大豆子叶节和胚尖再生体系的比较及大豆SR1基因的遗传转化

以合丰23和合丰35的子叶节和胚尖为外植体,通过农杆菌介导对抗大豆疫霉根腐病基因SR1进行遗传转化。结果表明:合丰35胚尖和子叶节体系的出芽率(96.1%和79.1%)均显著高于合丰25(66.45%和74.4%);胚尖转化体系的平均再生周期(40 d)低于子叶节转化体系(68 d);在诱导培养基上培养20 d时胚尖转化体系的转化效率(96.1%)高于子叶节体系(77.8%)。以合丰35胚尖为外植体成功转化大豆抗疫霉根腐病基因SR1,共获得6株转基因植株。     

利用农杆菌介导法转化大豆子叶节的影响因素研究

以3个大豆品种为材料,采用GUS瞬时表达的方法,对适合于大豆子叶节和胚尖转化的基因型进行筛选,结果表明:适合大豆子叶节转化的品种为东农50,适合胚尖转化的品种为黑农41。在子叶节转化系统中,摸索了农杆菌侵染浓度与侵染时间的最佳配比组合、乙酰丁香酮浓度和超声波辅助处理对大豆转化效率的影响。优化后的条件为:农杆菌侵染的浓度OD600=0.6,侵染时间30～40 min,乙酰丁香酮浓度200μmol.L-1,超声波辅助转化时间5 s。在上述条件下,成功获得了转基因植株,转化效率为2.3%。     

大豆子叶节遗传转化体系优化及抗逆基因AtNHX5的转化研究

以河北省优良大豆品种冀豆15、五星2号和NF-58的子叶节为受体材料,利用农杆菌介导法进行遗传转化,探讨了影响农杆菌侵染后子叶节不定芽诱导的因素。结果表明:以萌发6 d、4℃处理24 h的子叶节为外植体,农杆菌侵染后经超声波处理30 s、共培养基中添加20 mg·L-1硝酸银,能够提高子叶节丛生芽诱导率,转化植株经草铵膦筛选以及PCR检测,T0代转化率达0.97%。利用该体系对大豆品种五星2号进行At NHX5基因的遗传转化,获得3株T0代RT-PCR检测阳性植株,且2-1号T1代阳性植株检测具有一定耐盐性,初步证明获得了转At NHX5基因的大豆新材料。     

未成熟种子子叶节转化体系优化及转EPSPS/GAT基因大豆新材料创制

以丛生芽率为指标,将农杆菌介导的大豆未成熟种子子叶节转化与成熟种子转化体系进行比较,明确了诱导过程中草甘膦筛选浓度、未成熟种子生理状态,改进大豆外植体的获得方式并减少了组培环节,建立了未成熟种子子叶节转化体系。利用Jack黄熟后期的种子作为受体材料,在15 mg·L-1的草甘膦筛选浓度下获得了9株PCR检测阳性植株并且生长正常可育,T0代经测序及Southern Blot分析,进一步证明外源基因已整合进大豆基因组中,其中2个株系的T1代植株经PCR检测符合3∶1的分离比,且表型鉴定筛选出抗性转基因植株,为抗草甘膦转基因大豆育种提供了新材料。     

MYB转录因子AtPHR1转化大豆研究

以MYB转录因子AtPHR1表达载体为转化对象,采用农杆菌介导子叶节转化技术将其转入栽培大豆,研究不同萌发时间、预培养时间、菌液和侵染液浓度、大豆基因型以及筛选剂浓度对转化效率的影响.结果表明:以萌发5d大豆幼苗制备子叶节外植体,预培养1d,农杆菌菌液OD600为0.7,侵染液OD600为0.5或0.7进行转化,100 mg.L-1卡那霉素进行筛选的抗性芽诱导率最高;5个供试品种中,以五星2号的转化率最高,约为2.0％;经PCR检测转化后的大豆植株,获得了含有转录因子AtPHR1的5个大豆新材料.     

pCAAFP66表达载体的构建及其大豆遗传转化的研究

以pCAMBIA3301为载体骨架,afp为目的基因,构建了大小为9868 bp的大豆表达载体pCAAFP66,该载体带有抗冷冻蛋白基因afp和筛选标记基因bar.以大豆品种华春3号和华春6号的胚尖和子叶节为外植体,应用农杆菌介导法进行遗传转化,以草甘膦(PPT)为筛选底物.结果表明:在胚尖转化体系中,华春3号和华春6...     

大豆胚尖转化体系优化和cry1C*基因转化大豆的研究

以抗大豆食心虫品系东农8004的胚尖为外植体,通过对芽诱导和芽伸长培养基进行优化,建立8004的胚尖转化体系,利用该体系进行cry1C*基因的转化,对获得的抗性再生植株进行分子鉴定和抗虫性鉴定。结果表明:在芽诱导培养基中附加1.67 mg·L-16-BA,丛生芽诱导率最高,达到80%,在芽伸长培养基中附加0.5 mg·L-1GA3和0.1mg·L-1IAA,芽伸长率最高为54%。共获得94株PPT(100μg·m L-1)抗性再生植株,PCR检测阳性14株,阳性率为14.89%。对4株T0代阳性植株进行大豆食心虫抗性鉴定,其中C-1植株的食心虫抗性明显高于野生型8004,说明在大豆中表达cry1C*基因能提高大豆对食心虫的抗性。     

农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系的优化研究

以大豆品种"中豆32、Peking、早熟18、绥农14"子叶节为受体材料,用农杆菌介导法转入与抗逆相关的小麦Na /H 逆向转运蛋白基因(TaNHX2),探索外植体大小、培养基主要成分、培养时间等因素对外植体分化的影响,旨在优化遗传转化条件,提高大豆转基因的遗传转化效率.研究结果表明,以健康外植体获得率、抗性丛生芽获得率和抗性芽伸长比率为指标,筛选并建立的优化转化系统为:大豆萌发和不定芽诱导时分别加入0.5 mg L-16-BA和1.0 mg L-16-BA,浸染时间为30 min、共培养时间为3 d;外植体大小为2/3子叶,kan抗性筛选浓度第一阶段和第二阶段分别是60和50 mg L-1;利用上述方法,已获得中豆32转基因再生植株,经PCR分子检测,证明目的基因TaNHX2已导人并整合到大豆基因组中,转化率为3.78%.     

硼酸诱导的大豆子叶节转化新方法

采用农杆菌介导法,以苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白基因Bt为目的基因,研究了不同硼酸浓度处理对大豆子叶节转基因的影响.结果表明:200 mg·L-1硼酸浓度诱导培养基诱导的大豆丛生芽长势最好,而且转基因效率高达3.3%.对获得大豆转化幼苗的根和叶片采用PCR、逆转录PCR和Sou...     

适于子叶节和胚尖再生体系的大豆基因型筛选

以吉育91等6个基因型大豆的子叶节和胚尖为外植体,研究了大豆不同基因型在子叶节、胚尖2个再生体系中的不定芽诱导率、不定芽伸长率和不定芽数。结果表明:基因型对大豆不同再生体系的再生有显著影响,合丰35和合丰25在子叶节体系中的不定芽诱导率和伸长率均高于胚尖体系,而黑农37的不定芽诱导率和伸长率在胚尖体系高于子叶节体系。不同基因型适合的大豆再生体系不同,合丰35、合丰25和绥农14适合选用子叶节再生体系,黑农37更适合选用胚尖再生体系,而吉育91和北京小粒豆则既可以选择子叶节再生体系又可选择胚尖再生体系。     

利用发根农杆菌体系检测大豆CRISPR/Cas9系统的靶点

作为一种基因编辑的新技术，CRISPR/Cas系统已被广泛应用于各种生物的基因工程中。但CRISPR/Cas9 基因编辑系统还存在着一定的脱靶现象，确定基因编辑靶点选择的可行性可提高基因编辑效率。本研究选用大豆 GmCO 基因为靶标，使用CRISPR/Cas9基因编辑系统来构建靶点的基因敲除载体，并且利用发根农杆菌K599菌株 对大豆子叶进行侵染，再通过植物组织培养的方法促使大豆外植体长出不定根，通过不定根检测发现在靶点2处出 现了碱基的缺失，说明成功实现了对大豆目标基因的编辑。此方法操作简单，周期短，实现了对大豆中选择靶点的 可行性的快速鉴定，为研究大豆的GmCO 基因功能和遗传改良方面提供了新的技术支持。     

基于CFX的新型豆粕单螺杆挤出机数值模拟分析

单螺杆挤出机是加工以豆粕为原料的膨化食品行业中使用的关键设备。普通单螺杆挤出机存在混合不充分、比能耗低的缺点,为了提高其性能,运用ANSYS/CFX软件对具有三角屏障混炼元件以及反向螺纹元件的新型单螺杆挤出机的流道进行流场分析。研究分析豆粕在其流道中的运动情况,包括速度矢量图、速度流线图、宏观压力图,并和具有普通单螺杆元件挤出机进行对比分析,结果表明:新型组合式单螺杆挤出机的建压能力较好,可切断重排豆粕的速度流线,有利于豆粕更好地混合。研究结果可为单螺杆挤出机设计提供参考。     

大豆铁蛋白cDNA的克隆及植物表达载体的构建

以大豆为材料，利用RT-PCR法扩增得到大小约750bp的片段，将这个片段连接到克隆载体pBlueskript SK＋上进行测序，结果证明，此片段就是大豆的铁蛋白基因。将此片段再正向插入到植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间，构建了植物表达载体pBIFe，并成功地将该载体导入根癌农杆菌EHA105。此项工作为获得表达铁蛋白的转基因植物奠定了基础。     

大豆E3连接酶基因GmPLR-2 的克隆及抗旱功能鉴定

PEG模拟干旱胁迫条件下E3连接酶GmPLR-2 基因在大豆根茎叶中呈上调表达，推测其可能参与大豆抗 旱调节。本研究克隆GmPLR-2 基因，构建植物过表达载体pCAMBIA3301-GmPLR-2、RNA干扰表达载体pCAM⁃ BIA3301-GmPLR-2-RNAi并转化到吉农38中，对T2转基因植株进行分子检测，连续7 d不浇水后测定转基因叶片 中相关生理生化指标。结果表明：共获得T2过表达阳性植株12株，RNA干扰阳性植株11株。干旱胁迫7 d后过表 达植株中相对含水率、POD活性、SOD活性、Pro含量均高于未转化植株，而RNA干扰植株中则低于未转化植株；另 一方面过表达植株中相对电导率、MDA含量均低于未转化植株而RNA干扰植株中含量则高于未转化植株，且差异 极显著，说明GmPLR-2 基因的表达与大豆中相关抗旱指标的变化有关。     

一个调控大豆根瘤数量的GmWUS2基因功能研究

豆科植物的结瘤固氮作用在农业上具有减肥增效、改良土壤等重大意义.WUS基因在植物分生组织中具有重要作用.基于已公布的大豆基因组数据对该基因进行生物信息学分析,表明大豆WUS基因(GmWUS)和模式植物拟南芥WUS基因(AtWUS)的编码蛋白在氨基酸序列上相似度较高,但在酸性区域存在较大差异.从大豆品种天隆1号基因组中扩...     

中国不同纬度野生大豆和栽培大豆SSR分析

采用SSR分子标记技术对我国不同纬度的野生大豆（G.soja)和栽培大豆（G.max)各22份进行了多样性分析，通过对所合成的40对引物的筛选，12对引物扩增结果表明出良好的多态性，引物BARC-sat39在野生大豆和栽培大豆之间有特异谱带，表明这个SSR标记是与栽培大豆和野生大豆有关的一个等位基因位点，通过对实验结果量化后数据分析；野生大豆和栽培大豆的平均遗传距离分别为0.175和0.150，表明野生大豆的多态性比栽培大豆较为丰富，在遗传距离0.300处，野生大豆和栽培大豆被明显分为二类，与以往大豆属Soja亚属的形态学分类结果相一致，为野生大豆和栽培大豆分为二个种提供了分子水平上的证据。     

耐旱基因cspB转化大豆的研究

为提高大豆的耐旱性,本研究根据大豆偏爱的密码子将来源于枯草杆菌抗旱相关基因cspB序列进行了优化,并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-cspB,利用农杆菌介导法将cspB基因导入大豆栽培品种Bert中。用于遗传转化子叶节外植体共3 800个,经PCR和Southern鉴定,并结合PPT抗性筛选,共获得了95棵阳性转基因植株,转化率为2.5%。经初步筛选,获得了7份耐旱性较好的转基因大豆新材料。这些材料将进一步用于耐旱转基因大豆新品种培育工作。     

花青素合成关键酶基因的定位及结构分析

为研究大豆花青素合成途径关键酶的基因标记和结构信息,利用大豆基因组和染色体标记数据,对16个花青素合成关键酶基因(苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合酶(CHS,包括9个成员)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)、苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)和4-香豆酰CoA连接酶(4CL),进行基因遗传图和物理图定位和基因结构分析.结果表明:16个基因分别定位在A1、A2、B1、B2、D1a、D1b、D2、I、K、O等10个连锁群上,并获得了基因所在序列两侧标记.利用大豆的cDNA和gDNA序列信息,获得了16个基因的结构,外显子数目1～7个,内含子数目0～6个,其中PAL、DFR2、GmCHS7是单外显子基因,4CL、CHI、F3H、GmCHS1、GmCHS5、GmCHS8有1个内含子,DFR1、GmCHS2、GmCHS3、GmCHS6有2个内含子,GmCHS4、GmCHS9有3个内含子,GmIRCHS则有6个内含子.     

利用注射叶片法快速鉴定大豆GmCRY1和GmCRY2基因功能

将大豆隐花色素基因GmCRY1、GmCRY2构建在N端含有绿色荧光蛋白(GFP)的pEGAD载体上,并转化农杆菌EHA105菌株.将含有上述基因的EHA105菌液分别注射到大豆单叶及复叶叶片中,观察长日条件下(16 h光照/8h黑暗)和短日条件下(8h光照/16 h黑暗)注射植株的开花时间.结果叶片注射含GmCRY1基...