茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1503bp,开放阅读框（ORF）为1071bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3Da,理论等电点（PI）为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。     

茶树EST-SNP分布特征及标记开发

对NCBI网上公开的12757条茶树ESTs序列进行聚类,成功构建了茶树的独立基因（Unigene）数据库,发现茶树的EST序列冗余率约为68.2%。初步建立了茶树EST-SNP标记开发体系,明确了茶树EST中SNP的分布规律,茶树编码区的SNP发生频率约为0.58%,平均200bp就有1个SNP位点,并进一步推算出茶树基因组DNA序列的杂合率约为0.38%,平均300个碱基就可能出现1个杂合位点。从237个多基因聚类簇中发现了818个SNP候选位点,设计了25对SNP引物进行DNA重测序验证,发现EST-SNP候选位点的多态检出率为75%。     

基于SNP标记的辣木群体遗传分析

基于SNP标记对辣木亲本及其子代群体的杂合度、遗传结构及遗传多样性进行分析，研究其遗传变异特征。利用AFSM技术对96份辣木材料进行简化基因组测序，将获得的测序过滤数据比对至参考基因组，使用VCFtools和BCFtools软件检测并统计SNP和Indel位点信息。利用AWK语言分析杂合位点，并比对出子代与亲本的差异位点，以分析辣木的繁育类型。利用Plink软件对变异位点进行过滤，保留高质量的变异位点，再通过ADMIXTURE软件进行群体结构分析，根据交叉验证错误率确定最佳K值，同时采用GCTA软件进行主成分分析，构建系统进化树，解析辣木材料的群体结构。采用VCFtools计算遗传多样性指数及群体分化指数，分析该群体的遗传多样性。通过LDBlockShow软件进行连锁不平衡分析，得出位点间的连锁不平衡程度。结果显示，共检测出1 187 831个SNP位点，150 861个Indel位点。将辣木子代基因与亲本比对后，发现辣木子代杂合的基因中，约有4.89%的基因为自身杂合基因，19.96%为外来遗传物质导致杂合的基因，基本表明辣木可通过自花和异花2种授粉方式繁衍后代。群体结构和主成分分析...     

基于茶树SNP的dCAPS标记体系研究

从茶树EST序列中搜寻出候选SNPs位点,在候选SNPs两侧设计测序引物进行PCR扩增,并对扩增产物双向测序验证;然后从每个扩增子中选择一个确证的SNPs,设计dCAPS引物,并进行扩增和酶切验证,将SNPs转化为dCAPS标记;最后,在长叶白毫×福鼎大白的F1群体中检测了标记的分离情况。结果发现,20对测序引物中有11对扩增成功,共确证了17个SNPs,占检测总数的54.8%;在设计的11对dCAPS引物中,有8对在长叶白毫、福鼎大白和龙井43等8个品种中表现出多态性,成功转化为dCAPS标记,转化成功率72.7%;8个dCAPS标记中的DCC229和DCC371在长叶白毫和福鼎大白之间表现有多态性,经检测,它们在这2个品种的F1群体中均符合孟德尔1︰1分离。     

蔗糖合成酶(SUS)基因的SNP标记开发及其与淀粉性状的关联分析

通过直接测序法获得玉米亲本(H21和紫糯96-619)sus1基因全长序列并进行亲本间序列比对,得到120个SNP位点,通过高分辨率熔解曲线(HRM)对300个近等基因系H21 BC5F2:3进行SNP位点分型,并将后代的基因型与群体的直链淀粉含量和淀粉糊化特性进行关联分析。结果表明,marker 31与直链淀粉含量和淀粉崩解值、峰值时间、糊化特性均连锁紧密;marker 17与直链淀粉含量和淀粉的峰值时间、淀粉最终黏度均连锁紧密;marker12与直链淀粉含量、淀粉的峰值时间连锁紧密。     

茶树叶绿体基因组SNP分子标记的初步研究

传统的叶绿体基因分子标记在茶组植物分类系统研究中的应用价值相对有限,为了筛选可用于茶树鉴别与母系溯源的SNP（单核苷酸多态性）位点组合,将18个已报道的茶组植物叶绿体全基因组序列进行比对,通过设计通用引物,在169个茶树品种/品系中进行候选分子标记扩增与一代测序分析,筛选出16对引物,共含25个SNP位点可用于茶树品种母系溯源与鉴别分析。另外,将SNP位点组成的DNA指纹图谱结合茶树品种资源基本信息进行数字编码,最终形成由30位数字组成的茶树品种资源分子身份证,并构建相应的条形码和二维码用于品种识别。本研究数据为茶树品种的母本溯源与鉴别提供新的思路。     

基于GBS技术构建四倍体杂交冰草超高密度遗传连锁图谱

冰草是优良的牧草,也是小麦等麦类作物抗逆遗传改良的重要基因库。构建冰草超高密度遗传连锁图谱,有利于冰草的标记辅助育种和遗传分析。本研究利用基因分型测序（GBS）技术,对四倍体杂交冰草F₂分离群体的115个单株及其亲本蒙古冰草和航道冰草进行高通量SNP基因分型,经测序获得了超过584 Gb的数据,SNP鉴定以及完整度和偏分离过滤后,最终得到了5 035个高质量的SNP标记;采用Join Map 4.0作图软件构建四倍体冰草超高密度遗传连锁图谱,该遗传图谱包括14个连锁群,各连锁群的长度范围在68.959～280.309 cM之间,平均长度为153.473 cM,覆盖的基因组总长度为  2 148.621 cM,标记间的平均距离为0.427 cM。该图谱是目前冰草中分子标记数目最多、密度最高的遗传连锁图谱,为进一步开展冰草品质、抗性等重要性状的QTL定位、图位克隆及分子标记辅助育种研究等奠定了基础。     

四倍体杂交冰草SRAP和SSR分子标记遗传连锁图谱构建

为了给后期冰草抗旱耐寒基因筛选及QTL图位克隆搭建平台,并为产量及相关性状QTL定位和分子标记辅助育种奠定基础,以航道冰草和蒙古冰草为亲本,杂交加倍后随机选取180个F₂分离单株为作图群体,利用SRAP和SSR分子标记进行四倍体杂交冰草遗传连锁图谱的构建。结果表明,构建的图谱包含475个标记（240个SRAP标记和235个SSR标记）,分布于14个连锁群,图谱全长为1 592.7 cM,标记间平均间距为3.35 cM,各连锁群长度范围为67.6~145.2 cM。该图谱密度较高、标记位点分布均匀且连锁群更加饱满。     

茶树CsCHLI基因的克隆及其在不同叶色白化茶树中的表达分析

镁离子螯合酶是叶绿素合成过程中的关键酶之一,与植物叶色的白化现象密切相关。以陕茶1号、白叶1号、极白1号、黄金芽和黄金叶等5个茶树品种叶片为试验材料,分别克隆其镁离子螯合酶I亚基（Mg-chelatase I subunit,CHLI）编码基因CsCHLI全长CDS序列。多序列比对显示,白叶1号中两个碱基差异位点（G502C,C1169T）导致在AAA⁺和AAA lid结构域中有2个氨基酸残基发生改变（G168R,A390V）,黄金叶中1个碱基差异位点（G1202A）导致在AAA lid结构域中有1个氨基酸残基发生改变（R401H）。亚细胞定位结果显示,CsCHLI定位于叶绿体中,碱基或氨基酸残基的差异并不影响其亚细胞定位。RNA二级结构分析表明,碱基位点突变会影响CsCHLI的茎环结构和二级结构的稳定性。与陕茶1号相比,不同叶色白化茶树品种中总叶绿素含量分别为陕茶1号的25%~77%,CsCHLI基因表达量分别为陕茶1号的24%~46%。结果表明,茶树中CsCHLI的基因表达与叶绿素含量呈正相关。这些结果将为深入研究CsCHLI在茶树叶绿素代谢中的功能以及茶树叶色突变的作用机理提供试验证据。     

类茶氨酸合成酶基因家族在番茄中的鉴定及表达研究

茶树体内的茶氨酸合成酶（Theanine synthetase synthetase,TS）和部分谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）家族成员都具有催化乙胺和谷氨酸合成茶氨酸的活性。我们将植物中这类与茶树TS序列高度相似,且具有茶氨酸合成活性的酶,统称为类茶氨酸合成酶（Analogue theanine synthase,ATS）。为了探究ATS在非茶植物中的分布,以及乙胺在茶氨酸合成中的作用,本研究以Mico-Tom番茄为试验材料,对水培番茄幼苗进行了外源添加乙胺处理。结果发现,仅在处理组叶片中检测到茶氨酸,并且处理组叶片中的谷氨酰胺（Glutamine,Gln）含量也极显著增加,而丙氨酸含量与对照相比无显著变化。利用生物信息学方法分别从茶树和番茄基因组中鉴定出12个和5个ATS家族成员,它们均含有谷氨酰胺合成酶催化功能的结构域Gln-synt_C;qRT-PCR检测发现,处理组叶片中有2个ATS（SlGS1.1和SlGS1）表达量极显著提高。上述结果表明,ATS广泛存在于植物中,而乙胺是合成茶氨酸的关键限制因子,能够提高ATS基因的表达,触发茶氨酸的合成。     

茶树多酚氧化酶基因的PCR-RFLP多态性分析

采用PCR-RFLP技术,检测茶树多酚氧化酶(PPO)基因中4个限制性核酸内切酶酶切位点在不同品种中的多态性,以研究其与品种适制性及遗传背景的关系。遗传参数分析表明:4个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),HpaⅡ酶切位点(引物L7/L8扩增区段)呈现高度多态,BsuRⅠ酶切位点呈现中度多态,这2个酶切位点在不同品种中的基因型分布与品种的遗传背景有直接的关联,可作为遗传标记应用于茶树品种遗传亲源关系分析与亲子鉴定。HpaⅡ酶切位点在引物L7/L8扩增区段存在丰富的多态性,且与品种适制性具有明显关联,适制红茶的品种多为AA基因型,此位点能被HpaⅡ内切酶完全酶切;适制绿茶与乌龙茶的品种多为BB型或AB型,此位点不能被酶切或不能完全被酶切,该HpaⅡ酶切位点可作为茶树品种适制性早期鉴定的遗传标记。对引物L7/L8扩增区域的HpaⅡ酶切位点在祁门4号×潮安大乌叶F1代群体进行分型检测的结果表明,该位点在F1代的分离符合孟德尔遗传规律(x2=0.23)。     

Development of new markers to genotype the functional SNPs of SSIIa, a gene responsible for gelatinization temperature of rice starch

Gelatinization temperature (GT) is an important quality predictor that determines the cooking quality of rice. GT is genetically controlled by the starch synthase IIa (SSIIa) gene. Two functional single nucleotide polymorphisms (SNPs) inside the SSIIa have already been found to be responsible for the variation of GT. One of these, GC/TT SNP at 4329/4330 bp, could be genotyped by four primers in a single PCR ( Bao et al., 2006a), but another one, G/A SNP at 4198 bp, has not been detected by a PCR-based marker. Here, we developed cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) and derived cleaved amplified polymorphic sequence (dCAPS) markers to detect these SNPs. A dCAPS marker that the PCR products were cleaved by the BseR I restriction endonuclease was designed to detect GC/TT SNP. Both CAPS and dCAPS markers were designed to detect G/A SNP using the restriction endonuclease Nla III and Tsp45 I, respectively. All the markers developed were co-dominant. It was known that the A allele of G/A SNP was rare among rice germplasm, but it was still in use by rice breeders. 11 rice accessions including landrace and breeding lines with A allele of G/A SNP were detected. The F₂ individuals from two crosses were used to analyze the co-segregation between the SNP alleles and the GT. The segregation ratio of two SNPs did not conform to the expected Mendelian ratio of 1:2:1, but the SNPs were co-segregated with GT. The markers developed in the present study would be useful in molecular breeding for the improvement of the quality of rice grain.     

黄化变异茶树石门黄叶理化分析及茶氨酸相关基因表达研究

黄化变异是茶树较为常见的叶色变异现象,黄化茶树的特征性化学成分含量会发生较大变化,其中氨基酸含量显著增加,研究此现象形成的原因有助于揭示叶色与氨基酸代谢的相关性。本研究以石门地区自然黄化变异茶树为材料,对其全黄、全绿和黄绿叶片进行叶绿体超微结构分析和主要生化成分检测,采用实时荧光定量PCR方法检测茶氨酸生物合成相关基因（TS,CsGS1,CsGS2）在不同叶色间的表达水平并分析它们与茶氨酸含量的相关性。结果表明：（1）与绿叶相比,黄化叶的叶绿体结构存在异常,主要表现为类囊体膜结构不清晰;（2）生物碱含量由高到低分别为黄叶、绿叶、黄绿叶,组间差异显著;（3）没食子酸、总儿茶素含量在绿叶中最高,在其他两组间无显著差异,多种儿茶素组分含量随叶片转绿而提高,但EC与叶片黄化程度呈正相关;（4）氨基酸和茶氨酸含量变化趋势与叶片黄化趋势相同;（5）TS基因和CsGS1基因在绿叶中表达量最高,在黄绿色叶片中表达量最低,CsGS2基因在全黄叶片中表达量最高;（6）茶氨酸含量与TS、CsGS1、CsGS2基因表达量均无显著相关性。可见,黄化茶树叶片的叶绿体结构异常,其物质代谢会受到影响,氨基酸分解被抑制,并富集在黄化叶中。     

分子标记辅助选择改良玉米自交系昌7-2的丝黑穗病抗性

选取5个与bin2.09主效抗病位点紧密连锁的分子标记,利用含主效抗病位点的黄早四近等基因系1JD006为供体亲本,开展连续回交分子标记辅助选择育种,定向改良玉米自交系昌7-2的丝黑穗病抗性。结果表明,标记3M1-25选择效率最高,其次为标记MZA6393。结合分子标记辅助选择和田间接种鉴定,在BC2F2群体中筛选出背景回复率大于理论值87.50%的6个单株,BC3F2世代中筛选出背景回复率大于理论值93.75%的12个单株,其中6株回复率≥96.92%,田间接种发病率均低于40%。筛选出的6个BC3F3家系中除4JZ574-01外在主要农艺性状上与轮回亲本无显著差异。     

SSR和SNP标记在玉米分子标记辅助背景选择中的应用比较

利用SSR和SNP两种标记对H2321/J076/J076的BC1F1代群体进行分子标记辅助背景选择,比较两种标记在分子标记辅助背景选择上的应用效果。经筛选表明,40对SSR引物中在回交亲本间具有多态性的引物有6对。利用多态性引物对BC1代群体进行毛细管电泳检测结果表明,157个单株轮回亲本背景回复率在50%~100%,背景回复率为100%的单株有1株,背景回复率91.67%的单株有14株。利用Maize SNP3072芯片分析后发现,104个多态性SNP位点可以将157株个体进行精细排序,背景回复率在51.92%~93.75%。比较SSR和SNP标记的背景选择结果,两种标记呈中等程度相关。在回交早代将SSR和SNP标记结合使用进行背景选择,可以实现大群体严选择,提高选择效率。     

籼稻RAPD标记遗传距离与杂种后代稻米味度及RVA谱特性的相关分析

 选用8个籼稻品种按Griffing双列杂交方法Ⅳ配制28个F1杂交组合，分析了RAPD分子标记籼稻遗传距离与稻米味度及淀粉粘滞性谱（RVA谱）杂种优势的关系。结果表明， 利用297个多态性RAPD标记位点计算8个亲本间分子标记遗传距离，其范围在0.197~0.349，平均为0.269，8个亲本可划分为2个类群；味度值和RVA谱的中亲优势平均而言介于双亲之间，分子标记遗传距离与F1味度值和RVA谱的表现以及杂种优势间的相关均不显著，味度值和RVA谱杂种优势与亲本间的遗传差异大小无关；双亲味度和RVA谱平均值与杂种味度和RVA谱之间均呈极显著的正相关，双亲味度值和RVA谱的平均值高，杂种味度值和RVA谱也就高。     

32份茶树地方群体种资源的遗传多样性和群体结构分析

选取均匀分布于茶树15个连锁群上的30对SSR引物,对来自12个省份的32份茶树群体种资源进行遗传多样性和群体结构分析,以期为茶树杂交育种亲本选择和演化路线推断提供参考。研究共获得149个等位基因,平均每个SSR标记检测到5.96个等位基因,引物多态性信息含量均值为0.660。32个茶树群体Shannon’s多样性指数范围为0.691~1.089,平均数为0.954;观测杂合度的范围为0.253~0.633,平均数为0.510;期望杂合度范围为0.430~0.653,平均数为0.590。供试茶树群体遗传分化系数（Fst）均值为0.205,遗传分化水平较高。基于Nei’s遗传距离的聚类和群体结构分析结果一致,供试种质可划分为四大类型,具有明显的地域分布规律。