茶树Na+/H+逆向转运蛋白基因CsNHX1、CsNHX2的克隆及表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（Na⁺/H⁺ antiporter,NHX）在植物生长发育与逆境响应过程中扮演着重要角色。本研究以龙井长叶茶树品种为材料,克隆获得了茶树CsNHX1和CsNHX2基因cDNA全长序列,GeneBank登录号分别为：MG722977和MG515211。生物信息学分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2的cDNA全长分别为1β691βbp和1β757βbp,均包含1个1β626βbp的开放阅读框,编码541个氨基酸,预测分子量为59.5βkD和59.7βkD,理论等电点为7.07和8.79;蛋白序列分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2属于典型的跨膜蛋白,均含有保守的Na⁺/H⁺ Exchanger结构域;进化树分析显示,CsNHX1和CsNHX2均为IC类中定位于液泡膜上的Class I成员。qRT-PCR结果显示,干旱、低温和盐胁迫能够显著诱导CsNHX1和CsNHX2上调表达;外源ABA处理下,CsNHX1和CsNHX2表达水平整体变化趋势不显著;高温胁迫处理下,茶树CsNHX1表达水平显著降低,而CsNHX2表达水平逐渐增加,表明茶树CsNHX1和CsNHX2参与了茶树对多种环境胁迫的响应过程,但对于不同逆境胁迫的应答模式存在一定差异。     

茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的克隆及差异表达特征分析

利用NCBI茶树转录组数据库,以铁观音芽叶为材料,克隆了茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长。CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长分别为1β879βbp和1β764βbp,分别含有1β539βbp（编码513个氨基酸）和1β533βbp（编码511个氨基酸）的完整开发阅读框。氨基酸序列比对结果显示,CYP71A26与CYP71B34的同源性为42.47%,为2个亚家族基因。氨基酸结构分析表明,2个基因均具有植物P450的螺旋C（Helix C）、螺线I（Helix I）、螺线K（Helix K）、“Meander”区域序列和血红素结合域（Heme binding domain）的典型结构。进化树分析显示,CYP71A26与CYP71B34在分子进化树上分属两大分支,2个基因与其他物种亲缘关系的远近不同。三级结构模拟与功能域分析显示,CYP71A26与CYP71B34主要由N端的β折叠和C端的α螺旋结构组成,且2个基因均具有一个P450蛋白结构域（Pfam domain）。荧光定量PCR结果表明,CYP71A26与CYP71B34基因在不同茶树害虫为害的叶片中,分别表现出上调和下调表达的现象。而在冷热环境下,CYP71A26与CYP71B34基因分别表现出下调和上调表达的现象。表明茶树CYP71A26与CYP71B34基因均参与了生物（害虫）与非生物（温度）的胁迫响应,但两个基因表达相反,参与环节可能相反。     

茶树小G蛋白CsRAC5基因的克隆与低温胁迫下的表达分析

小G蛋白是一类重要的信号转导蛋白,参与植物的各项生命活动,但目前在茶树中的研究尚少。本研究以茶树品种龙井长叶为实验材料,克隆获得1个小G蛋白基因,命名为CsRAC5。序列分析显示,CsRAC5含有597βbp,编码198个氨基酸,具有Rho蛋白的保守结构域;序列多重比对发现,该序列与其他物种序列的一致性高达95.96%。CsRAC5蛋白质的相对分子质量为21.79βkDa,为亲水性蛋白;烟草瞬时表达实验显示,CsRAC5定位于细胞膜和细胞核中。荧光定量PCR结果显示,CsRAC5在茶树中的表达具有明显的组织特异性,其中在叶片中的表达最高,在花粉中的表达最低;低温（4℃）胁迫抑制茶树叶片中CsRAC5的表达。     

茶树CsMDHAR基因的克隆与非生物胁迫响应分析

基于茶树转录组数据,以龙井43茶树cDNA为模板,克隆得到开放阅读框（ORF）长度为1β305βbp,编码434个氨基酸的茶树单脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为CsMDHAR。蛋白序列特征和基因表达模式分析表明,CsMDHAR蛋白含有FAD结合功能域,属于FAD依赖的吡啶核苷酸-硫基氧化还原酶（Pyr-redox-2）家族。该蛋白有两个无序化区域,而且包含有32个磷酸化位点,理论相对分子量为47.21βkDa,pI为5.99,属于亲水性蛋白;CsMDHAR蛋白二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。通过PlantCARE和PLACE对启动子上游调控元件进行分析预测,结果显示,CsMDHAR基因启动子上游1β000βbp中含有多个与光、激素以及植物抗逆有关的顺式作用元件。利用荧光定量PCR方法检测龙井43和迎霜的CsMDHAR、CsAO和CsAPX在4种不同非生物胁迫下的表达水平,结果表明,在低温（4℃）胁迫下,两个茶树品种的CsMDHAR、CsAO和CsAPX的表达均受抑制,且品种间的差异较小;在高温（38℃）和干旱（200βg·L^-1 PEG）胁迫下龙井43中的CsMDHAR表达均上调,分别在8βh和2βh时达到最大值,为对照的1.49倍和1.85倍;盐（200βmmol·L^-1 NaCl）胁迫下,CsAO和CsAPX在两种茶树品种中的表达量变化趋势相似,但变化幅度不同,可能与品种间不同的抗逆性有关。     

茶树CsCDF1基因克隆及表达分析

采用SMART-RACE技术克隆了茶树Dof（DNA binding with one finger）基因CsCDF1的全长cDNA序列,并利用在线生物信息学软件对其进行了分析。采用实时荧光定量PCR分析该Dof基因在茶树不同组织间的表达差异和昼夜表达规律,及其在氮饥饿处理2周后对不同浓度氮素诱导的响应。该cDNA序列全长1β606βbp,包含1个编码464个氨基酸的完整开放阅读框,含有高度保守的DOF结构域,推导的蛋白分子量为50.8βkDa,理论等电点（PI）为5.52;其编码的蛋白序列与茸毛烟草、马铃薯和美花烟草的CDF蛋白（Cycling dof factor）相似性分别为69%、67%、68%。系统发育分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥CDF蛋白聚为一类,因此将其命名为CsCDF1;CsCDF1在3个不同茶树品种根系中的表达量均高于一芽二叶和成熟叶;在一天中,该基因的表达呈现出昼夜节律变化;在氮饥饿后重新供氮,不同组织中该基因对不同浓度氮素的响应均为上调。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

茶树CsMYB基因启动子的克隆与功能分析

以茶树新品系“1005”嫩芽为材料,克隆得到CsMYB基因gDNA全长序列1β828βbp,通过染色体步移技术,分离得到CsMYB基因启动子片段1β038βbp,命名为proMYB。生物信息学分析表明,CsMYB gDNA由2个内含子和3个外显子组成,该启动子含有与提高基因转录水平相关的5′UTR Py-rich stretch顺式作用元件、启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还存在有激素响应元件、光响应元件、逆境应答元件以及大量功能未知或功能特异的顺式作用元件,说明proMYB具有诱导型启动子特性,CsMYB基因在茶树植物体中可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号传导;通过烟草的瞬时表达结果表明,该启动子能驱动下游基因表达,具有启动子活性。     

茶树PPO基因家族的鉴定与分析

多酚氧化酶（Polyphenol oxidases,PPO）是由核酸编码的一种以氧为受体的含铜金属酶,为一种末端氧化酶,在茶叶加工中也发挥重要的作用。从最新发布的茶树基因组数据库中获得了5条PPO基因：CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3、CsPPO4（GenBank登录号为GQ129142.1）、CsPPO5。本研究利用生物信息学方法,对5条基因的核酸序列和氨基酸序列进行分析,并对基因编码蛋白的理化性质和结构功能进行预测。结果表明,5个基因CDS区全长在597~1β839βbp之间,编码氨基酸数目198~612;系统进化树分析显示CsPPO1、CsPPO3、CsPPO4和CsPPO5具有较近的亲缘关系;编码的蛋白均属于亲水性不稳定类脂类结合蛋白,都不具有信号肽;无规则卷曲是蛋白质的主要结构元件,α-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中,CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3可能存在一个或多个跨膜螺旋;5个蛋白均含有PPO1_DWL（pfam12142）保守结构域,除了CsPPO2外,其余4个蛋白均预测到TYROSINASE功能结构域。实时定量PCR结果表明,PPOs基因在不同茶树品种间呈现出不同的表达模式。     

茶多酚诱导铜绿假单胞菌交叉耐受性研究

检测了亚致死浓度的茶多酚（Tea Polyphenols,TP）处理对铜绿假单胞菌交叉耐受性的诱导作用。铜绿假单胞菌暴露于1βmg·mL^-1茶多酚1βh后能够显著增强细菌对多种环境条件的耐受性,包括氧化剂（1βmmol·L^-1 H₂O₂）、高温（47℃）,及酸性溶液[磷酸缓冲液（pH4.0）、含有有机酸（60βmmol·L^-1柠檬酸、60βmmol·L^-1乳酸、80βmmol·L^-1乙酸）的磷酸缓冲液（pH4.0）]。另外,通过荧光定量RT-PCR技术分析了茶多酚诱导下铜绿假单胞菌胁迫相关基因的表达情况。研究发现,茶多酚能够显著诱导铜绿假单胞菌氧化胁迫相关基因katB、sodM、ohr、lexA和recN的表达,以及热激蛋白基因dnaK、groEL、htpG、grpE和groES的表达。这些胁迫相关基因的表达很可能在细菌交叉耐受性形成过程中起到重要作用。以上研究结果表明,虽然茶多酚作为天然食品添加剂具有较高的安全性,但在实际应用过程中应充分考虑茶多酚诱导细菌交叉耐受性所导致的潜在风险,以优化食品保鲜策略。     

自然低温对茶树内源激素含量的影响

以南京中山陵茶园中十年生龙井长叶茶树为试验材料,用酶联免疫法(ELISA)测定自然低温下茶树叶片内源激素含量的变化,以探讨自然低温下茶树内源激素变化规律。结果显示,自然越冬期间,茶树叶片中吲哚乙酸(IAA)含量的波动幅度最大,脱落酸(ABA)次之,而赤霉素(GA_3)与玉米素核苷(ZR)波动幅度较小;同时,除了ABA外,茶树其他内源激素IAA、ZR和GA_3含量变化趋势一致;激素间比值变化和相关性分析显示ZR与GA_3、ZR与IAA、IAA与GA_3含量变化极显著相关,ABA与IAA、ABA与ZR呈显著正相关。试验结果表明,茶树内源激素之间关系密切,茶树可能通过调控ABA/(GA_3+IAA+ZR)的比值来适应自然低温环境。     

茶园芽孢杆菌QM7促生特性及耐酸铝机制初步研究

目前含芽孢杆菌等微生物制剂的有机肥料在酸性茶园土壤中的生物活性不高,难以起到有效的促生作用,达到部分替代和减少化肥使用量的目的。本实验分离得到1株耐酸铝芽孢杆菌,命名为QM7。试验发现菌株促生能力受到铝离子浓度的影响,在无铝条件下菌株生长素(IAA)的分泌量为85.6 mg·L~(-1),当铝离子浓度为1 mmol·L~(-1)时IAA分泌量为36.8 mg·L~(-1);盆栽结果表明,在6周内菌株可以增加茶苗根系表面积56.8%,根尖数27.3%;蛋白电泳分析发现高浓度的铝胁迫会导致菌株胞内64种与转录、翻译和代谢相关蛋白的表达发生差异,使得菌株生长受到抑制。     

合理密植下强分蘖甘蔗品种性状及产量分析

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是以收获茎秆为主的重要糖料作物,分蘖是增加有效茎进而提高甘蔗单产和产糖量的关键。本研究以强分蘖甘蔗品种‘B9’为试验材料,设置4个不同种植密度(P1:4000芽/667 m^2、P2:6000芽/667 m^2、P3:8000芽/667 m^2和P4:10 000芽/667 m^2),通过1年新植和1年宿根的田间小区试验,探讨种植密度对强分蘖甘蔗品种性状及产量形成的影响,并分析它们之间的相关关系。结果表明:增加种植密度,新植和宿根甘蔗分蘖盛期的总苗数呈上升趋势,但新植与宿根甘蔗总苗数的差异却在缩小,平均分别为25.55%、14.11%、-8.18%和-10.57%;宿根蔗株高显著大于新植蔗的株高,平均增幅分别为17.31%、10.54%、19.44%、14.88%,但茎径几乎不受种植密度的影响;新植蔗有效茎和产量随种植密度增加而增加(P2的除外),且多于宿根蔗的,但其产量却表现相反的结果,即宿根蔗总体表现增产;低密度(P1)和高密度(P4)间的锤度差异显著,并表现降低趋势。在试验条件下甘蔗产量形成过程中,种植密度与甘蔗分蘖盛期的总苗数、株高、有效茎和产量呈正相关,与茎径和田间锤度为负相关,且株高与有效茎对产量的贡献最为显著,但过多的有效茎明显不利于田间锤度提高。因此,这意味着合理密植对强分蘖甘蔗品种的产量和品质形成极其重要。     

杧果花期内源激素含量的变化

对白玉杧和泰国金白花2个品种杧果在花芽膨大期、初花期、盛花期和末花期的内源激素脱落酸（ABA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）和玉米素核苷（ZRs）的含量进行了研究。结果表明：花芽膨大期金白花中ABA和LAA含量高于白玉杧,而白玉杧中GA3和ZRs含量高于金白花杧;初花期白玉杧中ABA和GA3含量高于金白花杧,而IAA和ZRs含量则低于金白花杧;盛花期白玉杧中ABA,IAA和GA3含量低于金白花杧,而ZRs含量高于金白花杧;末花期白玉杧中ABA,LAA,GA3和ZRs含量均低于金白花杧。     

In vitro regeneration from petiole explants of non-toxic Jatropha curcas

Jatropha curcas, a multipurpose shrub has acquired significant economic potential as biodiesel plant. The seeds or pressed cake is toxic due to the presence of toxic substances and is not useful as food/fodder despite having the best protein composition. A simple, efficient, and reproducible method for plant regeneration through direct organogenesis from petiole explants of non-toxic J. curcas was developed using Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with different concentrations of thidiazuron (TDZ). The best induction of shoot buds (57.61%), and number of shoot buds (4.98) per explant were obtained when in vitro petiole explants were placed horizontally on MS medium supplemented with 2.27 μM TDZ. The Induced shoot buds were transferred to MS medium containing 10 μM kinetin (Kn), 4.5 μM 6-benzyl aminopurine (BA), and 5.5 μM α-naphthaleneacetic acid (NAA) for shoot proliferation and subsequent elongation was achieved on MS medium supplemented with 2.25 μM BA and 8.5 μM IAA. The elongated shoots could be rooted on half-strength MS medium with 15 μM IBA, 11.4 μM IAA and 5.5 μM NAA with more than 90% survival rate.     

水稻蜡质稀少突变体wax1的鉴定及基因定位

【目的】蜡质是植物表面的一种重要保护物质，筛选和鉴定水稻蜡质相关突变体有助于解析水稻蜡质形成的遗传机制。【方法】利用EMS诱变籼稻品种湘早籼6号，从突变体库中筛选出一个蜡质稀少的突变体wax1，考查突变体的形态特征和农艺性状，利用突变体与02428杂交的F2群体定位目标基因，并通过荧光定量PCR分析相关基因的表达情况。【结果】与野生型相比，wax1突变体具有叶片短小皱褶、叶表面蜡质晶体减少、穗长变短等形态特征；在农艺性状方面，突变体的株高、每穗总粒数和千粒重显著降低，但有效穗数显著高于野生型；遗传分析表明，wax1的突变表型受一对隐性核基因控制，将WAX1基因定位在第10染色体上SSR标记RM5806与InDel标记P1之间，物理距离约为49.8 kb；定位区间内的测序结果表明，突变体中β-酮脂酰-CoA合酶的编码基因发生单碱基突变，导致催化活性中心的一个氨基酸发生改变。WAX1基因的突变显著提高了同源异型盒基因OSH6的表达，同时引起部分IAA基因的差异表达。【结论】WAX1基因突变引起叶表面蜡质晶体的减少，同时通过影响茎尖分生组织和生长素的信号转导引起植株生长发育等多方面的异常。     

芝麻显性细胞核雄性不育系内源激素、可溶性多糖及淀粉含量的变化

植物激素在花药发育过程中具有重要的调控作用。利用酶联免疫检测技术（ELISA）,测定了芝麻显性细胞核雄性不育系叶片和花蕾中生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）以及水杨酸（SA）含量的动态变化,分析了不同内源激素的平衡关系,同时比较了不育和可育株间的可溶性糖和淀粉含量差异。研究结果表明：1）在整个花药发育时期,不育株和可育株中的4种内源激素含量变化趋势明显不同,且含量高低差异明显;IAA含量的降低及ABA含量的提高可能与芝麻雄性不育的发生密切相关;2）不育株叶片中的IAA含量显著下降,JA和ABA显著上升;3）IAA/ABA、IAA/SA和IAA/JA在不育株和可育株间的变化趋势不一致,且大小差异很大,表明4种内源激素之间平衡关系受到破坏可能会影响到花蕾的正常生长发育;4）不育系花蕾中的可溶性糖含量、淀粉含量盈余,可能是导致雄性败育的原因之一。      

玉米光温敏无雄穗系植株多种植物激素含量的动态变化

以玉米光温敏无雄穗系I17及其正常系N17植株为试验材料,在春季和秋季种植条件下分别测定叶片与雄穗中生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)和玉米素(ZT)的含量,研究植物激素对玉米光温敏无雄穗系植株雄穗发生及其育性的影响。结果表明,春季种植的无雄穗系I17与正常系N17的叶片和雄穗中IAA、GA3、ZT和ABA含量没有明显差异;秋季种植的无雄穗系I17叶片中IAA、GA3和ZT含量在苗期、抽雄期及花粒期均显著低于正常系N17,ABA含量显著高于N17。在植物激素平衡方面,秋季种植的无雄穗系I17叶片中IAA/ABA、GA3/ABA及ZT/ABA的比值均显著低于正常系N17的相应值。IAA、GA3和ZT的严重亏损与ABA的过量积累是引起玉米无雄穗的重要原因之一。     

植物生长物质冠菌素诱导旱稻、水稻幼苗抗旱性的效应及生理机制

以旱稻 297 和水稻越富幼苗为材料,在 20% PEG 模拟干旱条件下,研究了植物生长物质冠菌素处理对叶片水分状况、质膜透性、渗透调节物质（脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白）及内源激素（ABA、IAA 和GA3）含量的影响。干旱胁迫下,冠菌素处理可以维持旱稻 297（0.01 μmol/L）和越富（0.1 μmol/L）较高的叶片相对含水量,促进幼苗叶片中脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的积累,降低质膜透性,维持细胞质膜的完整性;同时,冠菌素（0.01 和0.1 μmol/L）处理明显促进旱稻 297 和越富幼苗叶片中ABA的积累,并改变了 IAA 和GA3 的浓度及比例。冠菌素处理能改善旱稻和水稻幼苗耐干旱胁迫的能力,最适浓度分别为0.01 μmol/L和0.1 μmol/L。     

水稻蜡质稀少突变体wax1的鉴定及基因定位

【目的】 蜡质是植物表面的一种重要保护物质,筛选和鉴定水稻蜡质相关突变体有助于解析水稻蜡质形成的遗传机制。【方法】利用EMS诱变籼稻品种湘早籼6号,从突变体库中筛选出一个蜡质稀少的突变体wax1,考查突变体的形态特征和农艺性状,利用突变体与02428杂交的F₂群体定位目标基因,并通过荧光定量PCR分析相关基因的表达情况。【结果】与野生型相比,wax1突变体具有叶片短小皱褶、叶表面蜡质晶体减少、穗长变短等形态特征;在农艺性状方面,突变体的株高、每穗总粒数和千粒重显著降低,但有效穗数显著高于野生型;遗传分析表明,wax1的突变表型受一对隐性核基因控制,将WAX1基因定位在第10染色体上SSR标记RM5806与InDel标记P1之间,物理距离约为49.8 kb;定位区间内的测序结果表明,突变体中β-酮脂酰-CoA合酶的编码基因发生单碱基突变,导致催化活性中心的一个氨基酸发生改变。WAX1基因的突变显著提高了同源异型盒基因OSH6的表达,同时引起部分IAA基因的差异表达。【结论】WAX1基因突变引起叶表面蜡质晶体的减少,同时通过影响茎尖分生组织和生长素的信号转导引起植株生长发育等多方面的异常。