小麦TaHTAS-5A基因的克隆、表达分析及亚细胞定位

非生物胁迫对小麦的生长发育具有不良影响,克隆与非生物胁迫相关的基因,并对其结构及表达特性进行分析,可以为进一步探索小麦的抗逆机制和抗逆育种奠定基础。本研究利用同源克隆技术从普通小麦品种中国春中克隆了水稻E3泛素连接酶基因OsHTAS的同源基因TaHTAS-5A(GeneBank登录号:MF967573),并利用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用qRT-PCR技术对该基因在小麦不同组织及不同逆境胁迫下的表达模式进行分析;同时,对该基因的表达产物进行了亚细胞定位。结果表明,小麦TaHTAS-5A基因含有220bp的5′UTR、1 242bp的ORF以及126bp的3′UTR,共编码413个氨基酸;基因组分析表明,该基因全长3 819bp,共包含4个外显子和3个内含子;缺体-四体定位表明该基因位于小麦5A染色体上;蛋白结构分析显示,TaHTAS-5A蛋白的N端包含四个跨膜结构域,C端包含一个E3泛素连接酶特有的RING finger保守结构域,具有植物E3泛素连接酶的结构特征;qRT-PCR结果显示,TaHTAS-5A对高温、低温和ABA都有响应,对干旱和盐响应不敏感;TaHTAS-5A在小麦的根、茎、叶和幼穗等不同组织中均有表达,但表达量有差异,在叶和穗中的表达量明显高于根部和茎部;亚细胞定位结果表明,TaHTAS-5A位于细胞膜上。本研究为进一步探究小麦TaHTAS-5A基因的功能奠定了基础,也为小麦非生物胁迫抗性改良提供了一定的理论依据。     

小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定

以中国春小麦叶、茎、幼穗及花后3、6、9、12、15、20、25 d的籽粒为材料,利用Gateway技术构建中国春小麦cDNA初级文库和次级文库,由次级文库质粒转化Y187酵母菌株构建出酵母双杂交文库。通过mating法筛选小麦粒质量基因TaDAR1的互作蛋白,以此来鉴定文库的有效性。结果表明：初级文库容量为1.82×10⁷ CFU/mL、次级文库的容量为1.91×10⁷ CFU/mL,文库重组率均大于 96%,插入片段平均长度在 1 000 bp 以上。酵母双杂交文库转化效率为1.97×10 CFU/μg,文库容量为2.04×10⁷ CFU/mL。构建诱饵载体pGBKT7-TaDAR1并转化Y2H酵母菌株,经检验存在自激活现象,进一步截断检测发现此蛋白N端无自激活,C端有自激活,以BD-TaDAR1-N为诱饵载体,筛选酵母文库,获得其互作蛋白序列,并命名为TaDAR1IP,经回转验证TaDAR1-N与TaDAR1IP存在相互作用关系。表明本试验方案构建的酵母文库是高质量的有效的。为初学者构建酵母双杂文库及使用“mating”法筛选酵母文库提供借鉴,也为后续小麦基因功能的研究奠定基础。     

小麦粒重基因TaGW2-6A等位变异的高通量分子检测

为了开发出一种高通量的TaGW2-6A基因等位变异分子检测技术,利用高分辨率熔解曲线分析技术(High resolution melting curve analysis,HRM)检测了316份小麦材料的TaGW2-6A基因编码区T碱基插入等位变异以及启动子区Hap-6A-A(-593A和-739G)和Hap-6A-G(-593G和-739A)等位变异,同时利用桑格测序和Hap-6A-P1/P2分子标记验证HRM的分析结果。结果表明,HRM技术能够准确、高效的检测TaGW2-6A基因的等位变异。在316份材料中,检测到61份T碱基插入等位变异材料(命名为TT基因型)和255份无T碱基插入的等位变异材料(命名为tt基因型);其中,189份为Hap-6A-A单倍型材料,127份为Hap-6A-G单倍型材料。     

小麦粒重基因TaGW2-6A编码区等位变异与抗旱性的关系

【目的】小麦籽粒大小及其在水、旱两种生态环境下的稳定性直接影响小麦的产量,研究小麦粒重与抗旱性的关系对品种高产稳产具有重要意义。探究粒重相关基因不同等位变异的抗旱性,进而确定抗旱高产的优异等位变异基因型,为利用该基因型进行小麦抗旱高产品种分子标记辅助选择及性状的遗传改良提供理论依据。【方法】以小麦粒重基因TaGW2-6A编码区不同等位变异的中国春和兰考大粒（977 bp多一个“T”碱基插入）为亲本构建的含有325个株系的RIL群体为研究材料,依据序列“T”碱基插入设计引物,利用高分辨率熔解曲线分析技术（high resolution melting curve,HRM）鉴定RIL群体中TaGW2-6A编码区不同等位变异基因型,并对其PCR产物进行测序分析。在水、旱两种生态环境下,测定小麦开花期、灌浆中期和乳熟期的叶绿素荧光参数、茎秆可溶性糖含量、抗旱指数等与抗旱紧密相关的指标,考察粒长、粒宽、千粒重等粒重相关性状,并研究这些抗旱相关指标及粒重相关性状与小麦粒重基因TaGW2-6A编码区不同等位变异基因型之间的相关性。【结果】高分辨率熔解曲线分析技术可以准确地将小麦RIL群体按TaGW2-6A编码区不同等位变异分为兰考大粒基因型（TT）、中国春基因型（tt）以及杂合基因型（Tt）,且PCR产物测序结果显示高分辨率熔解曲线的差异是由“T”碱基插入引起的。水、旱两种生态环境下,RIL群体中TT、Tt基因型材料与tt基因型材料相比,粒长、粒宽、千粒重等粒重相关性状以及叶绿素荧光参数、茎秆可溶性糖相关性状、抗旱指数等抗旱相关指标的差异普遍达到显著或极显著水平。旱胁迫下,小麦RIL群体不同基因型材料的粒长、粒宽、千粒重等粒重相关性状、叶绿素荧光参数除初始荧光Fo外均有所降低,而茎秆可溶性糖含量则有所增加。但TT、Tt基因型材料的粒长、粒宽、千粒重及叶绿素荧光参数的下降幅度普遍比tt基因型材料小,而茎秆可溶性糖的增加幅度比tt基因型材料大。旱胁迫下,tt基因型的茎秆可溶性糖积累效率（accumulation efficiency of stem soluble sugar content,AESSC）和转运效率（remobilization efficiency of stem soluble sugar content,RESSC）有所降低,而TT、Tt基因型的茎秆可溶性糖积累效率和转运效率则有所提高。【结论】小麦粒重基因TaGW2-6A编码区“T”碱基插入等位变异是大粒的优异等位变异,与此同时,该等位变异也是抗旱的优异等位变异,且抗旱能力与晋麦47相近。     

小麦HMW-GS近等基因系不同出粉点面筋二级结构的研究

为给不同出粉点小麦专用粉的开发与利用提供理论依据,应用傅里叶变换红外光谱仪、扫描电镜等技术比较研究了小麦品种西农1330及其Glu-B1位点不同HMW-GS近等基因系(NIL)不同出粉点面筋的二级结构、空间微观结构的差异。面筋蛋白二级结构分析表明,西农1330及其NIL皮磨粉面筋α-螺旋结构和β-转角结构的含量均低于心磨粉,而β-折叠结构的含量均高于心磨粉;同一出粉点面筋蛋白比较发现,含7+8亚基的西农1330NIL的皮磨粉面筋α-螺旋结构和β-转角结构的含量均低于西农1330(含7+9亚基),而β-折叠结构含量高于西农1330,心磨粉面筋二级结构含量则相反。面筋蛋白疏水特性分析表明,小麦皮磨粉面筋蛋白疏水程度均高于心磨粉;同一出粉点小麦面筋蛋白疏水特性分析表明,西农1330NIL的皮磨粉面筋疏水程度较西农1330高,而心磨粉面筋疏水程度较西农1330低。面筋中游离巯基和二硫键含量分析发现,小麦皮磨粉面筋中游离巯基和二硫键含量均高于心磨粉;同一出粉点比较,西农1330NIL的心、皮磨粉面筋游离巯基和二硫键含量均高于西农1330。面筋空间微观结构比较发现,小麦皮磨粉面筋蛋白空间结构均匀,心磨粉面筋蛋白空间结构呈纤维状;同一出粉点西农1330及其NIL的面筋空间微观结构无明显差异。     

不同提取工艺对茶树菇多糖得率及抗脂质过氧化作用的影响

采用水提醇沉法提取茶树菇多糖,设计单因素试验和正交试验以探讨提取温度、pH值和细胞破碎方式等因素对茶树菇多糖得率及抗脂质过氧化能力的影响.从而优化茶树菇多糖的提取工艺.正交试验结果表明:最佳理论提取工艺条件:温度为80℃,pH值为7.5,细胞破碎方式为冻融3次;最佳直观分析提取工艺:温度为80℃,pH值为7.5,细胞破碎方式为超声波30 min.验证试验结果表明,二者差异不显著.考虑到成本、能耗等问题最终确定最佳提取工艺为温度为80℃,pH值为7.5,细胞破碎方式为超声波30min.