荔枝LcMYB1异源表达促进矮牵牛和番茄花色苷的积累

为分析荔枝LcMYB1的功能,以白色‘W115’矮牵牛和‘Micro-Tom’番茄为材料,利用农杆菌介导法将LcMYB1在矮牵牛和番茄中异源表达,观测转基因植株表型。结果表明：与‘W115’相比,转基因矮牵牛的叶片和花瓣中积累了花色苷,且矮牵牛花色苷生物合成结构基因PhCHS和PhDFR、调控基因PhAN1的表达显著上调;与野生型‘Micro-Tom’番茄相比,转基因番茄的叶片和花药中积累了花色苷,且相应组织花色苷生物合成结构基因SlDFR、调控基因SlAN1和SlJAF13的表达显著上调,虽然果实中没有积累花色苷,但SlAN1和SlJAF13表达也显著上调。LcMYB1在矮牵牛和番茄中异源表达时通过上调花色苷生物合成关键结构基因和调控基因bHLH的表达诱导花色苷积累。因此,荔枝LcMYB1是花色苷生物合成中的关键转录因子,具备异源转化利用的潜力。     

水稻二化螟诱导表达基因OsSABATH启动子的克隆与缺失体构建

Northern杂交结果表明,OsSABATH基因受二化螟(Chilo suppressalis)为害诱导表达,但却不受机械损伤诱导。利用该基因序列和水稻基因组数据库相应序列设计引物,扩增到该基因编码区5′上游2050 bp的启动子序列。用PLACE软件分析顺式作用元件,发现该基因起始密码子上游1.4 kb的区域内存在几个可能与该基因表达调控相关的顺式作用元件,如W盒、DOF 结合序列、GT 1、 BIHD1 结合序列等。将该基因启动子区域及其5′部分缺失构件与GUS报告基因相连,并克隆进pCAMBIA1391载体中,用于分析启动子活性及虫伤诱导特异性相关的顺式作用元件。     

巴西橡胶树HbWRKY1基因5'调控序列的克隆及功能初步鉴定

为深入研究巴西橡胶树HbWRKY1基因的表达调控机制,采用染色体步移法克隆了HbWRKY1基因的5'调控区序列.结果表明,该序列具有预测的核心启动子区域位于-6～-57 bp,转录起始位点位于翻译起始位点上游41 bp处;该序列具有TATA-box,CAAT-box和GATA-box等多个典型的真核生物启动子基本的顺式作用元件,同时还具有低温响应元件LTR,赤霉素反应元件GARE-motif’生长素响应元件TGA-element和脱落酸响应元件ABRE等参与激素调控元件,此外还有与MYB结合的MBS元件,热胁迫反应的HSE,厌氧诱导元件ARE和增强诱发厌氧反应的GC-motif等顺式作用元件.构建了不同长度的HbWRKY1启动子片段的植物表达载体并转化本生烟草,通过潮霉素抗性和PCR鉴定,获得了转基因植株.对获得的转HbWRKY1不同长度启动子片段的转基因T1植株GUS染色发现,植株的茎、叶柄、主叶脉和根中均可呈现蓝色,表明HbWRKY1基因的5'调控区可以启动GUS基因的表达,具有启动子的活性.     

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及其功能分析

为了探究大豆种子油脂合成与储存基因GmWRI1a的调节,分析其启动子功能,从大豆品种东农50基因组中扩增获得GmWRI1a基因转录起始位点上游1669bp的启动子序列,转化拟南芥。GUS染色确定了启动子的有效性,继而根据顺式作用元件的分布,分别扩增得到4个启动子5'端缺失片段1138bp,1087bp,690bp和437bp。4个启动子缺失片段分别转化拟南芥后,通过GUS组织染色结果发现,这些启动子片段能够驱动下游GUS基因表达。GUS酶活表明,启动子存在乙烯、茉莉酸、赤霉素3种激素响应元件,其中乙烯、茉莉酸和赤霉素的响应元件分别分布在-1138^-1087bp、-1087^-690bp和-690^-437bp。     

铁皮石斛DoAGL6基因及启动子克隆与分析

AGL6基因是MADS-box转录因子家族中的一员,是植物特有的转录调控因子,参与花器官形成,对唇瓣的形成起到关键作用。获得铁皮石斛DoAGL6基因及其启动子,并进行生物信息学分析,对DoAGL6基因启动子进行瞬时表达活性验证,可为进一步研究DoAGL6基因的功能提供参考。本研究克隆DoAGL6基因及其上游的启动子序列,利用在线软件对克隆得到的目的基因序列、启动子序列进行预测,分别构建由全长启动子和5'端缺失启动子驱动GUS的重组表达载体并瞬时转化拟南芥及铁皮石斛原球茎,探究其表达活性。结果表明,成功克隆了DoAGL6基因及其启动子,DoAGL6基因编码区长729 bp,编码243个氨基酸,编码蛋白分子式为C₁₂₁₃H₁₉₅₅N₃₅₉O₃₇₅S₁₂,预测亚细胞定位于细胞核中;保守结构域分析表明,DoAGL6具有保守的MADS-box和K-box两个结构域,属于MADS基因家族MIKC亚家族。启动子序列长度为1891 bp,顺式作用元件分析结果显示,DoAGL6基因启动子中除了核心启动元件TATA-box、CAAT-box外,还有许多其他顺式作用元件,如脱落酸响应元件（ABRE）、光反应顺式调节元件（G-Box）、茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif）、MADS-box蛋白结合位点（GArG-Box）等。成功构建融合表达载体pCAMBIA1300-A1-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A2-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A3-promoter::GUS,拟南芥和铁皮石斛原球茎瞬时转化及GUS组织化学染色结果表明,随着启动子5'端缺失片段的增长,GUS活性逐渐降低,启动子活性逐渐减弱,即全长启动子A1（-1891~1）的活性最强,5'端缺失片段A2（-1488~1）次之,A3（-784~1）活性最弱。瞬时转化后的拟南芥和铁皮石斛原球茎GUS染色均呈现蓝色,但与对照相比均较浅,说明全长启动子和2个5'端缺失启动子都具有驱动GUS的活性,但启动活性都比CaMV35S启动子的启动活性弱。     

芒果SEPALLATA3基因的生物信息学与表达分析

SEPALLATA3（SEP3）属于MADS-box基因家族,与植物的成花时间和花器官分化有关。在本研究中,从芒果转录组数据中挖掘获得了2个MiSEP3s基因,分别命名为MiSEP3-1和MiSEP3-2。生物信息学分析显示,MiSEP3-1和MiSEP3-2基因的基因组DNA长度分别为4189 bp和3721 bp,2个基因的开放阅读框长度一致均为732 bp,编码244个氨基酸,蛋白质分子量分别为59.29 kD和59.28 kD。2个MiSEP3s的氨基酸序列中含有典型的MADS结构域和K-box结构域。启动子序列分析显示,2个MiSEP3s基因启动子均包含光响应元件、激素响应元件、逆境响应元件和转录因子结合位点,但调控元件种类和数量存在差异。基因表达模式分析显示,2个MiSEP3s基因在营养期的茎、叶和芽中表达量较低,但在成花转变后期的芽中持续上调表达,在花中达到表达高峰。该结果为MiSEP3基因功能的研究提供参考。     

白木香查尔酮合成酶基因(AsCHS1)启动子克隆及激素应答元件功能的初步鉴定

利用染色体步移法克隆了白木香查尔酮合成酶基因(As CHS1)ATG上游1 082 bp的启动子序列,该启动子序列中AT含量高达69.03%,符合真核生物启动子的序列特征。通过启动子预测软件分析可知,该序列的转录起始位点位于翻译起始位点-65 bp处,并且其上游-25~30 bp区域存在TATA-box等典型的真核生物启动子核心元件,同时含有一些顺式作用元件如赤霉素应答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif、水杨酸应答元件TCA-element等激素调控元件,光应答元件BoxⅠ、G-Box、ACE,厌氧诱导元件ARE等。通过构建p C-1 082pro As CHS1植物表达载体,借助农杆菌将重组载体转化到烟草叶片中。蛋白定量结果表明,该序列可以驱动GUS的表达,具有启动子活性;脱落酸显著增强该启动子的活性,乙烯则显著抑制该启动子的活性。     

巴西橡胶树HbSERK1启动子的克隆及功能鉴定

利用Genome Walker方法从巴西橡胶树中克隆了Hb SERK1起始密码子上游1 395 bp的5′调控序列,序列分析表明,该序列A/T含量高达66.2%,符合真核生物启动子序列的特征。Hb SERK1启动子序列中含有多个典型的真核生物启动子基本元件,如:TATA-box,CAAT-box等,同时存在其它应答元件,如:CAT-box、02-site、ERE、ARE、TCA-element、GCN4-motif、ACA-motif等。将Hb SERK1启动子进行5′缺失,并构建了5个植物缺失表达载体。利用真空渗透法和农杆菌介导法将植物缺失表达载体转化烟草,对烟草转化植株进行GUS活性定量分析结果表明,除了SP5外,其它缺失表达载体均可以驱动GUS蛋白的表达,说明在Hb SERK1启动子-1 395~-252 bp区域可以驱动GUS的表达,表明Hb SERK1启动子是具有生物活性的启动子。     

大豆脂肪酸脱氢酶GmFAD3C-1基因的克隆及功能分析

研究通过对大豆脂肪酸脱氢酶GmFAD3家族中4个关键酶基因序列进行比对,与对照JN18相比,大豆低亚麻酸突变体MT72中GmFAD3C-1基因在起始密码子后+966bp处存在一个碱基位点的缺失（G→?）,产生移码突变,导致氨基酸序列上产生较大变化（该突变基因命名为gmfad3c-1）。构建GmFAD3C-1基因超表达及CRISPR/Cas9编辑载体,利用花粉管通道法获得T₂转化植株。脂肪酸脱氢酶酶活测定结果显示,超表达植株T₂籽粒中,酶活与对照相比上升47.62%~78.85%,编辑载体T₂籽粒中,酶活与对照相比下降25.67%~47.11%。脂肪酸相对含量测定的结果进一步表明,GmFAD3C-1基因的表达与植株亚麻酸含量密切相关。     

高粱高效Ubiquitin启动子的克隆及活性鉴定

在转基因植物的研究中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一。植物泛素（ubiquitin）基因启动子以启动效率高、甲基化程度相对较低、遗传性状稳定等特点成为单子叶植物中应用较为广泛的启动子。其中，玉米的Ubi-1是最常使用的Ubiquitin启动子之一。本研究旨在克隆高粱高效Ubiquitin启动子，为高粱及其他单子叶植物的遗传转化研究提供新的组成型启动子选择。本研究从NCBI数据库中查找到多个polyubiquitin基因，下载其起始密码子上游3000 bp的序列。根据Ubiquitin启动子的特点，选择含有5′ UTR内含子且大小合适的序列，并通过在线启动子预测网站进行启动子分析，最后选择2个基因（LOC8076096、LOC8063786）进行启动子克隆，将其启动子序列分别命名为U1和U5。将这2个启动子片段PCR扩增后，连入含有GUS报告基因的植物表达载体Ubi-GUS，得到重组表达载体U1-GUS和U5-GUS。重组载体通过农杆菌介导法转化水稻和狗尾草，PCR筛选阳性转化苗，对阳性转化苗进行GUS染色分析，鉴定U1和U5的启动子活性。GUS染色观察发现，所有以U1和U5为启动子的水稻和狗尾草阳性转化苗的根、茎和叶均呈现较深的蓝色，比以玉米Ubi-1为启动子的阳性转化苗的蓝色略深，且以U5为启动子的阳性转化苗比以U1为启动子的蓝色更深，而非转基因的水稻和狗尾草小苗则完全染不上蓝色。因此，启动子U1和U5在水稻和狗尾草中均具有组成型强启动子的活性，可作为新的组成型启动子应用于高粱、水稻、狗尾草及其他单子叶植物的遗传转化研究。     

荔枝果皮花色苷生物合成及调控机理研究进展

荔枝是无患子科荔枝属的亚热带常绿果树,具有很高的商业价值。荔枝果皮色泽由多种色素决定,是影响消费者需求的重要品质性状。果实着色是花色苷积累的结果,荔枝果皮花色苷的生物合成是一个复杂的过程,主要由遗传背景决定,同时受内外环境影响。本文重点介绍荔枝果皮花色苷的生物合成途径,从外界环境、生理生化以及分子生物学等方面,对花色苷积累的调控机制进行综述,并展望该领域的研究方向,为提升荔枝果实的色泽品质提供重要参考。     

WRI1调控植物油脂合成的研究进展

油脂是植物主要的储能物质，也是植物质膜的重要组分，同时还参与植物信号传导、气孔开闭、授粉受精、种子萌发、胁迫响应等多个生物学过程。WRINKLED 1（WRI1）是AP2转录因子家族的成员，在油脂合成过程中起重要调控作用。本文综述了近年来WRI1在植物油脂合成中的研究进展，主要包括（1）WRI1的发现、起源和进化特征；（2）WRI1的基因表达特征、基因结构、蛋白质结构和启动子顺式作用元件；（3）WRI1的转录水平和翻译水平调控机制以及下游的靶基因；（4）对WRI1后续的研究思路和应用前景进行展望。本综述内容以期为深入了解WRI1调控植物油脂合成的分子机制提供参考，也为利用WRI1改良油料作物提供理论基础。     

BnPHR1转基因油菜低温抗性机制探究

植物低磷与低温胁迫应答之间存在基因调控及生理生化适应关联性。MYB-CC家族转录因子PHR1是植物低磷应答核心调控因子,但PHR1是否参与植物低温胁迫应答调控及其扮演的功能还不清楚。本文以BnPHR1过量表达转基因油菜为材料,探究BnPHR1在油菜低温胁迫应答中的调控功能。相比野生型油菜,BnPHR1过量表达转基因油菜株系对低温的耐受性明显提高,叶片萎焉程度减轻。电导率和丙二醛含量分析表明转基因油菜细胞膜损伤程度降低。为了进一步探究BnPHR1在低温胁迫中的作用,从野生型（WT）及BnPHR1过量表达转基因油菜转录组数据中挖掘低温胁迫应答相关差异表达基因,探索BnPHR1影响油菜低温抗性的可能机制。转录组数据分析结果显示,在油菜地上部分和根BnPHR1调控的差异基因中,分别有44和49个低温应答相关基因,如BnCOR15B,BnCOR78,BnCBF2等。BnPHR1调控差异基因启动子分析发现26个差异基因启动子中含有P1BS元件,其可能受BnPHR1直接调控。这些结果表明BnPHR1可能通过影响下游低温应答相关基因表达提高转基因油菜应对低温胁迫耐受性。     

茉莉花香气相关基因JsTPS启动子的克隆与活性分析

以茉莉(Jasminum sambac)的花苞为材料,采用染色体步移技术,分离出JsTPS基因的5'端调控序列,对该启动子序列进行顺式作用元件预测.根据茉莉花TPS基因启动子的顺式作用元件分布,扩增出5个不同片段长度的启动子,分别命名为JsTPS-1(494 bp)、JsTPS-2(689 bp)、JsTPS-3(10...     

广东雷州杂草稻黑壳基因Bh4和红皮基因Rc的基因型鉴定

为测定雷州杂草稻的黑色颖壳基因Bh4和红色果皮基因Rc的基因型,本研究对雷州10个杂草稻群体的100个单株的种子的颖壳和果皮颜色进行表型观察,同时通过PCR扩增及序列分析对Bh4和Rc的基因型进行鉴定。结果表明,雷州杂草稻中黑色颖壳和黄色颖壳的种子几乎各占一半,果皮颜色则以红色为主,有少量白色和浅红色果皮的种子。雷州杂草稻的Bh4和Rc的基因型与表型鉴定结果一致。57份黑色颖壳杂草稻的Bh4基因型为39个野生型和18个杂合型,25份黄色颖壳和18份黄色带黑斑颖壳杂草稻的Bh4基因型均为缺失22 bp的突变型;90份红色果皮杂草稻的Rc基因型为73个野生型和17个杂合型,4份白色和6份浅红色果皮杂草稻的Rc基因型均为缺失14 bp的突变型。本研究为分析雷州杂草稻的Bh4和Rc基因的来源提供了分子基础。     

荔枝快速碱化因子基因的克隆与表达分析

从已构建的荔枝果皮cDNA文库中挑取克隆测序,获得一条荔枝快速碱化因子(LcRALF)基因(GenBank登录号:EU024484).该基因的cDNA全长为666 bp,含1个381 bp的开放读码结构,编码126个氨基酸.生物信息学分析表明,该基因的氨基酸序列与拟南芥、烟草等物种的RALF基因一致性较高,具有RALF基因氨基酸序列的典型特征.RT-PCR分析表明,该基因在荔枝果皮中特异表达,且在新采收的荔枝果皮中表达量最高.随着果皮的衰老该基因表达量逐渐下降.     

菠萝AcSOC1基因调控因子筛选

菠萝（Ananas comosus）是我国热区种植的主要经济作物之一,农业种植上常通过施用乙烯利促其成花,但关于乙烯诱导菠萝成花的分子机制与植物体内已知的五大成花途径之间关系尚不清楚。SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1）是一种开花整合因子,能够整合多种成花信号,诱导植物成花。有实验数据显示,AcSOC1（XM_020238379.1）基因响应乙烯诱导,在乙烯处理菠萝后,AcSOC1表达量上升。为了深入了解SOC1在菠萝成花中的作用及乙烯诱导菠萝成花与五大成花途径之间的关系,本研究以乙烯敏感品种‘台农4号’为材料,克隆AcSOC1启动子,构建pAbAi-pAcSOC1诱饵载体,利用酵母单杂技术,筛选AcSOC1候选调控因子,并用双荧光素酶实验进行验证。结果显示：共筛选出4个AcSOC1候选转录的调控因子:GHD7 （Heading Date7）、SVP1（SHORT VEGETATIVE PHASE 1）、SVP2（SHORT VEGETATIVE PHASE 2）、AP1（APETALA1）,只有AcSVP1、AcSVP2与pAcSOC1存在互作关系。SVP是一种开花抑制因子,乙烯能够抑制菠萝AcSVP基因表达。因此推断认为,乙烯诱导菠萝成花,可能是通过抑制AcSVP基因实现的,即乙烯通过抑制AcSVP的表达,从而降低了AcSVP对AcSOC1表达的抑制作用,AcSOC1表达增强,加快了乙烯诱导成花的过程。     

荔枝P型ATP酶基因家族鉴定及其在采后贮藏过程中响应拮抗菌N-1的表达模式分析

P型ATP酶是植物体内一种重要的膜转运蛋白,在果实能量代谢和酸代谢中发挥重要作用,并广泛参与植物离子运输、抗逆、细胞信号转导等各项生命活动,然而在荔枝或其他无患子科植物中尚未对P型ATP酶基因家族进行全面分析,本研究基于‘妃子笑’荔枝转录组数据,通过对这些基因进行生理生化分析、生物信息学分析和表达分析,共鉴定了28个P型ATP酶基因家族成员基因,探讨P型ATP酶在荔枝采后贮藏过程中的潜在功能。结构和系统发育分析表明该基因可以分为5个亚家族,同一亚族的基因在基因结构和motif基序方面具有很大的相似性,其蛋白二级结构主要以α-螺旋为主,亚细胞定位预测分析发现LcPAs多定位于线粒体（21/28）。通过转录组分析,在采后贮藏期间,荔枝P型ATP酶家族基因中上调表达的基因明显高于下调表达基因,暗示其可能在荔枝采后品质劣变过程中发挥着积极的抵御作用。使用拮抗菌N-1处理荔枝可以有效抑制其果实采后褐变和病害的发生,结合RT-qPCR结果,发现拮抗菌N-1处理能诱导LcPA1、LcPA7、LcPA8和LcPA19在整个贮藏过程中的上调表达,并维持了较高的ATP酶活性,进一步说明P型ATP酶家族基因在抑制荔枝病变过程中发挥着重要作用。本研究为了解荔枝P型ATP酶基因家族基因的进化和功能分析提供了参考,为深入了解拮抗菌N-1保鲜机理的分子调控机理提供新的证据。