确定将NK603转化体特异性PCR方法与内标基因zSSIIb PCR方法组合,建立NK603/zSSIIb二重ddPCR方法。二重ddPCR反应体系中NK603转化体和zSSIIb内标基因的引物/探针浓度相同,均为400 nmol·L^-1/200 nmol·L^-1,在60℃退火延伸。NK603/zSSIIb二重ddPCR的检测极限是2 copies DNA模板,定量极限是48 copies DNA模板,动力学范围是10—60 000 copies DNA。应用NK603/zSSIIb二重ddPCR方法可准确定量玉米盲样中的NK603转化体含量,定值结果变异系数小于25%;dPCR定量结果与荧光定量PCR（qPCR）定量结果无显著差异,且具有更高的精确性。【结论】内标基因的选择会影响dPCR定量结果的准确性,在建立dPCR方法的过程中,要用具有准确量值的样品作为质控对照,评估内标准基因的适用性。以人工合成的标准质粒分子pUC57-NK603为质控对照,建立了NK603/zSSIIb二重ddPCR方法。应用建立的二重ddPCR定值方法进行标准物质的研制和定值,已成功研制出转基因玉米NK603有证标准物质。     

转基因油菜筛查阳性质粒分子的研制及应用

【目的】 转基因油菜是四大转基因作物之一,是中国转基因生物安全监管的重要对象,转基因检测为转基因安全监管提供技术支撑。转基因筛查是转基因检测的第一步,筛查靶标设置不合理会导致漏检部分转基因成分。建立转基因油菜筛查策略,并研制与筛查策略配套的阳性质粒分子,将为中国的转基因油菜安全监管提供强有力的技术支撑。【方法】 通过收集数据库中登记的转基因油菜品种的外源基因元件信息,分析转基因油菜品种中常用的调控元件和标记基因,基于最大筛查覆盖率原则,确定转基因油菜的筛查靶标。通过检索数据库或查询专利,收集筛查元件的核苷酸序列。一个筛查元件通常有多个标准方法,查阅各筛查元件的检测标准,分析各标准中普通PCR引物对和实时荧光PCR引物/探针组合在筛查元件核苷酸序列中的位置,根据引物探针的结合位点,确定拟构建到质粒上的各筛查元件的核苷酸序列。人工合成各筛查元件和油菜内标基因的融合序列,克隆到常用质粒pUC18,构建阳性质粒分子。采用各筛查元件的普通PCR和实时荧光PCR方法,评估阳性质粒分子的适用性。【结果】 建立了转基因油菜的筛查策略,通过检测CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、Bar、PAT、CP4-EPSPS、NPTⅡ、HPT、NOS终止子和PinⅡ终止子共9个基因元件,可实现已知信息转基因油菜品种的全覆盖。构建出聚合9个筛查元件和2个油菜内标基因HMG I/Y和CruA的转基因油菜筛查质粒分子pYCSC-1905。9个筛查元件和2个油菜内标基因的扩增效率均在90%—110%,证明质粒分子上的不同靶标序列没有相互干扰,影响PCR的扩增效率。质粒分子pYCSC-1905可用作9个筛查元件和2个油菜内标基因的通用阳性对照,适用于国家标准（GB/T和农业农村部公告）、出入境检验检疫行业标准（SN/T）和欧盟标准。【结论】 提出的转基因油菜筛查策略涵盖9个基因元件,可实现从商业化到安全评价各阶段转基因油菜的筛查检测,显著降低转基因油菜的筛查漏检率。研制的配套质粒分子pYCSC-1905为转基因油菜筛查和各基因元件标准方法的应用提供了通用标准样品,保证检测机构间检测数据的准确性和可比性。     

转基因玉米MON87427/zSSIIb 二重微滴数字PCR方法建立及应用

实施转基因产品定量标识制度需要建立准确可靠的定量检测技术和方法。数字PCR（dPCR）不依赖标准 物质，实现对DNA分子的绝对定量，已成功用于转基因含量检测和标准物质定值。为建立可靠的dPCR方法，获得 准确测量结果，本研究以耐除草剂玉米MON87427为材料，探索建立二重微滴数字PCR（ddPCR）的策略。以构建的 聚合MON87427转化体和5个玉米内标基因的重组质粒pUC57-M为质控样品，将5个不同的玉米内标基因分别与 MON87427组合，通过优化退火温度，根据阳性微滴与阴性微滴分辨率、中等信号强度雨滴数量及测量值与理论值 的一致性等，确定了二重ddPCR组合为MON87427/zSSIIb，最适退火温度为58.4℃。MON87427/zSSIIb 二重ddPCR的 动力学范围为10～60 000拷贝。对盲样进行定量检测，二重ddPCR的定量结果与荧光定量PCR有良好的可比性， 表明MON87427/zSSIIb 二重ddPCR可取代qPCR方法进行转基因玉米MON87427的定量检测及标准物质定值。     

油菜转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905的研制及应用

转基因油菜是我国转基因生物安全监管的重要对象,为了解决检测机构常常面临的标准物质(样品)缺乏困境,统计我国批准进口和正在申请安全证书的11个转基因油菜品种,分析分子特征和相应的检测标准方法,确定每个转基因油菜品种的检测靶标序列。将11个转基因油菜品种的检测靶标序列通过基因合成的方法融合构建到pUC18载体上,研制出阳性质粒分子pYCID-1905,为转基因油菜的转化体鉴定检测提供了通用的阳性对照分子。结果发现,该质粒分子可同时用作国家标准(GB/T)、农业农村部公告、进出口检验检疫标准(SN/Y)和欧盟标准中普通PCR方法和实时荧光PCR方法的阳性对照,可以解决转基因油菜检测中缺乏标准样品的难题。     

转基因耐除草剂玉米C0010.2.2定性PCR检测方法的建立

转基因耐除草剂玉米C0010.2.2是北京大北农生物技术有限公司利用农杆菌介导法,将epsps基因和pat基因转到受体玉米DBN567获得的耐除草剂玉米转化体,具有耐除草剂草甘膦和草铵膦性状。研究建立转基因耐除草剂玉米C0010.2.2的检测方法,在外源基因插入位点的左、右边界分别设计引物,经过引物筛选、特异性测试、灵敏度测试、退火温度和引物浓度测试,建立转基因耐除草剂玉米C0010.2.2的定性PCR检测方法,该方法的检出限和灵敏度可达到0.1%。验证结果表明,该方法可以特异性检测到转化事件,具有很好的重复性和再现性。     

转基因检测数据库概述

转基因检测方法和标准物质是转基因生物安全管理的技术支撑,本文对国内外转基因作物信息数据库、转基因检测方法数据库、筛选检测在线分析工具和转基因标准物质库进行了整理;并分析了各数据库的特点,以期为转基因检测的信息获取提供指引,为我国转基因检测信息平台的建设提供思路。