番木瓜干旱胁迫相关CpDHN基因的克隆与原核表达

本研究基于转录组获得的CpDHN转录本序列,以番木瓜‘台农二号’组培苗叶片为材料,采用RT-PCR技术克隆了该基因包含完整ORF在内的425 bp cDNA序列。序列分析表明,CpDHN预测编码93个氨基酸,其理论分子量为10.50 kDa、等电点为6.62、总平均疏水指数为-1.984、核定位。除保守的K片段外,蛋白还含有1个S片段,可归为KS型脱水素。在拟南芥中的10个脱水素中,CpDHN与AtLEA8的亲缘关系最近,相似性为53.3%。值得注意的是,虽然CpDHN的编码区不存在内含子,但其3°UTR含有1个与AtLEA8类似的内含子。表达谱分析显示,该基因在根和叶片中均受干旱胁迫诱导。此外,还构建了CpDHN的原核表达载体,SDS-PAGE分析显示,该蛋白在大肠杆菌中可高效表达。这些结果为下一步的功能鉴定奠定了坚实的基础。     

巴西橡胶树氰丙氨酸合成酶基因HbCAS的克隆与表达分析

氰丙氨酸合成酶（β-cyanoalanine synthase,β-CAS）是植物氰化物解毒的关键酶,在调节植物生长发育及逆境胁迫中扮演重要角色。本研究从巴西橡胶树中克隆氰丙氨酸合成酶基因HbCAS,并对其进行分析。结果表明：HbCAS基因开放阅读框长为1113 bp,编码370个氨基酸,其理论分子量为40.15 kDa,等电点为8.90,属于色氨酸合成酶超家族。实时荧光定量PCR分析结果显示,HbCAS基因在橡胶树各种组织中均有表达,其中在胶乳中的表达量最高。同健康树相比,HbCAS基因在死皮树中的表达显著下调。过氧化氢及乙烯利、茉莉酸甲酯、水杨酸及脱落酸等多种激素均能调控HbCAS基因的表达。同时,HbCAS基因的表达也受干旱、低温、甲基紫精、高盐等多种非生物胁迫调节。本研究结果揭示HbCAS基因可能在橡胶树死皮发生、活性氧信号、激素调节及多种非生物胁迫应答中起重要作用。     

桑树MaUBC-C基因的表达模式分析及原核表达

泛素结合酶E2（ubiquitin-conjugating enzyme, UBC）在植物中具有重要的作用，参与植物的生长发育、逆境胁迫、免疫响应等生理活动。本课题组前期通过分析桑脉带相关病毒（Mulberry vein banding-associated virus, MVBaV）侵染的桑树品种‘桂桑优62号’（Morus atropurpurea）转录组获得了上调表达的基因MaUBC-C。为探究泛素结合酶MaUBC-C基因的功能，本研究以‘桂桑优62号’桑树为材料，克隆MaUBC-C的CDS序列进行生物信息学和表达模式分析，并对其进行原核表达获得该蛋白。结果显示，MaUBC-C编码区全长为567 bp，编码蛋白含188个氨基酸，大小为21.03 kDa，属于亲水、酸性、不稳定的核定位蛋白，具有保守的UBC结构域。将其氨基酸序列与其他物种的UBC氨基酸序列进行比对和进化分析，发现MaUBC-C与川桑MnUBC-C的相似性最高为98.40%，且具有最近的进化亲缘关系。荧光定量PCR分析MaUBC-C基因表达模式，结果显示MaUBC-C在桑苗的根、茎、叶中均有表达，其中在根部表达量最高，分别是茎和叶的1.24倍和1.71倍；对外源激素（ABA、GA、MeJA、SA）和非生物胁迫（低温、高温、高盐、干旱）处理均产生响应，且在ABA和MeJA处理下表现出显著上调，在24 h时的表达量分别为正常水平的29.55、9.05倍，推测MaUBC-C在桑树的生长发育中具有广泛的调控作用，参与桑树的激素信号转导和对非生物胁迫的防御反应。利用无缝克隆技术构建MaUBC-C原核表达载体pET-30a-MaUBC-C并转化大肠杆菌BL21，0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下进行诱导，获得约为25 kDa的融合蛋白，与预期大小相符，为今后进行MaUBC-C基因功能研究提供了基础材料。本研究为进一步探究桑树泛素蛋白酶体途径的作用机制奠定了基础。     

甘薯黄烷酮3-羟化酶基因IbF3H的克隆和表达特性分析

黄烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase,F3H）是黄酮类化合物合成途径中的一个关键酶。本研究基于前期转录组数据,以‘福菜薯7-6’叶片为材料成功克隆CDS序列长度为1107 bp的基因IbF3H,利用生物信息学分析甘薯F3H基因的序列特征、氨基酸序列对比、蛋白系统进化树、蛋白的二、三级结构、预测其跨膜结构和亚细胞定位,并利用qRT-PCR分析盐旱胁迫处理下基因的表达特性。结果表明,该基因含有3个外显子和2个内含子,编码368个氨基酸,蛋白分子量为41.12 kDa,等电点为5.83。存在多种类型的启动子顺式作用元件,如光响应元件G-Box、ACE,干旱胁迫相关的MBS元件,与脱落酸激素响应相关的ABRE元件等。与其他植物的氨基酸序列相似性达到了80%以上,可见IbF3H的编码区高度保守,且黄烷酮3-羟化酶在进化上具有较高的保守性。IbF3H蛋白含有非血红素双加氧酶结构域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能结构域（2OG-FeⅡ-Oxy加氧酶结构域）,属于双加氧酶超家族。IbF3H蛋白可能在细胞质中表达并且不具备跨膜结构。qRT-PCR研究结果表明,IbF3H基因并非组织特异性表达的基因,叶和茎表达量高于茎尖和根。模拟盐胁迫处理后,IbF3H基因表达量呈现先下降后上升的趋势;模拟干旱胁迫处理后,IbF3H基因表达量始终高于对照组,以响应逆境胁迫。本研究可为下一步探索IbF3H基因在调控甘薯类黄酮生物合成途径和功能作用奠定基础。     

澳洲坚果MiSTPP3和MiSTPP7基因克隆与表达分析

以澳洲坚果品种‘O.C.’为试材,利用RT-PCR技术克隆获得2个丝氨酸/苏氨酸磷酸酶基因,分别命名为MiSTPP3和MiSTPP7,其编码序列长度分别为2095 bp和1700 bp。序列分析和系统进化分析表明,MiSTPP3含有MPP_PP5_C结构域,属于PP5亚家族;MiSTPP7含有MPP_PP7结构域,属于PP7亚家族。蛋白理化性质和亚细胞定位分析表明,MiSTPP3是一个稳定的亲水性蛋白,可能定位于质膜;MiSTPP7是一个不稳定的亲水性蛋白,可能定位于线粒体基质。生物信息学分析表明,MiSTPP3和MiSTPP7都是非分泌跨膜蛋白,其二级和三级结构的主要元件都是α螺旋、无规则卷曲和延伸链。RT-qPCR分析表明,MiSTPP3和MiSTPP7在澳洲坚果根、茎、叶、花和小果中都有不同的表达量;MiSTPP3受低温胁迫下调表达,而MiSTPP7上调表达,且二者都受干旱胁迫上调表达。因此,推测MiSTPP3和MiSTPP7可能参与澳洲坚果的生长发育及逆境胁迫反应。     

陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列分析

为了筛选棉花抗逆转基因育种的候选启动子，根据陆地棉脱水素基因GhDHN1的cDNA序列和陆地棉基因组序列，利用生物信息学分析方法，获得棉花陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列。结果表明，该启动子上多个位点含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box，并含有非生物逆境胁迫响应元件、响应植物激素顺式作用元件、多种光调控相关的顺式作用元件以及胚乳表达顺式调控元件等。推测GhDHN1基因的启动子受光诱导，同时受低温和干旱胁迫等非生物逆境的诱导，参与棉花的生长发育。     

甘蔗MYB转录因子基因ScMYB52-1的克隆及表达特性分析

MYB转录因子家族成员广泛参与植物的各种生物学过程,在调控植物适应非生物逆境过程中起关键作用。为分离甘蔗（Saccharum spp.）逆境响应MYB基因并研究其功能,本文应用3°RACE的方法,从甘蔗品种ROC22中克隆到一个R2R3-MYB转录因子基因,命名为ScMYB52-1。生物信息学分析表明,该基因cDNA序列长度为1072 bp,开放阅读框（ORF）长度为696 bp,5°非翻译区长54 bp,3°非翻译区长322 bp。该ORF编码231个氨基酸,推导蛋白的分子量为26.65 kDa,含有2个串联的MYB结构域。ScMYB52-1推导蛋白与模式植物拟南芥中的MYB家族蛋白的进化树聚类分析结果表明,ScMYB52-1蛋白与AtMYB52和AtMYB54的亲缘关系较近;进一步的多序列比对分析结果表明,上述三者蛋白质N端的MYB结构域序列高度一致,且三者的预测蛋白质三级结构类似,表明它们可能具有类似的功能。实时荧光定量PCR结果显示,ScMYB52-1在甘蔗组培苗的根中对PEG处理总体上不敏感,在叶中仅在3 h时短暂上调;ScMYB52-1在叶中受外源ABA和NaCl胁迫的诱导,在处理0.5 h均迅速上调表达,表达量分别为对照的3.35倍和2.75倍,并在处理期维持高于对照的水平;在根中受外源ABA和NaCl胁迫的抑制,在处理0.5 h时就开始下调表达,在处理24 h时表达量分别下调为对照的12%和40%,并在处理周期内总体上维持低于对照的水平。亚细胞定位分析表明,ScMYB52-1-GFP重组蛋白定位在烟草叶肉细胞的细胞核中。酵母双杂交自激活活性鉴定结果表明,ScMYB52-1蛋白无自激活活性。以上结果表明ScMYB52-1参与了甘蔗对高盐胁迫的应答,并可能受ABA信号通路的调控,在叶和根中存在差异的调控机制。本研究结果为进一步理解该基因在甘蔗非生物逆境适应过程中的功能及分子调控机制提供了初步的信息。     

红海榄脱水素基因(RsDHN1)的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术对已获得的红海榄根部其中一个差异表达基因进行克隆,通过Blast分析和序列比对可知,该基因全长cDNA序列包括146bp的5'端非编码区,43bp的3'端非编码区和一个编码241个氨基酸的开放阅读框,命名为RsDHN1基因。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有43%～55%的氨基酸序列同源性。半定量RT-PCR分析表明,盐胁迫对RsDHN1基因的表达有明显上调作用。     

褐飞虱小分子量热激蛋白基因表达特性和功能

【目的】研究褐飞虱小分子量热激蛋白的表达特性和功能,明确其在褐飞虱温度胁迫适应中的作用。【方法】采用BLAST从转录组数据库中筛选褐飞虱小分子量热激蛋白基因序列;利用Bioedit、Mega等分子生物学软件进行序列分析;利用qPCR技术分析目的基因在不同处理下的表达特性;利用原核表达技术研究其功能。【结果】筛选到6个含有α-晶体结构的小分子量热激蛋白基因NlHsp20.9、NlHsp21.6、NlHsp21.9、NlHsp22.4、NlHsp23.1、NlHsp28.7,其ORF长度依次为561、531、570、570、588和735 bp,理论等电点为5.96、5.77、6.32、5.01、5.74和7.74。NlHsp28.7在3龄若虫中的表达量最高,而NlHsp21.9和NlHsp23.1在雌成虫中的表达量最高。雌虫在低温胁迫后所有小分量热激蛋白基因的表达量均下降,高温胁迫后除NlHsp22.4外的其他5个基因表达量不同程度上调;3龄若虫在低温胁迫后一半sHsps表达量下降,另一半上升,高温胁迫后全部上调。转化褐飞虱sHsps的重组大肠杆菌热激存活率显著上升。【结论】褐飞虱小分子量热激蛋白具有龄期和诱导表达特性及热胁迫保护功能,可能在其高温胁迫应激中具有重要作用,在低温胁迫应激中的作用与虫态有关。     

A β-ketoacyl-CoA Synthase OsCUT1 Confers Increased Drought Tolerance in Rice

Drought stress is one of the major environmental factors affecting crop growth and productivity. Cuticular wax plays essential roles in protecting plants from environmental stress via forming a hydrophobic barrier on leaf epidermis. In this study, we analyzed nine members (OsCUT1?OsCUT9) of β-ketoacyl-CoA synthase, the rate-limiting key enzyme for cuticular wax synthesis in rice by homology search and domain prediction. The expression levels of OsCUT genes under different abiotic stresses were investigated and OsCUT1 down-regulated by abiotic stress was selected for further function validation. Compared to the wild type, overexpression of OsCUT1 (OX-OsCUT1) exhibited significantly increased drought resistance. Epicuticular wax was increased on the leaf surface of OX-OsCUT1 and the chlorophyll leaching experiment showed that the cuticular permeability was decreased in the OX-OsCUT1 plants. Moreover, overexpression of OsCUT1 didn’t result in the significant changes of major agronomic traits. In total, these results suggested that OsCUT1 is a promising gene for engineering rice plants with enhanced drought tolerance.     

番木瓜镁离子转运蛋白基因CpMGT1的克隆与功能分析

镁是一种大量金属营养元素,其在植物的生长、发育、光合、胁迫响应等生物学过程中起重要作用。在高等植物中,Mg²⁺的吸收、运输、分布和再分配主要由镁离子转运蛋白（MGT/MRS2）和Mg²⁺/H⁺交换体（MHX）介导。其中,MGT/MRS2又名CorA,最先在鼠伤寒沙门氏菌中被发现,后在拟南芥、水稻等模式植物中进行了较为深入的研究。番木瓜（Carica papaya L.）是一种隶属于十字花目番木瓜科的重要热带果树,至今还未见有关MGT基因的报道。本研究基于番木瓜的基因组和转录组数据,采用RT-PCR技术成功克隆到一个MGT基因（CpMGT1）,应用生物信息学手段预测蛋白的理化特性和保守基序,运用qRT-PCR分析基因的表达模式,利用缺失CorA、MgtA和MgtB的沙门氏菌突变株MM281进行功能互补。结果表明：CpMGT1的编码区为1332 bp,预测编码443 aa,理论分子量为50.43 kDa、等电点为5.12;该蛋白含有2个疏水跨膜区（TM1和TM2）,其中TM1包含高度保守的GMN基序;进化及亚细胞定位分析表明CpMGT1与拟南芥中AtMGT1和AtMGT2的亲缘关系较近,定位于细胞膜;定量分析显示CpMGT1基因为组成型表达,其中在根、茎和果实中的表达量较高;在MM281中异源表达可显著提高工程菌在低Mg²⁺浓度下的生长速率,表明CpMGT1具有高效的Mg²⁺转运活性。CpMGT1的克隆与鉴定为进一步揭示番木瓜MGT基因在不同组织特别是在果实中Mg²⁺的积累机制奠定了坚实的基础。     

薏苡bZIP基因家族全基因组鉴定与非生物胁迫表达分析

薏苡是传统药食兼用经济作物,具有极高的营养价值和重要的药用价值,越来越受人们重视。转录因子是一类能够与调控基因的顺式作用元件或者功能基因特异性结合的重要调控蛋白质分子,在植物的许多生物学活动过程中起着重要的调控作用。碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子家族在调控植物的生长发育及响应生物与非生物胁迫中起着重要作用。本研究利用北京薏苡（2n=20）基因组信息鉴定出83个bZIP基因家族成员,命名为ClbZIP1~ClbZIP83,2个bZIP基因（Cl042706和Cl042496）不能最终定位到任何连锁群。通过生物信息学方法,分析了基因结构、理化性质、染色体分布,研究了其与其他物种的系统进化关系,并利用转录组技术研究了家族成员在栽培种兴仁小白壳苗期响应非生物胁迫的基因表达规律。结果表明：薏苡全基因组中bZIP成员分别编码氨基酸97~1008个,最小的是ClbZIP5（97个氨基酸）,而最大的是ClbZIP28（1008个氨基酸）;蛋白质分子量在11.33~110.03 kDa之间,pI在4.15（ClbZIP44）到12.33（ClbZIP50）之间;将其划分为A~I、K、S等11个亚组,不均匀地分布于基因组的10条染色体上;除了广泛分布的bZIP结构域的motif 1或motif 2外,每一类都具有相似基因结构与基序;然而,不同成员间存在外显子数目差异,最多为15个外显子（ClbZIP15）,最少为0个;干旱、高温、干旱和高温胁迫条件下,83个ClbZIP家族基因在干旱和高温胁迫后表达量的发生明显的变化,这说明这些基因可能在干旱和高温中的调控作用存在着不同。上述结果为更深入研究薏苡bZIP家族基因的生物学功能奠定基础及其在调控薏苡生长发育与响应生物与非生物胁迫机制提供参考。     

西番莲水通道蛋白PePIP2基因克隆及表达分析

西番莲作为新兴的热带果树，在热带农业中具有非常重要的作用，然而干旱、高温等非生物胁迫严重影响其正常生长发育。相关研究表明水通道蛋白(AQP)能够提高植物的抗逆性，本研究以西番莲‘台农’(Passiflora edulia Sims)为实验材料，利用西番莲的基因组数据，通过同源克隆法从西番莲中克隆得到了一个水通道蛋白基因PePIP2，其开放阅读框(open reading frame,ORF)为861 bp，编码286个氨基酸。对其进行生物信息学分析，其分子式为C₁₄₁₇H₂₁₅₆N₃₆₀O₃₇₃S₈，预测分子量为30 459.37 Da，等电点为8.84，亚细胞定位于细胞膜上。启动子区域分析显示其含有参与胁迫应答的顺式作用元件。对其进行干旱、高盐、低温、高温胁迫下的表达分析，结果表明：PePIP2能够受到干旱、高温和低温胁迫的诱导表达，其中在土壤含水量为50%，在45℃高温处理4 h和0℃低温处理48 h，其表达量最高。在烟草中进行瞬时表达，在不同时间的干旱胁迫处理下，PePI...     

柱花草苯丙氨酸解氨酶（SgPALs）对生物胁迫与非生物胁迫的响应

本研究以热研2号柱花草为材料,分析其苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、总酚含量、类黄酮含量、总抗氧化能力和SgPALs基因表达模式对生物胁迫（炭疽菌侵染）与非生物胁迫（干旱和盐胁迫）的响应。结果表明,在3种胁迫处理下,柱花草不同组织部位的PAL活性增加18.58%~123.56%,且叶片的总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力分别增加65.11%~68.00%、51.00%~76.87%和83.00%~262.08%,差异显著。在干旱和盐胁迫处理下,根系的总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力也显著提高43.77%~51.12%、45.46%~45.98%和60.45%~97.89%。随后对SgPALs的表达模式分析表明,除SgPAL4外,其他3个SgPALs受炭疽菌侵染诱导上调表达;在干旱胁迫下,根系中4个SgPALs均增强表达,但叶片中仅SgPAL1和SgPAL4上调表达;在盐胁迫下,根系中4个SgPALs也都上调表达,叶片中除SgPAL3下调表达外,其他3个SgPALs增强表达。综上所述,在遭受生物胁迫和非生物胁迫时,柱花草中的SgPALs基因表达及PAL酶活性升高,伴随着总酚与类黄酮含量的同步升高,表明其对环境胁迫的抗性升高。