香蕉果实的1个14-3-3蛋白同源基因的克隆及序列分析(简报)

根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的1个14-3-3蛋白基因片段,采用PCR和RACE相结合的方法从香蕉(Musa acuminate L.AAA group cv.Brazilian)cDNA文库中筛选到其全长cDNA序列.序列测定和Blastx比对分析结果表明,该cDNA全长1 037 bp,含有1个完整的阅读框,其编码区编码261个氨基酸残基,具有植物14-3-3蛋白基因的保守结构域,并与其他植物来源的14-3-3蛋白具有很高的同源性,将其命名为Ma-14-3-36(Musa acuminate 14-3-3).采用遗传进化系统发育树的分析结果表明,Ma-14-3-36与来源于单子叶植物的多数14-3-3蛋白基因序列在同一个进化枝上.采用RT-PCR对其在香蕉果实发育不同时期的表达进行分析结果表明,在香蕉果实发育的不同时期差异表达,推测其可能在果实的发育中起作用.     

巴西橡胶树14-3-3蛋白基因的克隆及表达分析

根据在巴西橡胶树幼态无性系与老态无性系胶乳之间差异表达的一个SSH片段序列信息设计引物,通过RACE技术获得了2个编码14-3-3蛋白的cDNA,命名为Hb14-3-3a和Hb14-3-3b。序列分析表明,Hb14-3-3a和Hb14-3-3b基因长度分别为1 154、1 050 bp,分别编码252、263个氨基酸,分子量为61.7 Ku和64.7 Ku,等电点为5.51和5.14。Hb14-3-3a/b基因在所检测的组织中均有表达,但Hb14-3-3a和Hb14-3-3b的表达模式不一样,Hb14-3-3a在树皮中表达量最高,而Hb14-3-3b在叶中表达量最高。     

γ-氨基丁酸对香蕉果实采后成熟的调控作用及其生理机制

香蕉是世界上最重要的水果之一,研究香蕉采后成熟与调控对香蕉品质形成及创新采后催熟技术具有重要意义。本实验室前期的研究结果发现Ma GAD1基因的表达与香蕉采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关。本研究在此基础上,根据香蕉果实达到全黄并有黑色斑点期(YB)成熟度的天数为标准,筛选出Ma GAD1基因表达的诱导剂γ-氨基丁酸(GABA)能够促进香蕉果实采后成熟。生理学分析结果表明,外源GABA能够促使香蕉果实提前发生生理跃变。实时荧光定量PCR分析结果表明,外源GABA能够诱导Ma GAD1和Ma ACS1上调表达。因此,GABA通过诱导Ma GAD1和Ma ACS1上调表达及促进香蕉果实生理跃变,从而促进香蕉果实采后成熟。本研究不仅从理论上证明了GABA能够促进果实成熟,揭示了GABA促进果实成熟生理机制,并且从实际生产上为蕉催熟的应用提供了一种新方法。     

橡胶树14-3-3蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

以克隆到的3个编码橡胶树14-3-3蛋白的基因HbGF14a、HbGF14b、HbGF14c和为基础,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-HbGF14a、pGBKT7-HbGF14b、pGBKT7-HbGF14c,并对其进行自激活和毒性实验鉴定.自激活实验结果表明,3个诱饵载体没有自激活性;毒性实验结果表明,pGBKT...     

氨氧乙酸对香蕉采后成熟的调控及其生理机制

前期的研究发现Ma GAD1基因的表达与香蕉采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关。本研究在此基础上,发现Ma GAD1表达的有效抑制剂氨氧乙酸(AOAA)能够延缓香蕉采后成熟。生理学分析表明,外施AOAA能够延长香蕉果实发生生理跃变的时间。实时荧光定量PCR分析表明,外施AOAA能够抑制Ma GAD1和Ma ACS1基因的表达。所以,AOAA通过抑制Ma GAD1和Ma ACS1基因的表达和延缓香蕉果实生理跃变,推迟香蕉果实采后成熟。本研究从理论上证明AOAA能够延缓香蕉果实成熟,揭示AOAA延缓香蕉果实成熟生理机制,并且从实际生产上提供一种可能应用于香蕉保鲜的新方法。     

与甘蔗抗黑穗病性相关的14-3-3基因的克隆和表达分析

为了解14-3-3基因在甘蔗黑穗病抗性中的作用,本研究以课题组前期构建的甘蔗抗黑穗病抑制消减杂交文库中筛选出的1个与14-3-3基因同源的EST序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR方法从甘蔗ROC22品种中分离到1个Sc14-3-3基因(Gen Bank Accession Number:KJ577592),并对其序列信息和基因表达情况进行分析。结果显示,该基因ORF长771 bp,编码256个氨基酸残基;Sc14-3-3是定位于细胞质的亲水蛋白,无跨膜螺旋区及信号肽,有10个Ser、3个Thr和7个Tyr潜在的磷酸化位点,并在N-端有4个蛋白结合区和1个多核苷酸结合区,对翻译和能量新陈代谢起着重要作用;该蛋白属非ε类群,其N-端和中间区域在不同物种间相对保守,C-端差异相对较大。基因表达模式分析显示,Sc14-3-3基因可能参与甘蔗对生物逆境的细胞免疫响应,其对Me JA介导的信号途径应答较SA和ABA早;黑穗病菌胁迫下,Sc14-3-3基因在甘蔗抗感品种中的表达模式存在差异,其在抗黑穗病品种YC05-179中上调表达且表达量变化明显,揭示了该基因参与甘蔗对黑穗病的应答反应。以上结果为甘蔗Sc14-3-3基因的功能研究积累了一定的基础资料,并为今后甘蔗的抗病分子育种提供后备基因资源。     

香蕉MaTPS4基因序列及表达特性分析

通过随机克隆测序法从香蕉根系c DNA文库中获得海藻糖合成酶基因,命名为MaTPS4,全长c DNA序列为2 930 bp,含一个完整的开放阅读框2 574 bp,编码857个氨基酸。生物学信息分析表明,MaTPS4蛋白属于不稳定、疏水性蛋白,pI5.59,结构域TPS和TPP。序列预测分析表明,MaTPS4蛋白定位于细胞质中,具有3个跨膜区域,不存在信号肽。与其他已知植物TPS氨基酸序列同源比对,同源性达到84.90%;进化关系分析表明,香蕉MaTPS4氨基酸与银杏TPS氨基酸序列(AAX16014.1)聚为一类,二者亲缘关系较近,同源性为99%。器官特异性分析表明,MaTPS4在香蕉根系、球茎、假茎、叶、花、果实各器官中均有表达,其中球茎、假茎、叶片和花中表达量较大,根及果实中表达量极少。q RT-PCR分析表明,MaTPS4在根系中的表达经干旱、盐胁迫后均增强,其中盐胁迫24 h时MaTPS4表达量较0 h时高5倍;冷胁迫下,MaTPS4表达量增加,并随时间延长下降,在6 h达到最大;ABA胁迫下,MaTPS4表达量增加,为0 h的5倍;在ACC和Foc TR4胁迫下,MaTPS4表达无变化。因此,MaTPS4可能通过依赖ABA途径调控抗逆胁迫相关基因表达,提高植株对非生物胁迫的抗逆性。     

海南龙血树类黄酮3′-羟化酶基因(DcF3′H)的克隆与表达分析

类黄酮3′-羟化酶(Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)是植物黄酮类化合物骨架修饰途径中的关键酶之一,在形成结构多样化的黄酮类化合物中起重要作用。在前期已获得的龙血树转录组数据基础上克隆了1个海南龙血树F3′H基因,命名为DcF3′H。DcF3′H含有的开放阅读框长1 533 bp,编码510个氨基酸。推导的DcF3′H分子量为58 ku,等电点p I为6.59。DcF3′H含有细胞色素P450的保守结构域和CYP基序,与甘蔗、玉米、猕猴桃、小麦、烟草、黄瓜和大豆等植物的F3′H同源性分别为76%、75%、77%、74%、75%、76%和75%。进化树分析表明,DcF3′H与中国水仙亲缘关系较近,与苜蓿和鹰嘴豆的亲缘关系较远。荧光定量表达结果显示:DcF3′H在根、茎、叶、花和果等组织中均有表达,其中在花中表达量最高,根中表达量最低;无机盐诱导剂处理能显著提高DcF3'H的表达量,处理3 d时DcF3′H的表达量提高了5.58倍。此结果将为进一步研究海南龙血树类黄酮3′-羟化酶基因的功能奠定基础。     

番木瓜酪氨酸氨基转移酶基因CpTAT的分离与分析

番木瓜酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)是维生素E合成途径中的一个关键酶。在已有番木瓜果实成熟差异基因片段序列的基础上,采用RACE技术克隆了TAT基因的全长c DNA序列,命名为Cp TAT。该基因全长包含5′非编码区98 bp,3′非编码区232 bp,开放性阅读框1 266 bp,编码421个氨基酸。序列分析表明,该基因为谷草转氨酶超家族成员,催化活性位点为第253位的赖氨酸,编码蛋白与毛果杨、野草莓、桃、拟南芥和水稻的TAT蛋白同源性分别为83.69%、81.09%、80.76%、78.87%、54.67%。荧光定量分析表明,Cp TAT基因在根中的表达量最高,在茎和果实中的表达较低,在叶中的表达量最低。与对照相比,外源乙烯处理能诱导番木瓜果实中Cp TAT基因表达量升高,而1-MCP处理则抑制了该基因表达,在果实衰老期表达量升高,该基因可能在番木瓜果实成熟衰老中起作用。     

实时荧光定量PCR检测木薯海藻糖合成酶基因（MeTPS1-3）干旱胁迫下的表达

采用实时荧光定量PCR的方法测定木薯SC124和KU50两个品种在模拟干旱胁迫下海藻糖合成酶基因（MeTPS1-3）的转录水平变化。结果显示,与正常水分组相比：干旱处理2 h后,SC124根、茎、下部成熟叶和上部幼叶MeTPS1-3基因的表达量没有明显变化;而在KU50中,根部相对表达量上升了12倍,茎、下部成熟叶和上部幼叶没有明显变化。干旱处理24 h后,SC124根部相对表达量上升约30倍、茎部有微小的上升、下部成熟叶片却有小幅下降、上部幼叶部位上升约4倍;在KU50品种中,根部上升约14倍,茎部有微小的下调,下部成熟叶和上部幼叶表达量下调。木薯遭受干旱胁迫时,根部MeTPS1-3基因上调表达最明显,由此推测其在木薯抗干旱胁迫中起重要调控作用。     

香蕉乙烯受体基因cDNA的克隆及其表达分析

提取香蕉果实总RNA，根据有关文献报道的乙烯受体基因序列设计引物，通过RT-PCR方法扩增其开放读框(open reading frame，ORF)，结果同时扩增出2个长短不同的特异cDNA序列。测序结果表明：其中较长的cDNA序列与该报道的香蕉乙烯受体cDNA序列的对应区段(ORF)长度一致，同源性为99．1％；另一较短cDNA序列为新序列，其与该报道序列的同源性达97．2％，但缺少该报道序列中的19和1036 bp的区段。RT-PCR扩增结果显示，报道的cDNA序列在香蕉果实的几个成熟阶段均有表达，而在根和叶片等组织中检测不到其表达，说明其表达具有果实组织特异性。Southern杂交结果显示，该报道基因序列在香蕉基因组中为单拷贝存在。因此，推测新克隆的缺失cDNA序列可能来自同一基因的转录后剪辑，其可能为1个新的香蕉乙烯受体基因。     

香蕉MuMADS1与泛素激活酶(MuUBA)在采后果实中的相互作用

以香蕉MuMADS1为诱饵载体,采后2 d的香蕉果实的cDNA文库为猎物,采用酵母双杂交的方法得到了泛素激活酶E1的基因片段,命名为MuUBA。采用双分子荧光互补技术进一步验证MuMADS1与MuUBA在植物体内的相互作用。荧光实时定量PCR结果表明,MuMADS1和MuUBA在香蕉中子房发育第4个阶段的表达量最高,但是在茎中的表达量很低,表明其在不同的组织和发育的果实中的表达具有协同性。MuMADS1和MuUBA的表达都受外源乙烯和1-MCP的高度调控,推测MuMADS1和MuUBA在香蕉果实的采后成熟过程中具有很重要的作用。     

香蕉果实采后成熟过程中苹果酸脱氢酶(MDH)及苹果酸含量的变化

以巴西香蕉果实为材料,研究果实采后正常成熟过程中乙烯释放速率,苹果酸脱氢酶(MDH)活性,苹果酸、淀粉以及可溶性总糖含量的变化。结果表明：香蕉果实采后成熟过程中乙烯释放速率在采后10 d开始增加,到采后14 d达到高峰;MDH酶活性在采后10 d迅速增强,到采后16 d达到峰值;苹果酸含量在果实成熟早期上升,晚期下降,可溶性总糖含量逐渐增加,而淀粉含量持续下降。推测MDH通过改变香蕉品质而参与果实成熟。     

不同催熟条件对香蕉后熟均匀性的影响研究

粉、蔗糖、果糖和葡萄糖含量作为参考指标,研究采收后贮藏时间、催熟时间和催熟温度对2种香蕉果实后熟速度的影响。结果表明,采收后仅贮藏5 h的香蕉,在22 ℃、12 h乙烯催熟处理的条件下,尾蕉的成熟指数、表皮颜色、可溶性总糖和葡萄糖的含量和头蕉相比有显著差异,尾蕉成熟速度显著低于头蕉;22 ℃下贮藏5 d后再进行乙烯催熟处理,头蕉和尾蕉的成熟速度基本一致;适当提高催熟温度或延长催熟时间至24 h,也能提高头蕉和尾蕉的后熟一致性     

香蕉泛素结合酶基因的克隆及其功能初步分析

根据香蕉根系均一化全长cDNA文库筛选出一个香蕉泛素结合酶基因的片段通过RACE技术克隆该基因,命名为mauce2.生物信息学分析表明,该基因全长为929 bp,有一个完整的ORF编码148个氨基酸,蛋白分子量为16 505.1 ku,理论等电点为8.41,是一个碱性氨基酸.与江南卷柏、大豆、苹果、拟南芥的同源性为97.97％、97.30％、96.62％、95.95％.器官特异性表达分析表明,该基因在各器官中均有表达,在花中表达量最高,根次之,叶中表达量最低.     

HXKs基因在香蕉果实后熟过程中功能初探

香蕉是世界主要水果之一,对乙烯非常敏感,属于呼吸跃变型果实。目前,香蕉果实后熟机理还未完全探明,后熟过程中己糖激酶(HXK)与乙烯的关系还不清楚。通过BLAST比对从香蕉基因组数据库中发现HXK基因家族的11个成员,经克隆获得这些基因的序列,并研究HXKs基因在香蕉果实自然后熟过程中的转录表达谱,重点研究乙烯利、甘露糖、NAG和1-MCP对HXKs基因表达、HXK酶活和内源乙烯生物合成的影响。结果表明:在香蕉果实后熟过程中HXKs基因呈现差异性表达,乙烯利上调大多数HXKs基因的表达和HXK酶活,1-MCP的作用正好相反,这表明外源乙烯正作用于HXK。另一方面,甘露糖加快内源乙烯生物合成,NAG却推迟内源乙烯生物合成,这说明HXK正作用于内源乙烯生物合成。所以,在香蕉果实后熟过程中乙烯和HXK之间存在相互促进的关系。这将为进一步阐明香蕉果实后熟机制提供理论依据,也将为香蕉果实保鲜新技术的挖掘提供新思路。