大豆脂肪酸Fad3a基因HRM检测体系优化研究

高分辨率熔解曲线分析法可准确检测单核苷酸多态性,具有稳定性和高效性的特点.建立基于HRM的SNP检测方法,确立最佳的反应体系和反应条件是后续基因分型研究的前提和基础.Fad3a基因为大豆脂肪酸合成的关键酶基因,以Fad3a基因为研究对象,通过测序获得大豆品种合丰25(亚麻酸含量5.94％)和L-5(亚麻酸含量2.75％)在Fad3a基因序列上的单核苷酸多态性位点,根据这2个品种的Fad3a基因测序结果,利用Lighter scanner primer design软件设计产物长度不同的SNP突变引物5对,探索PCR产物长度和不同的退火温度对HRM分型结果的影响.结果表明:HRM分型的扩增子适宜长度应小于150 bp,且在扩增成功的基础上使用相对较高的退火温度可使待测PCR产物熔解峰单一,熔解曲线平稳.     

大豆小片段法HRM基因分型体系优化

应用高分辨率熔解曲线(high resolution melting curve,HRM)技术进行基因分型简单有效,灵敏度高、特异性强。优化并建立基于HRM的大豆SNP基因分型体系,是准确进行SNP研究的前提和基础。本研究利用添加内标后的小片段法进行SNP基因分型体系优化研究,结果表明在设计SNP引物时,最好使其PCR产物长度为50~80bp,熔解温度在72~82℃,Tm值介于55~62℃之间;10μL PCR反应体系中应包含25ng DNA模板,0.6pmol SNP引物,1μL LC Green染料;PCR反应后,应在各点样孔分别加入3pmol的高、低温内标,然后进行变性处理和HRM分析。同时利用建立的基因分型体系对重组自交系群体(RIL)进行了基因分型检测,能完全将其分成亲本的两种基因型,提高了SNP基因分型的准确性和效率。本研究建立的SNP基因分型体系为今后进行大豆SNP标记开发、高密度遗传图谱构建、QTL定位等研究提供了基础。     

基于近红外光谱大豆蛋白质、脂肪快速无损检测模型的优化构建

为实现大豆蛋白质、脂肪含量的快速无损检测,采集350～2 500 nm光谱范围内的大豆近红外光谱。运用经典Kennard-Stone算法选取建模样本及验证样本,对近红外原始光谱进行卷积平滑(savitzky and golay, SG)+一阶微分、变量标准化(standard normal variate, SNV)+去趋势算法(de-trending,DT)、正交信号校正(orthogonal signal correction,OSC)处理;然后通过竞争性自适应重加权采样方法(competitive adaptive reweighted sampling,CARS)筛选出特征波长,比较偏最小二乘法(partial least squares,PLS)、BP神经网络法所建模型,最终获得对于大豆蛋白质、脂肪含量的快速、无损检测的最佳模型。结果表明:(1)经CARS特征波段挑选后,波长的变量个数由1 981个减少为100个以下,变量压缩率大于94.95%;(2)CARS波段选择能够提高建模精度,基于挑选的特征波段所建立模型的决定系数均0.9;(3)OSC+CARS+PLS与OSC+CARS+BP该类数据处理组合方式在一定程度上能够实现大豆蛋白质、脂肪的快速、无损检测。优化构建的该模型能够精准快速无损的检测大豆蛋白质、脂肪含量,对大豆品质评估以及作物改良具有重要意义。     

基于分段主成分分析和高光谱技术的大豆品种识别

为了实现大豆品种的快速且无损鉴别,对大豆高光谱图像中的光谱信息进行研究分析。利用高光谱图像采集系统采集波长范围为400~1 000 nm的6类共660粒大豆样本的高光谱图像,从每粒大豆样本的中心区域上提取感兴趣区域并以此区域的平均光谱信息代表此粒大豆的光谱信息。对光谱曲线进行多元散射校正(multiple scattering correction,MSC)后,根据相关系数矩阵图,将整个高光谱波段分解为3个子分段,分别在每个子分段上做主成分分析(principal component analysis,PCA),提取1~20个主成分作为光谱特征,利用极限学习机(extreme learning machine,ELM)和随机森林(random forests,RF)模型进行大豆品种识别。结果表明:在第二分段(510.6~685.4 nm)进行PCA变换,识别效果优于全波段PCA变换。因此,应用分段PCA变换和高光谱技术对大豆品种进行无损识别是可行的。     

基于小波矩的大豆外观品质特征提取方法的研究

应用机器视觉技术对大豆的外观品质进行检测成为近年来的研究热点,大豆的外观特征提取是检测的重要内容之一。为提高大豆样本的识别率,减少噪声对特征提取造成的污染,提出了一种基于小波矩的大豆外观品质特征提取方法。该方法对大豆样本图像进行基于小波变换的不变矩特征提取,有效地解决了由于大豆本身存在的大小不同、移动等造成的特征不明的问题。试验证明:此方法不仅能够精确地描述大豆外观品质特征而且对噪声不敏感,此方法识别精度高,正确识别率达到99%。     

大豆球蛋白直接ELISA检测方法的建立与初步应用

以大豆球蛋白特异性多克隆抗体为一抗,辣根过氧化酶标记抗兔IgG(HPR)为酶标二抗,TMB为底物,建立一种检测大豆球蛋白直接ELISA方法。应用该方法对在吉林省部分地区收集的25个样本进行初步检测,并与竞争ELISA方法进行对比,每个样品进行6个重复,结果显示,约64%的样本使用直接ELISA法的蛋白检出显著高于竞争ELISA法,且标准差的符合率达到72%以上。本试验建立的直接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,适于食品及饲料行业中过敏蛋白的批量检测。     

微波和超声两种技术提取大豆低聚糖的效果

以大豆品种合丰23为材料,用高效液相色谱(HPLC)检测微波和超声两种技术提取的大豆低聚糖(水苏糖、绵子糖和蔗糖)的效果,旨在筛选和建立大豆低聚糖的最佳检测方法,为大豆低聚糖的含量检测提供依据.用水苏糖、绵子糖和蔗糖的标准品对12种流动相和3种检测温度进行比较分析,筛选出高效液相色谱(HPLC)的最佳检测条件(乙腈:水=60:40,温度35℃).微波法提取大豆低聚糖,采用正交试验,选取4因素3水平按正交表L9(34)进行试验,结果表明:佳提取条件为70%乙醇溶液,1:10溶解,高火,2 min.超声法提取大豆低聚糖,选取4因素4水平按正交表L16(44)进行试验,选出最佳条件,在此基础上选择4个料液比例进行单因素试验,结果表明:超声法的最佳提取条件为75%乙醇溶液,1:10溶解,40 KHz,60℃,超声1.5 h.在最佳提取条件下,微波技术和超声技术提取低聚糖的总糖浓度分别为11.48%和7.70%,表明微波技术比超声技术提取大豆低聚糖的效率高、效果好,且节省有机溶剂、方法简单.建立了基于微波提取的HPLC法对大豆低聚糖含量的高效检测方法,为开展大豆种质资源筛选和大豆育种提供了技术支撑.     

快速滤过型净化法应用于气相色谱—串联质谱检测大豆中农药残留

为研究快速滤过型净化法(m-PFC)对大豆基质中14种常见农药残留气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)同时检测的适用性，本研究选取两种快速滤过型净化柱(m-PFC柱)作为净化手段，利用气相色谱-串联质谱进行检测分析，以外标法作为定性定量依据对14种农药进行测定，通过对基质效应、净化效果、回收率、多次滤过效果等方面进行评价。结果显示：多数农药在大豆基质中的基质效应影响无法忽略，14种农药在0.005～0.5 mg·mL^-1范围内线性关系良好，回收率为85%～110%,RSD为4.3%～10.2%,m-PFC柱2(150 mg无水硫酸镁，25 mg MWCNTs, 25 mg C₁₈,25 mg PSA)的净化效果更好，两次滤过次数的净化效果、检测准确度、重复性更佳。本方法可对大豆中14种农药进行快速测定，操作简单，效率高，亦具备一定的普适性，可以作为大豆中其他农药残留检测的参考方法。     

基质分散萃取-高效液相色谱分析大豆植株、籽粒及豆田土壤中咪唑乙烟酸残留

对确立的以甲醇为分散萃取溶剂,乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷键合相(C18)和石墨化碳黑(GCB)为基质分散材料的大豆植株、籽粒及豆田土壤咪唑乙烟酸残留基质分散萃取前处理方法,进行了乙腈等度洗脱的高效液相色谱(HPLC)残留样品外标定量方法条件的优化。结果表明:优化色谱条件下,咪唑乙烟酸的色谱保留时间为6.97 min,在0.01~10.0 mg·L-1质量分数范围内与对应色谱峰积分面积线性响应良好,回归方程为y=4.003 8 x-0.275 6(R2=0.999 5),回收率均在85%以上,相对标准偏差均小于9%;该色谱条件下仪器检出限为0.104 ng,方法的最低检测浓度分别为0.024(植株),0.033(籽粒)和0.026 mg·kg-1(豆田土壤),表明该残留样本前处理方法和样品检测方法简便、高效、经济、可靠,可满足咪唑乙烟在大豆植株、大豆籽粒及豆田土壤中残留定量检测要求。     

大豆对土壤水淹的响应及与土传植物病原真菌的关系

<正>选择被认为对水淹有较好抗性的6个大豆基因型品种,检测其在洪水灾害下土传真菌对大豆的作用。试验在1996年到1998年进行,6个基因型大豆进行垄上单行种植,设置不同水淹处理,分别为无水淹、出苗时水淹(持续3 d)和第四个叶节期水淹(持续7 d)。在水淹处理3~4 d后,统计出苗率,并在每个小区采集15株大豆样本,进行称重,并调查根部褪色比率,分离鉴定根上真菌及其他丝状微生物。试验结果显示,与无淹水相比在     

抗SCN位点rhg1与Rhg4在种质资源中的单倍型分析及分子标记开发

rhg1和Rhg4是抗大豆胞囊线虫病种质所具有的主要的抗性基因,利用与rhg1和Rhg4位点紧密连锁的SSR标记和SNP标记对15份抗感病大豆种质进行基因分型。结果表明:rhg1位点连锁SSR标记Satt309对抗病种质的检出率为55.56%,Rhg4位点连锁SSR标记Sat_162对抗病种质的检出率为66.67%;rhg1位点序列引物PCR产物630bp位置存在腺嘌呤与胞嘧啶(A/C)突变,感病等位为A碱基,抗病等位为C碱基,在Rhg4位点标记引物SHMT的PCR产物上2 749 bp位置存在胞嘧啶和鸟嘌呤(C/G)突变,感病等位为C碱基,抗病等位为G碱基。rhg1和Rhg4位点内SNP对抗病种质的检出率分别为77.78%和100%。利用高分辨率溶解曲线法设计rhg1和Rhg4位点SNP标记,在扫描温度为65℃起始,60℃保持,94℃终止时可得到理想的分型结果。     

蔗糖合成酶(SUS)基因的SNP标记开发及其与淀粉性状的关联分析

通过直接测序法获得玉米亲本(H21和紫糯96-619)sus1基因全长序列并进行亲本间序列比对,得到120个SNP位点,通过高分辨率熔解曲线(HRM)对300个近等基因系H21 BC5F2:3进行SNP位点分型,并将后代的基因型与群体的直链淀粉含量和淀粉糊化特性进行关联分析。结果表明,marker 31与直链淀粉含量和淀粉崩解值、峰值时间、糊化特性均连锁紧密;marker 17与直链淀粉含量和淀粉的峰值时间、淀粉最终黏度均连锁紧密;marker12与直链淀粉含量、淀粉的峰值时间连锁紧密。     

小麦粒重基因TaGW2-6A等位变异的高通量分子检测

为了开发出一种高通量的TaGW2-6A基因等位变异分子检测技术,利用高分辨率熔解曲线分析技术(High resolution melting curve analysis,HRM)检测了316份小麦材料的TaGW2-6A基因编码区T碱基插入等位变异以及启动子区Hap-6A-A(-593A和-739G)和Hap-6A-G(-593G和-739A)等位变异,同时利用桑格测序和Hap-6A-P1/P2分子标记验证HRM的分析结果。结果表明,HRM技术能够准确、高效的检测TaGW2-6A基因的等位变异。在316份材料中,检测到61份T碱基插入等位变异材料(命名为TT基因型)和255份无T碱基插入的等位变异材料(命名为tt基因型);其中,189份为Hap-6A-A单倍型材料,127份为Hap-6A-G单倍型材料。     

基于全基因组SNP高效鉴定燕麦种质资源

为探究鉴别燕麦品种特异性所需SNP标记的最少数量与鉴别效果,以25个生产上大面积推广的栽培燕麦品种为材料,利用燕麦Illumina Inc.iSelect 6K微珠芯片进行基因分型,按照具有多态性、最小等位基因频率（MAF）大于0.05、缺失率小于0.50的条件进行筛选,获得2 214个高质量的SNP标记。所有SNP标记的平均MAF为0.75,平均多态性信息含量（PIC）为0.28。群体遗传结构分析将25个燕麦品种划分为5个类群。通过去冗余分析,获得8个能够高效鉴别燕麦参试品种的SNP标记。这8个SNP标记的平均MAF为0.62,平均PIC为0.35,表现出丰富的遗传多样性。测序结果显示,所筛选的8个SNP标记具有较好的稳定性和重现性。进一步利用这8个SNP标记构建了25个燕麦栽培品种的SNP指纹图谱,为燕麦栽培品种真实性鉴定和纯度检测提供了可用的标记组合。     

一种大豆SNP分型新方法

单核苷酸多态性(SNP)在大豆基因组中分布广泛,SNP分型是大豆SNP遗传作图,关联分析、分子标记辅助选择等研究的重要技术.本文以Rhg4基因开发的5个SNP为例,介绍了一种大豆SNP分型的新方法-片段长度差异等位基因特异性PCR(FLDAS-PCR).采用AS-PCR原理,针对某个SNP位点设计2条相差4-5bp的特异引物和1个公用引物,PCR产物约100bp或150bp,2种等位基因型PCR产物相差4-5bp,在2个特异引物3'端第3和4碱基位置分别人为引入错配碱基来提高PCR特异性,通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可将纯合和杂合基因型检测出来.探讨了特异引物浓度和退火温度对Rhg4-1592扩增效果的影响,研究表明,可通过调整特异引物浓度和退火温度优化扩增效果.FLDAS-PCR对18份种质分型结果与PCR产物克隆测序法一致,表明本研究建立的FLDAS-PCR法是一种简便、快捷、新型的大豆SNP分型方法.     

Large-scale deployment of a rice 6 K SNP array for genetics and breeding applications

Background

Fixed arrays of single nucleotide polymorphism (SNP) markers have advantages over reduced representation sequencing in their ease of data analysis, consistently higher call rates, and rapid turnaround times. A 6 K SNP array represents a cost-benefit “sweet spot” for routine genetics and breeding applications in rice. Selection of informative SNPs across species and subpopulations during chip design is essential to obtain useful polymorphism rates for target germplasm groups. This paper summarizes results from large-scale deployment of an Illumina 6 K SNP array for rice.

Results

Design of the Illumina Infinium 6 K SNP chip for rice, referred to as the Cornell_6K_Array_Infinium_Rice (C6AIR), includes 4429 SNPs from re-sequencing data and 1571 SNP markers from previous BeadXpress 384-SNP sets, selected based on polymorphism rate and allele frequency within and between target germplasm groups. Of the 6000 attempted bead types, 5274 passed Illumina’s production quality control. The C6AIR was widely deployed at the International Rice Research Institute (IRRI) for genetic diversity analysis, QTL mapping, and tracking introgressions and was intensively used at Cornell University for QTL analysis and developing libraries of interspecific chromosome segment substitution lines (CSSLs) between O. sativa and diverse accessions of O. rufipogon or O. meridionalis. Collectively, the array was used to genotype over 40,000 rice samples. A set of 4606 SNP markers was used to provide high quality data for O. sativa germplasm, while a slightly expanded set of 4940 SNPs was used for O. sativa X O. rufipogon populations. Biparental polymorphism rates were generally between 1900 and 2500 well-distributed SNP markers for indica x japonica or interspecific populations and between 1300 and 1500 markers for crosses within indica, while polymorphism rates were lower for pairwise crosses within U.S. tropical japonica germplasm. Recently, a second-generation array containing ~7000 SNP markers, referred to as the C7AIR, was designed by removing poor-performing SNPs from the C6AIR and adding markers selected to increase the utility of the array for elite tropical japonica material.

Conclusions

The C6AIR has been successfully used to generate rapid and high-quality genotype data for diverse genetics and breeding applications in rice, and provides the basis for an optimized design in the C7AIR.

     

水稻稻瘟病抗性基因Pi ta的SNP检测方法

 针对稻瘟病抗性基因Pi ta位点上的抗感基因的编码产物仅有1个氨基酸的差异,利用已经建立的检测该基因的SNP方法以及作者在该基因编码序列构建的四引物扩增受阻突变体系PCR,对62份2012年长江上游国家水稻区域试验材料和97份陕西省水稻区域试验材料进行了Pi ta基因检测,2种分子标记检测结果一致。该方法的检测结果真实可靠,可以用于检测水稻Pi ta基因位点。     

单核苷酸多态性检测方法研究概述及其应用

单核苷酸多态性(SNP)作为第3代分子标记有着广阔的应用前景。本文从单核苷酸多态性(SNP)的概念、分类、特点、检测技术等方面进行了概述,论述了单核苷酸多态性在高密度遗传图谱构建、性状作图、病害关联性分析、标记辅助育种等方面的应用,为单核苷酸多态性的研究提供理论依据。     

茶氨酸合成酶基因的SNP挖掘和遗传定位

茶氨酸合成酶(Theanine synthetase,TS)基因是茶树茶氨酸代谢过程中的关键酶基因。本研究以氨基酸含量差异明显的亲本及其杂交所得F_1子代为研究材料,克隆TS基因的c DNA序列,挖掘其SNPs位点,并成功将杂合SNP位点定位在遗传连锁群上。研究结果显示,通过序列比对在亲本间检测到3个SNPs,验证得到1个杂合的位点SNP735。将此位点成功转化为dCAPS标记,该标记在子代中的基因型分离比为1∶1,利用该群体已构建的茶树遗传图谱进行遗传定位,将dCAPS标记定位在连锁群LG03上,相邻标记为TM299和TM517。联合此标记及其相邻标记与游离氨基酸总含量和茶氨酸含量进行统计分析,表明具有显著的相关性。     

Development of new markers to genotype the functional SNPs of SSIIa, a gene responsible for gelatinization temperature of rice starch

Gelatinization temperature (GT) is an important quality predictor that determines the cooking quality of rice. GT is genetically controlled by the starch synthase IIa (SSIIa) gene. Two functional single nucleotide polymorphisms (SNPs) inside the SSIIa have already been found to be responsible for the variation of GT. One of these, GC/TT SNP at 4329/4330 bp, could be genotyped by four primers in a single PCR ( Bao et al., 2006a), but another one, G/A SNP at 4198 bp, has not been detected by a PCR-based marker. Here, we developed cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) and derived cleaved amplified polymorphic sequence (dCAPS) markers to detect these SNPs. A dCAPS marker that the PCR products were cleaved by the BseR I restriction endonuclease was designed to detect GC/TT SNP. Both CAPS and dCAPS markers were designed to detect G/A SNP using the restriction endonuclease Nla III and Tsp45 I, respectively. All the markers developed were co-dominant. It was known that the A allele of G/A SNP was rare among rice germplasm, but it was still in use by rice breeders. 11 rice accessions including landrace and breeding lines with A allele of G/A SNP were detected. The F₂ individuals from two crosses were used to analyze the co-segregation between the SNP alleles and the GT. The segregation ratio of two SNPs did not conform to the expected Mendelian ratio of 1:2:1, but the SNPs were co-segregated with GT. The markers developed in the present study would be useful in molecular breeding for the improvement of the quality of rice grain.