定性PCR方法检测转基因玉米MON810转化事件的研究

转基因玉米MON810(Yield Gard R)是孟山都公司通过DNA重组技术和微注射轰击研发的一种具有对欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nublialis)有特殊抗性的转基因玉米品系,目前在世界各地已经得到广泛种植,为加强对该品系玉米的安全管理,本研究旨在建立MON810品系玉米的转化事件特异性定性PCR检测方法。根据MON810的插入序列信息,在3′端的侧翼序列处设计定性PCR检测的引物,检测MON810在其他几种常见转基因作物混合样品的特异性。结果表明,该方法具有很好的特异性。同时检测该引物系统的扩增灵敏度,结果表明,检测引物的灵敏度可达0.1%。建立的MON810特异定性PCR检测方法经全国7家实验室的验证,进一步证实该方法能够特异地检测出样品中的MON810转化事件,检测方法的灵敏度可达0.1%,且检测结果具有良好的可重复性和可重现性。MON810转化事件定性PCR检测方法的建立可满足于抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种生物安全管理的需要。     

拮抗香蕉枯萎病菌的解淀粉芽孢杆菌LX1菌株的鉴定及其抗菌蛋白基因的克隆

收集海南不同盐碱地的土样进行拮抗香蕉枯萎病菌的微生物分离,对具有较强抑菌作用的菌株进行形态特征、生理生化和分子鉴定,并克隆其抗菌蛋白基因.结果分离到1株具有较强抑制香蕉枯萎病菌能力的细菌LXl,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).抑菌实验发现LX1菌株的发酵上清液中粗蛋白有一定的抑菌作用,经过Sephacryl S-200HR柱层析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化了其中抑菌作用最强的抗菌蛋白.质谱鉴定结果表明,抗菌蛋白与B.amyloliquefaciens FZB42内切葡聚糖酶同源性最高.根据质谱结果克隆了该抗菌蛋白的编码基因,该基因的核苷酸和氨基酸序列与B.amyloliquefaciens FZB42的内切葡聚糖酶的核苷酸和氨基酸序列同源性分别达99％和100％.拮抗香蕉枯萎病菌的芽孢杆菌LX1可作为潜在的防治香蕉枯萎病的的生防制剂,其抗菌蛋白基因也可通过遗传工程应用于香蕉枯萎病的防治.     

广东雷州杂草稻sh4和qSH1基因的功能SNP位点序列分析

sh4和qSH1基因是水稻的主效落粒基因,本研究旨在测定雷州杂草稻的sh4和qSH1的基因型,为雷州杂草稻的落粒机制研究提供分子基础。本研究从雷州10个杂草稻群体采集了100个单株及10份栽培稻种子,观测其颖壳颜色、果皮颜色和芒及落粒率,并对sh4和qSH1的功能SNP位点进行PCR扩增及序列分析。结果表明,57份杂草稻的sh4功能SNP位点为野生落粒型（G）,15份为杂合型G/T,28份为突变难落粒型（T）。其中,G型和G/T型的72份杂草稻的落粒率都极高（95%~100%）,而28份T型杂草稻中,19份为中度落粒（30%~75%）,5份杂草稻的落粒率很高（>95%）,4份杂草稻的落粒率小于30%。100份杂草稻和10份栽培稻的qSH1功能SNP位点均为G。结合落粒表型及基因型,推测sh4是调控雷州杂草稻落粒性的一个主要基因。     

广东雷州杂草稻黑壳基因Bh4和红皮基因Rc的基因型鉴定

为测定雷州杂草稻的黑色颖壳基因Bh4和红色果皮基因Rc的基因型,本研究对雷州10个杂草稻群体的100个单株的种子的颖壳和果皮颜色进行表型观察,同时通过PCR扩增及序列分析对Bh4和Rc的基因型进行鉴定。结果表明,雷州杂草稻中黑色颖壳和黄色颖壳的种子几乎各占一半,果皮颜色则以红色为主,有少量白色和浅红色果皮的种子。雷州杂草稻的Bh4和Rc的基因型与表型鉴定结果一致。57份黑色颖壳杂草稻的Bh4基因型为39个野生型和18个杂合型,25份黄色颖壳和18份黄色带黑斑颖壳杂草稻的Bh4基因型均为缺失22 bp的突变型;90份红色果皮杂草稻的Rc基因型为73个野生型和17个杂合型,4份白色和6份浅红色果皮杂草稻的Rc基因型均为缺失14 bp的突变型。本研究为分析雷州杂草稻的Bh4和Rc基因的来源提供了分子基础。     

环介导等温扩增技术及其在转基因作物检测中的应用

转基因作物及其产品的安全性一直存在着较大的争议,人们对转基因产品仍持谨慎态度。因此,快速、准确、灵敏的转基因检测手段对转基因生物的安全监管至关重要。环介导等温扩增(LAMP)是一种恒温核酸扩增的技术,其设备简单、成本低廉、结果可视化,且灵敏度高,现已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫、转基因等检测行业。介绍了LAMP技术的原理、特点和联合应用其他技术,及其在转基因作物与产品检测方面的应用情况。     

植物甜蛋白马宾灵（Mabinlin Ⅱ）的二级结构及其B细胞抗原表位预测

马宾灵（MabinlinⅡ）是中国所特有的植物甜蛋白,在目前已知的7种植物甜蛋白中具有最佳的热稳定性,将其作为新型甜味剂有着广阔的市场前景。本研究以马宾灵的氨基酸序列为基础,采用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法预测马宾灵的二级结构,采用Karplus-Schulz方法预测马宾灵的蛋白质骨架区柔韧性,采用Kyte-Doolittle方法预测马宾灵的蛋白质疏水性,采用Emini方法预测马宾灵的蛋白质表面可能性,采用Jameson-Wolf方法预测马宾灵的B细胞抗原表位。分析结果表明,马宾灵的A链多形成转角和无规则卷曲结构,A链的N端27～30区段形成较柔软的蛋白质骨架结构,A链的N端4～6、7～9、10～11、12～14、20～22、23～26和30～33区段为抗原位点的可能性较大;马宾灵的B链多形成β折叠和转角结构,B链的N端0～7、9～13、28～29、33～34、40～45、53～54和55～57区段为抗原位点的可能性较大。本研究以生物信息学手段分析预测马宾灵的二级结构及其B细胞抗原表位,为设计马宾灵多克隆抗体以检测马宾灵在不同生物反应器中的表达研究提供参考数据。     

2个14-3-3蛋白基因在香蕉果实成熟过程中的表达分析

通过简并引物和降落PCR方法结合RACE(rapid amplification of c DNA end)技术在香蕉果实c DNA文库中获得2个14-3-3基因,分别命名为Ma14-3-3d和Ma14-3-3h,把Ma14-3-3d和Ma14-3-3h与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i进行多重序列比对和同源性比较。结果表明:Ma14-3-3d和Ma14-3-3h与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i具有较高的同源性,同时具有一定的差异性。遗传进化分析结果表明,Ma14-3-3d与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i同属于non-ε类14-3-3基因,Ma14-3-3h属于ε类14-3-3基因。RT-PCR分析结果表明,Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉不同器官中差异表达,Ma14-3-3d在香蕉的根、茎、叶、花和果中均有表达,且在茎、叶和花中的表达量高于根和果;Ma14-3-3h在根、花和果中的表达量较高,而在茎和叶中的表达量较低。q RT-PCR分析结果表明,Ma14-3-3d基因的表达明显受乙烯的诱导,而Ma14-3-3h在正常成熟、乙烯处理与1-MCP处理的果实中表达量均很低,与果实成熟的相关性不明显。推测Ma14-3-3d可能与香蕉果实成熟密切相关,可能参与乙烯调控果实成熟过程中的生物合成与信号转导。     

香蕉内生拮抗细菌KKWB-10的分离鉴定及其内生性证明

从香蕉体内分离拮抗香蕉枯萎病菌的内生细菌,旨在应用于香蕉枯萎病的生物防治。从健康香蕉植株的球茎分离到多株细菌,对其进行了拮抗香蕉枯萎病菌4号小种的实验,选择其中1株拮抗性较强的菌株KKWB-10进行了形态特征、生理生化测定、16S rDNA序列分析,并通过浸根法将标记了绿色荧光蛋白GFP的该菌（K-pUCK7-1′GT菌）回接无菌的香蕉组培苗,培养10天后,制备香蕉苗的根和茎的手工切片于激光共聚焦显微镜下观察。抑菌实验结果表明,该菌株对香蕉枯萎病菌4号生理小种有较强的抑制作用。通过形态学观察、生理生化指标测定、16S rDNA序列同源性分析,将该菌株初步鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。激光共聚焦显微镜观察发现经K-pUCK7-1′GT菌液处理的香蕉组培苗的根和茎的切片中均发现绿色荧光,而未处理的对照组的香蕉苗却没有发现绿色的荧光,表明该菌株能定殖于香蕉的根和茎内。该菌株可直接作为生防菌剂,也可用作外源抗病基因在香蕉植株体内表达的载体,在香蕉枯萎病菌的生物防治中具有一定的潜在价值。     

从拮抗枯萎病的香蕉植株中分离内生细菌的研究初报

香蕉枯萎病已成为香蕉产业的毁灭性病害,近年在中国的香蕉主要区迅速蔓延,目前还未找到有效的解决措施。在海南枯萎病严重发病多年的香蕉园中,发现在严重感病致死的植株包围中,存在着能正常挂果并成熟的植株。由于它们在品种上的相同性,因此从品种的差异上难以解释该现象。分离了其中的内生微生物,发现其中的内生微生物主要以细菌为主,一部分细菌能分泌几丁质酶,对病原菌有一定的拮抗性,尤其在香蕉杆浸出汁培养基中对病原菌的生长有一定抑制作用。这为香蕉枯萎病的生物防治提供了一条较好的思路。     

紫外诱变筛选海洋红酵母S8的尿嘧啶缺陷型菌株

本课题组从海南天然海域筛选到一株高产类胡萝卜素的海洋红酵母菌株S8,该菌株对鱼无毒害,并与鱼共生,欲将其应用于盐诱导表达外源蛋白的海洋红酵母工程菌的构建。本研究利用紫外诱变筛选的方法处理S8菌株,通过统计其UV致死率、5-氟乳清酸致死率等筛选S8的尿嘧啶营养缺陷型突变株。研究结果表明,供试菌株通过紫外线诱变、5-氟乳清酸致死和回复突变率的实验筛选,共获得16株稳定的尿嘧啶缺陷型突变株,突变菌株在基本培养基中培养了8d仍不能生长。选择了其中的一株ST5进行了产胡萝卜素能力的测定,结果表明,在同样的培养条件下,野生型S8菌株细胞生物产量可达87.55g/L,类胡萝卜素含量可达520μg/g,突变株ST5的细胞生物产量为85.45g/L,类胡萝卜素含量为512μg/g;ST5的产胡萝卜素能力方面与野生型S8无明显差异。因此,尿嘧啶缺陷型菌株ST5可为下一步海洋红酵母工程菌的构建提供受体菌。