水稻抗稻瘟病菌防卫反应的细胞学分析与防卫基因表达

对水稻类病变坏死突变体 lmm1　(LmmKaty)与原亲本及双单倍体YT14和YT16接种稻瘟病菌24 h内的抗病反应、细胞学和分子作用机理进行了研究。人工接种实验表明,与原亲本相比,该突变体对稻瘟病菌具有更强的抗性。突变体接种20~24 h后,自动荧光检测到细胞死亡,而对照则未检测到。表明该突变体通过细胞程序性死亡阻止稻瘟病菌的蔓延,从而提高了抗病性。Northern blotting结果发现,抗病品系YT14中的防卫相关基因、苯丙氨酸解氨酶基因和β 葡聚糖酶基因在人工接种稻瘟病菌6 h后开始表达,16~24 h后上述基因表达量快速增加;而病程相关蛋白基因 PR 1和几丁质酶基因在人工接种稻瘟病菌24 h后才开始表达。与YT14相比,感病品系中上述基因的表达明显延迟。表明在人工接种稻瘟病菌24 h内水稻可启动抗病防卫反应,从而对稻瘟病菌产生抗性。     

水稻斑点叶变异研究进展

大多数水稻斑点叶突变体是研究稻瘟病抗性、白叶枯病抗性以及植物程序性细胞死亡机理的理想材料。已经阐明了49份水稻斑点叶突变体的遗传模式,并成功克隆分离了若干斑点叶基因。综述了这些突变体的来源、遗传模式、基因定位和克隆,基因的功能以及它们对水稻主要病害的反应。     

一个抗病性增强的水稻类病变突变体的蛋白质组学研究

水稻类病变突变体chl1具有抗病性增强的类病变表型,对水稻白叶枯病和稻瘟病都具有很强的抗性。利用蛋白质组学技术分析chl1与其野生型之间的差异表达蛋白,探讨chl1类病变表型的形成和抗病反应的分子机制。利用荧光双向差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)技术和质谱分析,chl1中共鉴定到70个差异表达的蛋白点,包括46个上调蛋白点和24个下调蛋白点。这些蛋白点参与不同的生物过程,包括防御相关、光合作用、氧化还原、氨基酸/蛋白质代谢、分子伴侣、碳水化合物代谢。对这些差异表达蛋白进行生物信息分析,推测它们所在的复杂调控网络可能参与chl1叶片细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)及其抗病性的调控。     

拟南芥AtTrx5增强植物菌核病的抗性研究

核盘菌是危害十字花科作物生产的重要病原菌。核盘菌诱导寄主产生过量活性氧（ROS），造成寄主细胞死亡，硫氧还蛋白（Trx）在寄主抗氧化过程中起重要作用。筛选并鉴定硫氧还蛋白（Trx），分析其与核盘菌抗性的关系，将为植物抗菌核病育种提供基因资源。本研究通过生物信息学及转录组数据分析，从拟南芥中筛选到一个关键Trx基因AtTrx5。AtTrx5与甘蓝型油菜BnaA08g04320D的亲缘关系最近，氨基酸相似性为85%。油菜同源基因Trx5表现出上调表达。AtTrx5超表达植株在接种核盘菌24 h后的菌斑面积相比野生型（WT）减小30%～39%，而AtTrx5基因T-DNA突变体的菌斑面积比WT增加39.2%。在侵染过程中超表达转基因拟南芥中AtTrx5的表达量均高于WT，而T-DNA突变体中AtTrx5的表达量则低于WT。DAB染色、H2O2含量、·O2-含量测定结果表明，侵染过程中拟南芥T-DNA突变体中积累的ROS高于WT，超表达转基因拟南芥中积累的ROS少于WT。     

OsLOX10正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性

【目的】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病和由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白叶枯病严重影响水稻的产量和品质。创制转OsLOX10基因水稻材料，进行稻瘟菌和白叶枯菌的抗病性分析，有助于揭示其调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性机制。【方法】采用CRISPR/Cas9系统构建OsLOX10的敲除载体，利用限制性内切酶XcmⅠ线性化pCXUN-HA，TA连接构建OsLOX10的过表达载体，遗传转化获得OsLOX10转基因水稻，筛选过表达株系和纯合敲除株系进行真菌和细菌的抗病性分析。在稻瘟菌（Guy11）侵染水稻后，对水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）途径的标志基因进行qRT-PCR分析;在几丁质（chitin）和flg22诱导下，观测水稻活性氧（reactive oxygen species，ROS）的暴发情况。【结果】 qRT-PCR分析表明，接种稻瘟菌和白叶枯菌24 h后，OsLOX10表达量上调;OsLOX10的纯合敲除和过表达水稻转基因株系接种稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液，与野生型（日本晴）相比，OsLOX10敲除株系更易感病，过表达株系则无典型的病斑症状;接种 6、12、24和36 h时，3个病程相关蛋白基因OsPBZ1、OsPR1a、OsPR1b和SA通路基因OsPAL1，以及JA合成通路上的2个基因OsAOS2、OsLOX5的转录水平在敲除转基因株系中显著下调，而在过表达转基因株系中显著上调。对转OsLOX10基因水稻接种白叶枯菌（PXO99A），发现敲除OsLOX10的转基因水稻对白叶枯菌更易感病。qRT-PCR分析OsPR1b和OsPAL1以及JA合成通路上的3个基因OsAOS2、OsAOC和OsJAZ在OsLOX10过表达基因水稻中表达量明显上调，而在敲除OsLOX10的转基因水稻中却保持在较低水平，在接种7 d后表现出显著性差异。在几丁质和flg22诱导下，OsLOX10敲除株系的ROS水平显著性降低，而且在几丁质诱导下，ROS的起峰时间推迟。【结论】稻瘟病菌和白叶枯病菌能够诱导OsLOX10的表达，OsLOX10通过病原菌分子模式触发的免疫途径（PTI）参与抗病反应，其在水稻抵御稻瘟病和白叶枯病中起着正调控作用。同时，OsLOX10可能通过调节SA和JA介导的信号通路来正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。     

台盼蓝染色鉴定拟南芥sdl1突变体的细胞死亡

拟南芥突变体sdl1在光周期为16 h黑暗/8 h光照条件下生长叶片出现先萎蔫后白化现象,采用台盼蓝染色的方法研究萎蔫及白化苗的死亡情况,结果证实突变体sdl1萎蔫处发生细胞死亡,但细胞完全死亡（完全白化）后不能被染色,所以台盼蓝染色只能对突变体sdl1细胞死亡的早期进行鉴定。     

水稻类病变突变体性状及分子机理研究进展

类病变突变体是植物在无显著逆境或损伤情况下以及未受到病原物危害时叶片上自然形成的类似病斑的一类突变体。水稻类病变突变体的产生常伴有抗病性的增强,其中涉及到防御相关基因的表达。相关研究主要集中于各种突变体的定位和克隆以及突变体的抗病性和抗病机制。综述了水稻类病变突变基因的性状及抗病性的研究进展,特别是对水稻类病变突变体形成原因、遗传特性、调控途径进行了梳理,并提出对水稻抗病育种的展望,以期为进一步分析类病变突变体的各种机制奠定理论基础,并为水稻育种提供参考。     

水稻中对不亲和白叶枯病菌株专一识别的多肽

 经蛋白质双向电泳分析，发现水稻IR26、IR1545及TN1各有一个多肽能与不亲和的白叶枯病菌株产生特异性作用而消失，但与亲和菌株相互不发生作用。成株期抗病品种南粳l5在成株期有与不亲和菌株作用的多肽存在．而在苗期则未观察到这一多肽。对全期抗病品种IR26分析表明，它无论在成株期还是苗期均出现一个与不亲和菌株专一作用的多肽。经典遗传学分析认为有三个抗白叶枯病基因的DV85，则观察到DV85有两个以上的菌株特异性多肽。由于选些多肽表现出菌株的专一性及其它表达生理时期均与该品种的田间抗病表型一致，同时多肽的数目也与经典遗传学分析结果类似，推测这些多肽可能是抗病基因的产物。     

多年生稻白叶枯病抗性评价

利用长雄野生稻地下茎无性繁殖特性培育多年生稻已经成功,并在生产上进行了示范推广。为明确多年生稻品种（系）对白叶枯病的抗性表现,通过田间病情调查、抗性水平鉴定和水稻白叶枯病抗性基因检测3种方法,对多年生稻品种（系）多年生稻23（简称PR23,下同）、云大24（PR24）、云大25（PR25）、云大101（PR101）、云大107（PR107）及其父本长雄野生稻、母本RD23和F₁（RD23/长雄野生稻）的白叶枯病抗性进行评价。结果表明,长雄野生稻高抗白叶枯病;尽管PR23、PR24、PR25、PR107携带白叶枯病抗性基因Xa1、Xa4、Xa23、xa25的等位基因,但在田间自然发病条件下均易感白叶枯病,说明这几个抗性基因对这4个多年生稻品种（系）不起抗病作用;而PR101在田间自然发病条件下表现为抗白叶枯病,并含有白叶枯病抗性等位基因xa25、Xa27,说明这2个基因可能是PR101抗白叶枯病的基因。本研究结果为明确多年生稻对白叶枯病菌的抗病反应,以及抗白叶枯病育种和多年生稻生产布局提供了一定依据。     

抗白叶枯病水稻不育系先抗A和天抗A的选育

分别以保持先B和天B为受体和轮回亲本,以携带抗白叶枯病基因Xa23的育种材料P59为供体,通过杂交、回交和分子标记辅助选择,结合农艺性状表现和田间接种抗性鉴定,育成2个含有Xa23基因且抗白叶枯病的保持系先抗B和天抗B,再分别与先A与天A测交、成对回交,育成抗白叶枯病水稻不育系先抗A和天抗A,于2013年9月通过广西科技厅田间技术鉴定。这2个不育系具有败育彻底、农艺性状优良、异交结实率高和抗白叶枯病等特点,配制的杂交稻组合表现出明显的白叶枯病抗性和产量优势,具有较好的应用前景。     

水稻抗病基因介导的抗白叶枯病反应中蛋白质表达谱的比较分析

采用双向电泳 质谱分析技术,比较分析了水稻在接种白叶枯病菌 （Xanthomonas oryzae pv. oryzae）1、4、8、24、72 h 后蛋白质表达谱的差异。通过比较接种白叶枯病菌和对照之间、接种不同白叶枯病菌生理小种之间的表达差异,鉴定了72个差异表达的抗病相关蛋白点,对其中部分点的蛋白质进行了电离子喷雾二级质谱学分析鉴定,确定了11个抗病反应中差异表达的蛋白质。     

CecropinB与Xa21基因共表达提高转基因水稻白叶枯病抗性

为了探明CecropinB与Xa21这两种不同抗病途径的基因单独或共表达后的田间抗白叶枯病表现,利用农杆菌转化技术,获得了这两个基因的单独和共表达后的植株。利用PCR等分子鉴定技术,证明这两个基因已经整合到水稻基因组中。抗病性检测结果表明,Xa21和CecropinB均能提高水稻对白叶枯病的抗性,且Xa21的抗病性较CecropinB明显。Xa21和CecropinB基因共表达后的植株的抗病性比单基因的更强,说明将不同抗性机制的基因共表达,可以在育种上利用以提高水稻的白叶枯病抗性。     

白叶枯病菌xopXoo基因在致病性中的作用

辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv)在非寄主烟草上的过敏反应与xopX基因有关,但在白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)基因组中并未标注xopX同源基因的功能。为研究白叶枯病菌中xopX同源基因在致病性中的作用,对白叶枯病菌的xopXoo基因进行了克隆和突变,并对xopXoo突变体在非寄主烟草上的过敏反应、水稻苗期的水浸症状以及成株期的致病性和病菌生长能力进行了分析。测定结果显示,xopXoo基因突变并不改变白叶枯病菌在烟草上激发过敏反应和在水稻上产生水浸症状能力,但突变菌株在成株期水稻上的致病性和菌体生长能力显著下降。遗传互补能够恢复xopXoo突变体的致病性和菌体生长能力,表明xopXoo是白叶枯病菌的致病性基因。还对白叶枯病菌激发非寄主烟草产生过敏反应的可能基因进行了讨论。     

水稻体细胞突变体HX-3在细胞水平上对白叶枯病的抗性

对水稻抗白叶枯病体细胞突变体HX-3及其感病供体明恢63在细胞水平上与白叶枯病菌的互作进行了研究。结果表明,接种水稻白叶枯病菌浙173后,明恢63愈伤组织的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性均急剧大幅升高,O[sub]2[/sub]产生速率升高,而愈伤组织生长量减小,蛋白质含量下降。HX-3愈伤组织接菌后SOD、POD活性和O[sub]2[/sub]产生速率与未接菌愈伤组织相似,愈伤组织生长量减小不明显。说明HX-3与明恢63的细胞水平抗性存在较大差别,HX-3细胞水平抗性与植株水平抗性是一致的。     

Resistance to Bacterial Leaf Blight in a Somaclonal Rice Mutant HX-3 at Cellular Level

The interaction between rice host and its pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) at cellular level was studied by using a resistant somaclonal mutant HX-3 and its susceptable donor Minghui 63. After inoculation with Xoo strain Zhe 173 (Chinese pathotype |\ ). the activity of superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) in the callus of Minghui 63 was increased dramatically, and the active oxygen(O2^-) was produced at a higher rate; Meanwhile, the callus grew slowly with the reduction of protein content. Compared to the activity of SOD and POD. the production rate of O2^- and the fresh weight in HX-3 callus varied little after the inoculation. It could be proposed that there were great differences between the resistance of HX-3 and Mighui 63 at cellular level. There was no difference detected concerning resistance to bacterial leaf blight in HX-3 between the plant and the callus.     

水稻白叶枯病菌小种分化的监测

通过每10年1次对病原菌致病力分化的监测发现,国内稻区病菌小种的组成基本稳定,仅个别小种有所变化。目前流行的优势小种仍为C1和C2群,即携带有[i]Xa3[/i]抗性基因的品种仍可广泛种植;但能够侵染[i]Xa4[/i]抗性基因的C4、C5群小种的数量有所增加,即将达到流行的阈值。为便于与国内外小种鉴别的结果相比较,选用IRRI推出的几个近等基因系材料作为鉴别品种,将中国的白叶枯病菌区分为8个小种(C1~C8)     

Identification and Genetic Mapping of a Lesion Mimic Mutant in Rice

A lesion mimic stripe mutant,designated as lms1(lesion mimic stripe 1),was obtained from the M2 progeny of a 60Co γ-radiation treated japonica rice variety Jiahua 1.The lms1 mutant displayed propagation type lesions across the whole growth and developmental stages.Physiology and histochemistry analysis showed that the mutant exhibited a phenotype of white stripe when grown under high temperature(30 ℃),and the lesion mimic caused by programmed cell death under low temperature(20 ℃).The genetic analysis indicated that this lesion-mimic phenotype is controlled by a single locus recessive nuclear gene.Furthermore,by using simple sequence repeat markers and an F2 segregating population derived from two crosses of lms1 × 93-11 and lms1 × Pei'ai 64S,the lms1 gene was mapped between markers Indel1 and MM0112-4 with a physical distance of 400 kb on chromosome 6 in rice.     

RPA-Assisted Cas12a System for Detecting Pathogenic Xanthomonas oryzae,a Causative Agent for Bacterial Leaf Blight Disease in Rice

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is a widespread pathogen causing bacterial leaf blight (BLB) disease, devastating rice productivity in many cultivated areas of Thailand. A specific and simple method for Xoo detection is required to improve surveillance of disease transmission and outbreak. This study developed a recombinase polymerase amplification (RPA) assay assisted with CRISPR-cas12a assay (RAC) for Xoo detection from bacterial cell suspension of infected rice samples without DNA extraction. The efficiency of the RAC system for Xoo detection using either Xoo80 or Xoo4009 locus was optimized to amplify and determine the sensitivity and specificity using a Xoo DNA template from bacterial cell suspension of infected rice samples without DNA extraction. The RAC system using the Xoo4009 locus gave a higher specificity than Xoo80 locus, because only Xoo species was amplified positive RPA product with fluorescence signal by cas12a digestion, which indicated no cross reactivity. Optimal RAC using the Xoo4009 locus enabled diagnosis of Xoo presence from both plant extracted samples of Xoo artificially inoculated rice leaves within 3 d post-inoculation without symptomatic BLB appearance, and Xoo naturally infected rice. Findings exhibited that RAC using the Xoo4009 locus offered sensitivity, specificity and simplicity for Xoo detection, with low intensities of Xoo-DNA (1 × 10³ copies/μL) and Xoo-cell (2.5 × 10³ cfu/mL). This developed RAC system showed significantly potential for Xoo detection at point-of-care application for early signs of BLB disease outbreak in rice fields.     

水稻抗白叶枯病微效QTL的定位分析

以不携有抗白叶枯病主效基因的中感籼粳双亲(窄叶青8号和京系17）及其花培DH群体为材料,接种白叶枯病菌浙9612后,考察了该DH群体的白叶枯病抗性,并进行了数量性状座位（QTL）分析。共检测到控制白叶枯病的4个QTL,分别位于第3、4、5和6染色体上,其中第3和第4染色体上的qBBR-3和qBBR-4,其加性效应为正值;而位于第5和第6染色体上的为负值,4个QTL的总效应是38.6%。方差分析和差异显著性比较表明,具有4个QTL抗性等位基因水稻株系的白叶枯病抗性与不含QTL抗性等位基因的株系相比,差异达极显著水平（P<0.01)。说明通过微效基因的聚合可以获得对白叶枯病的一定抗性。     

水稻白叶枯病菌hrcU基因缺失突变体构建及功能研究

 通过基因敲除方式,构建了水稻白叶枯病菌hrcU基因的缺失突变体。突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主植物上的过敏反应。携带hrcU基因的黏粒完全互补了hrcU突变菌株的表型,互补菌在水稻组织中的生长能力也与野生型菌株相当。免疫杂交结果显示,hrcU基因突变后,水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1不能从细胞内分泌到胞外。这些结果表明,水稻白叶枯病菌hrcU基因的主要功能是形成Ⅲ型分泌系统,将效应分子分泌到病原细菌胞外,从而决定了在非寄主上的过敏反应和在水稻上的致病性。