茶树硝态氮转运蛋白NRT1.1基因的克隆及表达分析

以茶树(Camellia sinensis(L.))品种龙井43为试材,采用PCR结合RACE技术,克隆得到硝态氮转运蛋白基因(NRT1.1)的c DNA全长序列,基因序列全长1 880 bp,其中开放阅读框(ORF)1 788 bp,编码595个氨基酸,预测蛋白质分子量为65.9 k D,理论等电点为8.99,命名为Cs NRT1.1。序列分析表明,Cs NRT1.1与葡萄NRT1.1氨基酸序列的相似性最高。通过生物信息学分析,对Cs NRT1.1的氨基酸理化性质、亲/疏水性、跨膜区域及亚细胞定位进行了预测。实时定量PCR表达分析表明,茶树根和叶片中Cs NRT1.1在1 mol·L~(-1) NO3-处理5 min内均受到抑制,叶部Cs NRT1.1表达量0.5 h后即达到最大值,24 h内各个时间点均高于根部,根中表达量Cs NRT1.1始终低于对照。本研究结果为研究茶树对NO3-的吸收、转运和调控机理提供了分子生物学基础。     

茶树丙氨酸氨基转移酶基因的克隆与表达分析

丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,Ala AT)是与碳氮代谢相关的一种重要酶类。采用反转录PCR的方法克隆了茶树Cs Ala AT1的c DNA序列,该序列全长1 747 bp,包含一个完整的ORF(1 626 bp),编码541个氨基酸,推导的蛋白质分子量为59.4 k D,理论等电点(p I)为5.82。同源比对结果表明,Cs Ala AT1含有丙氨酸氨基转移酶亚家族保守的辅酶磷酸吡哆醛结合位点,其氨基酸序列与拟南芥At Ala AT1蛋白的相似性为84%。二级结构预测显示该蛋白由α-螺旋(40.67%)、无规则卷曲(29.57%)、β-折叠(13.68%)和延伸链(16.08%)组成,定位于线粒体,不含信号肽与跨膜结构。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测发现Cs Ala AT1在茶树各组织中均有表达,在根中的表达量最高;Cs Ala AT1基因表达对氮素的响应研究表明,成熟叶中Cs Ala AT1受氮素诱导上调表达,高浓度(1 mmol·L-1 NH4NO3)氮素的诱导效应比低浓度(0.1 mmol·L-1 NH4NO3)氮素诱导效应更强烈;在根中,处理24 h后,高氮诱导Cs Ala AT1上调表达,低氮诱导Cs Ala AT1下调表达。     

茶树类黄酮3′-羟化酶基因的克隆与表达特性分析

类黄酮3′-羟化酶(Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)是细胞色素P450酶家族(Cytochrome P450,CYP450)的单加氧酶,在植物次生代谢和逆境调控方面起着重要的作用。本实验以茶树品种龙井43作为试验材料,利用RT-PCR方法,从c DNA中克隆得到茶树中编码类黄酮3′-羟化酶基因,命名为Cs F3′H1。序列分析显示,Cs F3′H1基因开放阅读框为1 530 bp,编码509个氨基酸,含有相对保守的P450酶系结合域。进化树分析表明,Cs F3′H1与Cs F3′H3的进化树关系相近,与Cs F3′H2的进化树关系较远。序列多重比对显示,Cs F3′H1蛋白具有F3′H蛋白的特征基序,并与高粱、猕猴桃、杨树、拟南芥和葡萄同源蛋白一致性为66.48%。氨基酸组分、理化性质、亲水性/疏水性和无序化分析显示,Cs F3′H1是亲水性蛋白,无序化特征不明显。利用实时荧光定量PCR对Cs F3′H1基因在茶树不同组织和不同激素处理下的表达谱进行检测,结果显示:不同组织中,Cs F3′H1基因的表达水平在第一叶中最高,之后随着叶片的成熟逐渐下降,Cs F3′H1基因在老叶和根中几乎不表达,表达水平从高到低依次为第一叶第二叶第三叶第四叶嫩茎根老叶;在不同激素处理中,Cs F3′H1在SA激素处理下的表达量最高,为对照的2.24倍,在Me JA处理下表达量最低,为对照的0.43倍。     

茶树几丁质酶基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树叶片为材料,利用逆转录PCR及RACE法,克隆了茶树几丁质酶基因Cs Chi(Gen Bank登录号为KR078345)。Cs Chi基因的c DNA全长为1 192 bp,包含972 bp的开放阅读框(ORF),编码323个氨基酸。生物信息学分析结果表明,Cs Chi蛋白的分子量为34.33 ku;理论等电点p I为8.44;原子组成为C1 519H2 285N413O464S18,总原子数为4 699;蛋白质结构分析显示该蛋白有6个蛋白的跨膜区域,属于跨膜蛋白;存在于细胞外;没有卷曲螺旋结构存在;Cs Chi基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的Cht BD1结构域,与溶菌酶的保守结构域类似,可能兼具几丁质酶活性和溶菌酶活性,q PCR定量分析结果显示在不同干旱胁迫处理下茶树的Cs Chi基因的表达量,与对照组相比有所增加。推测Cs Chi基因在茶树干旱等逆境胁迫中起重要作用。     

小麦钾离子通道蛋白基因TaAKT1的功能分析

小麦AKT1具有钾离子转运功能。为了给小麦钾离子吸收转运机制的研究提供参考,本研究从普通小麦品种石4185中扩增得到TaAKT1基因,其编码区序列全长2 694bp,生物信息学分析表明,TaAKT1蛋白包含897个氨基酸,相对分子质量为100.92kDa,具有钾离子通道蛋白的特征序列TxxTxGYGD。多序列比对发现,TaAKT1蛋白与大麦HvAKT1蛋白的进化关系最近,相似性达97.22%。利用qRT-PCR分析发现,在正常条件下TaAKT1基因在小麦根部表达量约为叶片中表达量的5倍,低钾环境下TaAKT1的表达量在小麦根部明显上调,叶部的表达量无明显变化。利用酵母功能互补实验发现,转TaAKT1基因的酵母在含有5mmol·L~(-1) KCl的AP培养基上正常生长,而转空载体的酵母长势受到抑制,说明TaAKT1具有钾离子转运功能。同时转TaAKT1基因与TaCIPK23基因的酵母能在含60μmol·L~(-1) KCl的AP培养基上生长,而转空载体与转TaAKT1基因的酵母菌株均不能生长,说明TaCIPK23可以增强TaAKT1的钾离子吸收能力。     

茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析

以茶树叶片为材料,结合同源克隆方法和RACE技术,克隆了1条UFGT基因,命名为CsUFGT。该基因cDNA全长为1526bp,ORF长1380bp,编码459个氨基酸,推测等电点5.96,推测分子量为49.486kDa。该基因编码的蛋白质与葡萄UFGT（P51094.2）的一致性为59%,相似性为75%,其C-端含有植物UGT家族成员特有PSPG基序。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在茶树根茎叶中均表达,在第4叶表达量最高,根和茎中表达量较低。     

茶树CsLHTs亚家族基因的克隆与表达分析

氨基酸是茶叶的重要品质成分和氮素贮存形式,因此开展茶树体内氨基酸转运蛋白的研究尤为重要。本研究从茶树转录组中筛选得到5条茶树LHTs(Lysine histidine transporters,赖氨酸/组氨酸转运蛋白)家族基因序列,并从龙井43中成功克隆获得4个茶树LHTs基因,分别命名为CsLHT1、CsLHT6、CsLHT8.1和CsLHT8.2。对该亚家族编码的氨基酸序列的理化性质和功能结构进行预测,结果显示CsLHTs亚家族含有9~11个跨膜区;且含有与氨基酸转运相关的结构域。为了明确在不同茶树品种和氮素水平间CsLHTs基因的表达差异,本研究选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,水培条件下氮饥饿两周后,分别用0.2、2、10mmol·L^-1的NH4NO3进行处理。利用qRT-PCR分析了CsLHTs在不同组织间的表达情况,结果表明4个基因在茶树营养组织中均有表达。经氮素处理后,CsLHTs基因在3个氮素水平和3个品种中呈现出不同的变化规律。CsLHT1、CsLHT6和CsLHT8.2在品种间的表达差异程度高于不同氮素水平间的基因表达差异。CsLHT8.1对氮素处理有明显的响应,尤其经0.2mmol·L^-1和10mmol·L^-1的NH4NO3处理72h后,在氮高效品种中茶302根中呈上调表达,表明CsLHT8.1可能参与氨基酸由根部向地上部的转运过程。     

缺磷对茶树磷吸收及miR399a表达量的影响

磷素缺乏是我国及世界农业的普遍问题.本研究通过不同磷浓度胁迫处理茶树,发现根、新叶、老叶中磷含量都随着处理浓度的下降而降低,其中老叶中磷含量变化急剧,而新叶变化较缓慢.在缺磷条件下(100μmol·Lˉ1、10μmol·Lˉ1),老叶中的磷元素会重新转运到新生组织,实现磷元素的再次利用,而在过量磷浓度供应条件下(3000μmol·Lˉ1),磷元素则大量存储于老叶中,以维持体内磷平衡.茶树根部提取的总RNA量普遍比叶片低,但根部和叶片提取的RNA质量都符合反转录要求.试验通过荧光定量PCR方法,检测正常(1000μmol·Lˉ1)和低磷(10μmol·Lˉ1)胁迫下叶片和根中miR399a的表达量,发现在低磷胁迫下,miR399a在叶片和根中的表达量都显著提高,其中叶片提高约2.77倍,根提高约3.82倍,该结果与拟南芥、水稻等植物研究结果相一致.     

巴西橡胶树磷转运蛋白基因的克隆及生物信息学分析

植物磷转运子Pht1家族是一类H2PO4-/H+共转运子,该家族主要成员在植物根系中负责磷的吸收和转运,其表达受磷调控,对该家族成员的研究有助于揭示磷的吸收和转运机制。根据Pht1家族基因的保守性设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了1个Pht1基因,命名为HbPht1。氨基酸序列同源性比对与系统进化分析表明,HbPht1属于磷转运蛋白基因家族的新成员。该基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础。     

香蕉泛素结合酶基因的克隆及其功能初步分析

根据香蕉根系均一化全长cDNA文库筛选出一个香蕉泛素结合酶基因的片段通过RACE技术克隆该基因,命名为mauce2.生物信息学分析表明,该基因全长为929 bp,有一个完整的ORF编码148个氨基酸,蛋白分子量为16 505.1 ku,理论等电点为8.41,是一个碱性氨基酸.与江南卷柏、大豆、苹果、拟南芥的同源性为97.97％、97.30％、96.62％、95.95％.器官特异性表达分析表明,该基因在各器官中均有表达,在花中表达量最高,根次之,叶中表达量最低.     

茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子CsPPT2基因的克隆和分析

以茶树(Camellia sinensis)白叶1号为材料,应用RT-PCR和RACE技术克隆获得茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子家族一个基因CsPPT2的c DNA序列,并与茶树体内另一个磷酸烯醇式丙酮酸转运子家族的基因CsPPT1在不同时期和不同部位的表达进行比较。CsPPT2的c DNA全长1 469 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 218 bp,编码406个氨基酸。通过生物学信息分析表明,CSPPT2蛋白分子量为44.6 k D,理论等电点为9.90,CsPPT2有6个跨膜区,属于疏水性叶绿体跨膜蛋白。聚类分析显示,茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子家族分为2个亚组,而CsPPT1与CsPPT2属于不同亚组。荧光定量结果分析表明,两个基因可能在茶树体内功能不同,CsPPT2在所考察的组织中均有表达,且在根和成熟叶片中表达量远大于CsPPT1;CsPPT1在茎和复绿前的幼嫩芽叶中表达量高于CsPPT2。在白化期起始时CsPPT2有短暂的升高,但伴随白化受到较大的抑制,表明CsPPT2的表达抑制可能是白叶1号低儿茶素高氨基酸品质形成的关键因素。     

茶树硝酸根转运蛋白基因NRT2.5的克隆及表达分析

通过RACE克隆从茶树[Camellia sinensis (L.)]叶片中获得NRT2.5基因cDNA全长序列。所得基因序列全长为2 457 bp,其中开放阅读框为1 362 bp,编码454个氨基酸,推测蛋白分子量为48.7 kD,理论等电点为9.63。生物信息学分析表明,该基因与可可树、拟南芥等的NRT2.5基因具有高度同源性,且其编码的蛋白质具有NRT家族共有的结构特征。实时定量PCR分析表明,NRT2.5基因在茶树不同组织中均有表达,但主要在成熟叶和根中表达;不同氮浓度处理后,茶树NRT2.5基因在低浓度下的表达量高于高浓度下。     

不同氮处理茶树实时定量PCR内参基因筛选和验证

为筛选不同氮处理下茶树(Camellia sinensis)实时荧光定量PCR(q RT-PCR)试验体系中最佳内参基因,以茶树幼叶、成熟叶和幼根为材料,应用qRT-PCR分析GAPDH、18S rRNA、β-actin、RPL13、a-tubulin、Ru BP等6个内参基因在不同氮浓度和氮源处理下的表达变化,借助GeNorm和NormFinder程序对候选内参基因稳定性进行评价。结果表明,在不同氮浓度和氮源处理下,GAPDH、b-actin和RPL13表达稳定性较好,GAPDH+β-actin组合稳定性最佳,可用作茶树基因表达研究的内参基因;而a-tubulin和RuBP表达稳定性较差,不适合做内参基因。为进一步证实上述结果,分别以GAPDH、a-tubulin、GAPDH+β-actin组合为内参基因,分析茶树幼叶中硝酸根转运蛋白基因(CsNRT1.2)和铵根转运蛋白基因(Cs AMT1.1)的表达水平,发现以GAPDH和GAPDH+β-actin组合为内参基因时,目的基因的相对表达量随处理时间延长变化规律基本一致;而以a-tubulin为内参基因时,目的基因的变化规律与前两者存在明显差别。因此,根据特定试验体系选择合适的内参基因对于qRT-PCR定量结果的准确性和可靠性具有重要意义。     

茶树CsCDF1基因克隆及表达分析

采用SMART-RACE技术克隆了茶树Dof（DNA binding with one finger）基因CsCDF1的全长cDNA序列,并利用在线生物信息学软件对其进行了分析。采用实时荧光定量PCR分析该Dof基因在茶树不同组织间的表达差异和昼夜表达规律,及其在氮饥饿处理2周后对不同浓度氮素诱导的响应。该cDNA序列全长1β606βbp,包含1个编码464个氨基酸的完整开放阅读框,含有高度保守的DOF结构域,推导的蛋白分子量为50.8βkDa,理论等电点（PI）为5.52;其编码的蛋白序列与茸毛烟草、马铃薯和美花烟草的CDF蛋白（Cycling dof factor）相似性分别为69%、67%、68%。系统发育分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥CDF蛋白聚为一类,因此将其命名为CsCDF1;CsCDF1在3个不同茶树品种根系中的表达量均高于一芽二叶和成熟叶;在一天中,该基因的表达呈现出昼夜节律变化;在氮饥饿后重新供氮,不同组织中该基因对不同浓度氮素的响应均为上调。     

安吉白茶正常与白化叶片基因表达差异的初步研究

用mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)研究了茶树温敏突变体——安吉白茶正常叶片和白化叶片的基因表达差异。从58个差异表达的片段中通过半定量RT-PCR鉴定出12个阳性片段,其中5个片段在正常叶片中特异表达,4个在白化叶片中特异表达,1个在绿色叶片中上调表达,2个在白化叶片中上调表达。通过与GenBank BLASTX比对分析,5个基因片段比对出相似序列,分别为拟南芥的血红素结合蛋白家族中心区域基因、甜菜的甲硫氨酸合酶基因、苜蓿的一个逆转座子基因、人类20号染色体上的一段3-磷酸甘油醛脱氢酶假基因和玫瑰的ACC合成酶基因,其余7个片段未比对上同源序列,可能为新基因。     

茶树CsMGTs基因的克隆及其镁转运功能分析

镁离子（Mg²⁺）作为叶绿素的中心成分,是植物细胞中含量最丰富的二价阳离子,也是多种酶的激活剂,特别是茶氨酸合成酶的活性依赖Mg²⁺,常被作为茶树专用肥的特征成分,因此对茶树的生长发育和茶叶的品质形成至关重要。MRS2/MGT家族镁转运蛋白在维持植物体内Mg²⁺的吸收转运、胞内平衡和耐逆性等方面起着重要的作用。为探究茶树MRS2/MGT家族镁转运蛋白基因的功能,以茶树品种陕茶1号为材料,克隆了4条MRS2/MGT镁转运蛋白基因,分别命名为CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3。生物信息学分析表明,这4个转运蛋白在C末端均含有2个跨膜结构域和1个保守的GMN三肽基序;系统发育分析显示,CsMGT1属于Clade C成员,而CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3属于Clade B成员,所编码蛋白与木本植物柑橘MGT家族的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明,CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3在茶树的根、茎、叶、花中呈组成型表达,且根和叶对Mg²⁺浓度均表现出不同程度的响应。鼠伤寒沙门氏菌镁转运缺失突变株MM281功能互补试验表明,CsMGT1和CsMGT2均具有Mg²⁺转运功能,且CsMGT1的Mg²⁺转运功能优于CsMGT2,而CsMGT2.1和CsMGT3几乎没有镁离子转运功能。本研究结果丰富了茶树CsMGTs家族的生物学功能,为进一步阐明茶树通过镁转运功能机制实现对镁离子的利用奠定了前期研究基础。     

茶树Copine家族基因CsBON3的克隆与表达分析

Copine蛋白是一类包含2个C2(N端)和1个vWA(C端)保守域的Ca~(2+)依赖蛋白或磷脂结合蛋白,在胞内信号转导中发挥重要作用。基于序列相似性分析,从茶树转录组数据库中筛选出1条与Copine家族基因高度同源的EST序列。经测序验证该序列包含1 746 bp的完整ORF,编码581个氨基酸。同源比对显示该基因与拟南芥At BON3序列相似度最高(65%),将其命名为CsBON3(Gen Bank登录号为KY435900)。生物信息学分析显示,CsBON3蛋白分子量为63.66 k D,理论等电点为5.48;具有Copine家族蛋白特有的保守结构域;属亲水性蛋白,无信号肽位点,非分泌性蛋白,无跨膜结构域。表达分析表明,CsBON3在茶树花和根系中表达量最高,茎干和成熟叶中表达量最低。低温(4℃)处理茶树1 d后,其表达被显著上调;在生长阶段,该基因表达量高于休眠阶段;同时在接种炭疽菌的茶树叶片中,该基因也被快速上调,表明该基因可能与茶树低温、生长发育及抗病相关。     

茶树miR156a靶基因SPL6和SPL9的克隆及表达分析

MicroRNA156a-SQUAMOSA promoter binding-like protein(miR156a-SPLs)参与植物生长阶段转变、叶片形态建成和逆境胁迫等复杂的生理过程。基于茶树转录组数据,从茶树中克隆出2个SPL家族成员——CsSPL6和CsSPL9。CsSPL6 cDNA全长2 318 bp,ORF框长1 668 bp,编码555个氨基酸;CsSPL9 cDNA全长1 954 bp,ORF框长1 116 bp,编码371个氨基酸;CsSPL6和CsSPL9都有典型SBP结构域和Csn-miR156a识别位点。时空表达特性分析表明,Csn-miR156a在芽中表达量最高,第7叶中最低,与CsSPL6和CsSPL9呈负调控关系;不同品种(系)表达特性分析表明,Csn-miR156a的表达模式与新梢生长量、光合指标结果一致,与CsSPL6和CsSPL9表达模式相反,说明Csn-miR156a、CsSPL6和CsSPL9参与茶树生长过程,Csn-miR156a和CsSPLs可作为初步判断品种生长势强弱的分子手段;高温处理4个品种(系)表达特性表明Csn-miR156a与CsSPL9呈负相关,推断茶树在高温胁迫下Csn-miR156a可能通过负调控CsSPL9来增加耐高温性。Csn-miR156a负调控CsSPLs在茶树生长发育、逆境胁迫中发挥作用,为茶树生长和抗逆机制提供理论依据。