西藏青稞品种甘农大7号白粉菌诱导早期应答基因SSH文库的构建及分析

以接种白粉菌后24 h甘农大7号材料的叶片为实验组(tester),未接种白粉菌材料的叶片为驱动组(driver),分别提取c DNA,利用抑制差减杂交技术,构建"甘农大7号"白粉菌诱导早期应答基因差减文库。对所获得的EST序列去污染后,通过与核酸和蛋白数据库进行序列同源性比对,发现其中有219条非重复序列与已知序列同源性较高。对这些序列进行GO和KEGG功能分析,发现这些注释的基因主要在信号转导、基础物质代谢等方面发挥作用。本结果为后续探究青稞品种甘农大7号抗白粉病的分子机制提供了方向及理论依据。     

芝麻EST-SSR引物的开发与应用

为丰富芝麻EST-SSR引物,本研究从实验室构建的高油芝麻品系中芝14号的不同种子发育期cDNA文库中获得45 569条表达序列标签（expressed sequence tags,EST）,通过前处理得到总长17.428Mb的无冗余EST共32 421条。利用MISA和SSR finder软件包工具对EST序列进行SSR位点查找,在这些序列中发现有1 688条Unigene,共有1 949个SSR。共226个序列含2个或2个以上SSR位点。这些SSR中出现频率最高的重复基序类型为三核苷酸(74%)。为开发芝麻EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于芝麻品种遗传差异研究的可行性,用12份不同含油量品系材料评价其中34对与油脂代谢相关的基因SSR引物,全部成功扩增,共有3对引物获得多态性条带。结果表明,芝麻EST-SSR 标记开发效率较高,是芝麻SSR标记开发的重要措施,对于芝麻品种的鉴定与遗传多样性分析具有很高的应用价值。       

大豆硫氧还蛋白基因的克隆与分析

通过对大豆耐盐品种文丰7盐处理抑制差减文库的筛选,获得了一些差异表 达的EST序列,与NCBI中EST数据库进行比对分析后发现,其中1个与硫氧还蛋白相关.据此预测了大豆硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)基因的cDNA序列,并采用RT-PCR方法克隆了大豆Trx基因.生物信息学分析表明:该基因包含1个354 b...     

西藏青稞品种喜玛拉雅10号干旱胁迫的SSH文库构建及干旱诱导表达基因分析

为了研究西藏青稞抗旱的分子机制,以西藏耐旱青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum HK.f.)品种喜玛拉雅10号为材料,利用抑制性差减杂交技术(SSH)构建青稞苗期叶片干旱胁迫诱导基因表达的正向差减文库。挑取600个阳性克隆进行PCR验证,并对验证后的单克隆进行测序分析,共获得420个有效序列。去除冗余序列和嵌合序列后,获得220条高质量EST序列,其中183条singlets,37条contigs。BlastN分析表明,其中189个EST序列可以在GenBank的unigene中找到同源序列,31个未能找到unigene同源序列;BlastX分析表明,62个EST序列unigene与未知功能蛋白或假定蛋白有较高的相似性;158条EST序列与已知功能蛋白有较高的同源性。获得的EST序列多数不仅与植物的非生物胁迫相关,也与植物的生物胁迫反应相关,说明植物在胁迫反应中有明显的共同机制。其中与大麦表达序列高度同源的EST占58%;这些基因涉及参与信号转导和转录调节的基因(11.96%),编码保护、防御和胁迫耐受蛋白的基因(9.78%),跨膜转运相关基因(5.43%),光合作用基因(6.52%),参与结构和功能代谢合成途径中的一些酶(30.43%)等代谢过程。实验结果表明,青稞在干旱复水条件下可诱导一系列特异基因的表达,如参与抗旱反应相关酶和蛋白基因锌指蛋白、衰老相关蛋白、CAS、细胞色素P450、热激蛋白、胁迫诱导蛋白,以及LEA蛋白、脱水蛋白、P5CS等保护蛋白基因。用KOBAS系统将56个EST定位到32个Pathways中,初步分析发现,谷氨酸盐代谢途径(Glutamate metabolism)、精氨酸和脯氨酸代谢途径(Arginine and proline metabolism)、泛素蛋白介导的蛋白质水解代谢(Ubiquitin mediated proteolysis)途径可能与青稞抗旱相关性较大。     

西藏青稞品种藏青13高氮处理的SSH文库构建及分析

为了分析青稞高氮处理相关基因的表达,以藏青13为实验材料,通过抑制差减杂交构建了青稞高氮处理下的差减c DNA文库。在随机挑取的281个阳性克隆中,测序获得219条高质量的EST,含有212条非重复且与Genbank中的基因或蛋白具有较高的同源性的序列。对其进行Blast2Go功能注释可将差异表达的基因定位到细胞组件、分子功能和代谢过程3大类内。通过KEGG代谢途径分析,212个比对结果中的117个ESTs有详细的KO功能注释,定位到17个具体的代谢途径上,且主要定位在光合作用碳固定途径和氮素代谢途径。此外,分析还发现这些基因主要是编码参与结构和功能代谢合成途径中的一些酶,且参与信号转导、转录调节和光合作用等生理过程,说明这些基因很可能参与到青稞在高氮处理下的抗性反应中。     

甜菜EST-SSR引物的开发与应用

利用NCBI公共数据库现有的甜菜(Beta vulgaris L.)表达序列标签(expressed sequence tags,EST)数据信息,开发了甜菜EST-SSR标记。在所有的29830条甜菜EST序列中共确认得到20109条非冗余EST序列,总长为11287.6kb。在含有微卫星重复的6951条EST序列中按照SSR引物设计要求,最终获得了2845个EST-SSR,平均每3.96 kb含有1个SSR。EST-SSR的分布频率和特征分析表明,A/T单碱基重复最多,其次是AAG/CTT三核苷酸重复,AG/CT二核苷酸重复,ACCTCC/AGGTGG等六核苷酸重复最少。随机合成了100对SSR引物,并分别选用6个甜菜品种进行多态性检验,将其按遗传相似性分为两组,多态信息含量(polymorphism information content,PIC)平均值为0.47。本研究证实这种全新的开发甜菜SSR标记的方法具有高效、多态性较高的特点,在甜菜遗传多样性分析、功能基因定位、遗传图谱构建以及比较基因组等研究方面有广阔的利用前景。     

小麦SKC1 like基因的克隆及多样性研究

为了给小麦耐盐分子机制的研究提供参考,以水稻(Oryza sativa L.)耐盐相关数量性状基因SKC1(Shoot K+Content)的cDNA序列(GenBank登录号:DQ148410)为基础,通过搜索GenBank数据库找到2条与OsSKC1同源的普通小麦(Triticum aestivum L.)EST(GenBank登录号:DR734861,CK193616)。根据EST-DR734861设计引物筛选粗山羊草AL8/78(Aegilops squarrosa)BAC文库,通过BAC延伸测序克隆了粗山羊草AL8/78的SKC1-like基因(AeSKC1),进一步根据AeSKC1序列设计特异引物克隆了普通小麦SKC1-like基因(TaSKC1)。对人工合成双二倍体、地方品种和育成品种中TaSKC1的基因多样性分析表明,在驯化过程中TaSKC1瓶颈效应明显,属于驯化基因。     

利用RAPD-BSA法筛选亚麻耐渍基因的分子标记

本研究以耐渍型亚麻品种Y4F082和非耐渍型品种Agatha及其杂交F2代为材料,采用分离群体分组分析(Bulked Segregate Analysis,BSA)法,对亚麻耐渍基因进行RAPD分析。在500个随机引物中筛选出一个引物S1377在两亲本及抗、感基因池中均能扩增出一条大小为800bp稳定的差异条带,命名为S1377-800,通过F2代个体验证,耐渍型个体均能扩增出此差异条带而非耐渍型个体中不能扩增出此差异条带,证明S1377-800是与亚麻耐渍基因紧密连锁的RAPD标记。     

基于产量的花生基因型耐湿涝性综合评价

在大田条件下,利用塑料膜遮挡雨水,从花生营养生长末期开始分别进行短期湿涝(10d)和长期湿涝(88d)以及正常灌溉处理,以测定18个花生基因型的籽仁产量,再计算相对产量、耐湿涝系数和耐湿涝指数,进而分类评价花生基因型对湿涝反应的差异.结果表明:(1)花生对湿涝的反应,因湿涝长短和基因型而异.短、长期湿涝导致一些基因型减产(2.5%～48.6%),另一些基因型增产(5.5%～56.7%).其中7个品种均减产,5个均增产,5个只适应长期湿涝,1个只适应短期湿涝.(2)根据长、短期耐湿涝系数差异可将基因型划分为7类;采用聚类分析并结合湿涝产量和耐湿涝系数,则划分为6类.结果认为,以耐湿涝指数作为综合评价指标有失偏颇.(3)已获得多个优异耐性基因型,可用于深入研究目标基因和选育耐湿涝性品种.     

大豆Usp1基因的克隆和表达分析

在对大豆根系盐胁迫抑制差减杂交文库EST序列分析的基础上,利用RT-PCR技术克隆得到了一个大豆Us-pA基因,命名为GmUsp1,其编码一个包含164个氨基酸残基的多肽链。多序列比对和编码蛋白结构分析表明,GmUsp1属于泛应激蛋白(Universal Stress Protein)家族成员之一。其氨基酸序列与蚕豆Vf_enod18序列相似度最高,属于MJ-0577类中含有ATP结合位点的UspA亚族,与MJ-0577有相似的蛋白二级结构。分别采用250 mmol.L-1NaCl、100μmol.L-1ABA和30%PEG 6000进行胁迫处理,耐盐品种文丰7号和盐敏感品种Union的GmUsp1均被诱导表达,二者对胁迫诱导响应时间和表达量存在差异,说明GmUsp1可能参与大豆对非生物逆境胁迫的应答调控。