枇杷脱水素基因EjDHN5抗低温胁迫功能研究

为研究枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)脱水素基因(Ej DHN5)在枇杷抗低温胁迫中的功能,将其在烟草中进行过量表达,其中表达水平比较高的两个株系L24和L26被用来进行功能研究。野生型和转基因烟草苗分别用0、2、4和8μmol·L~(-1)的甲基紫精(Methyl viologen,自由基发生剂)处理并进行光照培养,结果显示,4和8μmol·L~(-1)甲基紫精处理使野生型烟草苗存活率分别下降到73.6%和56.9%,光系统Ⅱ(PSⅡ)活性显著降低,而转基因苗的存活率仍维持在100%,PSⅡ活性明显高于野生型。对六叶期烟草的叶盘进行甲基紫精处理,野生型烟草叶盘的叶绿素含量显著低于转基因株系,而活性氧含量和MDA含量明显高于转基因株系。对野生型和转基因烟草苗进行低温处理,转基因株系生长状况明显优于野生型,活性氧含量低于野生型,膜质过氧化程度轻于野生型。这些结果表明,过量表达EjDHN5能提高烟草的抗氧化胁迫和抗低温胁迫能力,推测EjDHN5在提高枇杷抗低温能力方面起着重要作用可能与其能提高抗氧化胁迫能力有关。     

转沙冬青锌指蛋白基因AmZFPG 烟草非生物胁迫抗性分析

 分析了沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）锌指蛋白基因AmZFPG 在非生物胁迫下的表达 特性,结果显示AmZFPG 受低温、干旱、高盐胁迫诱导表达,表明该蛋白参与多种胁迫相关的信号转导 和应答反应。为进一步探索AmZFPG 的功能,构建了真核表达载体AmZFPG-pCAMBIA2300,将该基因 转入烟草（Nicotiana tabacum L.）,对转基因烟草T1 代进行非生物胁迫分析,结果显示,转基因烟草的耐 寒性、耐旱性、耐盐性均获得了提高。     

苹果MdMYB121基因异位表达提高烟草的抗逆性

 苹果MdMYB121（序列号MDP0000196982）蛋白具有典型的R2R3MYB结构域,半定量RT-PCR检测发现,MdMYB121表达能被多种非生物胁迫和逆境相关激素不同程度地诱导。采用RT-PCR技术克隆出该基因的全长cDNA,构建其表达载体并侵染烟草,获得转基因植株。表型分析发现,与野生型对照相比,转基因烟草的种子萌发对盐胁迫不敏感,幼苗的抗盐性也得到明显提高;相对于野生型幼苗,转基因幼苗生长对水杨酸（SA）处理不敏感,根和茎较长,侧根更多。转基因烟草植株对高盐、干旱和低温的抗性比野生型对照明显提高。表明MdMYB121能够响应非生物胁迫,在植物抵抗非生物胁迫中具有重要功能。     

番茄转ER-sHSP基因植株构建及其抗冷性研究

 将CaMV 35S启动子驱动的内质网小分子热激蛋白基因导入番茄, 比较转基因、未转基因和转空载体番茄的抗冷能力。冷胁迫下, 同对照相比, 转基因番茄的冷害症状轻, 叶绿素含量的损失少, 体内积累的丙二醛(MDA) 含量少, 电解质外渗程度低, 具有较高的净光合速率和最大光化学效率, 并易于恢复由低温所引起的光抑制, 表明转基因番茄具有较强的冷胁迫耐性, 说明内质网小分子热激蛋白在植物抗冷过程中发挥重要作用。     

过表达香樟CcCBFb的烟草非生物胁迫抗性增强

为探究香樟Cc CBFb基因增强植株非生物胁迫抗性的功能,通过农杆菌介导法将该基因转入烟草中,经PCR和半定量RT-PCR技术鉴定阳性转基因株系后,对获得的T1代转基因无性系(T2和T4株系)以及野生型(WT)进行干旱(0、150、300和450 mmol·L~(-1)的甘露醇)、高盐(0、100、200和300 mmol·L~(-1)的Na Cl)、4℃低温、–4℃冰冻胁迫处理,结果显示:转基因烟草在干旱和高盐胁迫下,幼苗的存活率均高于野生型;经4℃低温处理后,转基因烟草植株的脯氨酸和可溶性糖含量均显著高于野生型植株,而丙二醛(MDA)含量均低于野生型植株;经–4℃的冰冻处理6 h后,野生型和转基因T4株系植株叶片均出现不同程度的萎蔫,而转基因T2株系植株未出现不良现象。由此可见,过表达CcCBFb基因不但能够增强烟草的抗旱和抗盐性,而且能够显著增强抗寒性。     

菠萝AcZFP1的克隆及其在低温胁迫下的功能分析

以‘神湾’菠萝为材料,克隆了1个C2H2型锌指蛋白基因,命名为AcZFP1,其开放阅读框为816bp,编码271个氨基酸,含有2个典型的锌指蛋白结构域。进化树分析表明AcZFP1与水稻Os ZFP252和OsMSR15的亲缘关系最近。基因表达分析发现,AcZFP1受低温、NaCl和聚乙二醇（PEG）干旱等多种逆境胁迫及外源ABA、SA和MeJA的诱导。试验表明,AcZFP1蛋白定位于细胞核中。AcZFP1过表达的拟南芥株系在低温处理后相比野生型对照有更高的成活率和Fv/Fm值,可溶性蛋白含量增加,SOD、POD酶活增强,MDA含量降低,植株的耐寒性显著增强。进一步的qRT-PCR分析显示,AcZFP1可以促进AtRD29A、AtCOR47等4个典型的拟南芥内源冷应答基因的表达,在低温胁迫中发挥正调控作用。     

火龙果DREB1D基因的克隆及在转基因拟南芥中的功能分析

【目的】DREB(dehydration responsive element binding)是一类脱水响应元件结合蛋白，在植物响应高温、干旱、高盐和低温等多种非生物胁迫过程中发挥关键作用。以紫红龙火龙果（Hylocereus monacanthus）为材料，克隆得到DREB转录因子，并命名为HmDREB1D(HU02G01866.1)，探究其生物学功能。【方法】构建HmDREB1D基因植物过表达载体，通过亚细胞定位分析HmDREB1D基因在细胞中的位置。异源转化拟南芥，对T3代纯合系转基因拟南芥（OE3、OE4、OE5）进行生物学功能验证。【结果】火龙果HmDREB1D基因的开放阅读框全长723 bp，产生的蛋白定位于细胞核内，属DREB1s亚家族，具有典型的AP2结构域。将HmDREB1D基因转化至拟南芥获得超表达转基因株系，与野生型相比，转基因株系表现出较高的抗逆性。在干旱胁迫下，转基因植株T3代纯合系种子的萌发率高于野生型。转基因植株的叶片在逆境胁迫下表现出更低的电导率及更高的保护性酶活性。实时荧光定量PCR分析显示，RD20、HSP70和COR15A等逆境胁迫响应基因在Hm...     

GMPase超表达对番茄植株抗坏血酸含量及耐冷性相关生理指标的影响

 采用农杆菌介导法获得了GDP–D–甘露糖焦磷酸化酶基因（GMPase）超表达的转基因番茄植株,并且采用Western blot检测到有两株GMPase蛋白表达显著增加。比较了这两个株系和野生型植株中抗坏血酸含量及耐低温能力。与野生型番茄相比,GMPase超表达在常温及低温胁迫下均使GMPase活性提高,使AsA和DHA含量显著增加,降低了低温胁迫下膜脂过氧化产物MDA的积累。     

氯化钠模拟盐胁迫对沙冬青种子萌发和幼苗生长的影响

以沙冬青种子为试材,采用恒温培养法研究了不同浓度NaCl(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mmol/L)对沙冬青种子萌发及幼苗生长的影响,并观察了萌发恢复率。结果表明:在NaCl模拟盐胁迫下,沙冬青种子萌发率与NaCl浓度呈极显著负相关(R2=0.9602),NaCl浓度低于30mmol/L时,对沙冬青种子的萌发影响较小,其中10mmol/L NaCl能提高沙冬青种子萌发率,而高于80mmol/L浓度的NaCl对种子萌发、幼苗鲜重和胚根生长均产生抑制作用。沙冬青幼苗根长、地上部分鲜重、根鲜重以及根冠比随NaCl浓度的增加呈下降趋势;可溶性糖含量、脯氨酸含量、保护性酶(POD、SOD)活性随NaCl浓度的增加表现为先增加后降低趋势;种子浸提液丙二醛(MDA)含量和CAT活性随NaCl浓度的增加逐渐上升;幼苗根系活力(TTC)与NaCl溶液浓度呈单峰曲线,在30mmol/L出现峰值。解除胁迫条件,不同NaCl处理沙冬青种子复水萌发率平均达15.8%,复200mg/L赤霉素萌发率平均达23.1%。综合来看,沙冬青种子恢复萌发率与NaCl浓度之间呈极显著负相关,表明一定浓度盐胁迫下沙冬青种子仍具有较高的萌发潜力和抗盐特性,但过高浓度的NaCl导致沙冬青种子失活。     

拟南芥耐寒基因AtCOR15a在番茄中异源表达增强其耐寒性

拟南芥耐寒基因AtCOR15a由冷诱导启动子RD29A控制后,重组进双元表达载体,经根癌农杆菌介导,将该基因导入‘Ailsa Craig’番茄。研究发现,筛选出的3个高表达转基因株系的耐寒性比野生型显著增强;外源基因AtCOR15a的表达量在低温处理过程中呈现先增后降的变化趋势,且在处理6h达到最大值;在冷胁迫下,该基因的表达促进了转基因植株中SlDehydrin-like(Sl DEHL)和SlDehydrin Ci7(SlCi7)等内源冷诱导基因的表达,降低了细胞膜透性和丙二醛(MDA)含量,减少了活性氧H_2O_2和O_2~.的积累,增强了超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等活性氧清除酶的活性,提高了游离脯氨酸含量。因此,AtCOR15a异源表达能够显著增强转基因番茄的耐寒性。     

柿花发育相关的MADS2box基因克隆与表达

以雌花型柿(Diospyros kaki) ‘阳丰’花为试材, 克隆得到一个与其花发育相关的MADS2box基因, 命名为DkMADS1, GenBank登录号为DQ412058。该基因cDNA全长1 193 bp, ORF为747 bp, 编码一个含有249个氨基酸的蛋白。DkMADS1 具保守的MADS区及半保守的K区, 与其它植物中的MADS2box蛋白有很高同源性。RT-PCR表达分析表明, 该基因在‘阳丰’花的萼片、花瓣、子房和‘禅寺丸’的雄蕊中均有表达。     

一个中国水仙MADS-box基因的克隆与分析

 采用RT-PCR技术从中国水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）幼嫩花蕾中分离到一个新的水仙花发育相关MADS-box基因,命名为NTMADS1（GenBank登记号：EF421828）。该基因长879 bp,编码区共编码230个氨基酸,具有典型的植物MADS-box基因结构,由MADS区、I区、K区和C末端组成。序列分析结果表明,NTMADS1编码的蛋白与其它植物的MADS-box蛋白有着较高的一致性,其中与扫状天门冬（Asparagus virgatus）的AVAG1的一致性高达89％。系统进化树分析表明NTMADS1属于AG亚族。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

茎瘤芥AP2/EREBP 转录因子基因BjABR1 的克隆和表达分析

 以茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）‘永安’为材料,通过RACE 和RT-PCR 技术得到1 个AP2/EREBP 转录因子基因的cDNA 全长序列和基因组DNA（gDNA）序列,该基因与拟南 芥AtABR1 基因的氨基酸序列相似性高达72%,因此命名为BjABR1（GenBank 登录号：JQ713825.1）。BjABR1 基因gDNA 序列含1 个内含子;cDNA 序列全长1 514 bp,含有1 个1 146 bp 的开放阅读框（ORF）,编 码381 个氨基酸;其推定编码的蛋白分子量为41.674 kD,等电点为9.11,具有14 个磷酸化位点,含1 个典型的AP2 DNA 结合域和1 个CMX-1 基序。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,BjABR1 蛋白定位于细 胞核。荧光定量PCR 分析结果表明,该基因在茎瘤芥不同发育时期的根、茎、叶中均有表达,但在根中 表达量极高;在对茎瘤芥组培幼苗进行高盐、渗透压和低温3 种非生物胁迫处理后发现,3 种胁迫均能诱 导该基因表达,但其对高盐的响应更为迅速。     

中国芦荟AlDREB2基因的克隆及其胁迫表达

 为了研究中国芦荟的抗逆机理, 以cDNA为模板, 利用3′RACE和PCR扩增方法, 克隆得到了一个编码DREB蛋白的基因, 命名为AlDREB2, GenBank登录号为FJ560460。其cDNA序列全长为886bp, 包含一个636 bp的开放阅读框, 推导编码的氨基酸序列(212个氨基酸) 与库拉索芦荟AlDREB1的序列相似性很高。进化树分析结果将AlDREB2 归入DREB 亚家族中A26亚组。利用RT-PCR 技术分析了AlDREB2 基因的表达与胁迫的关系, 表明AlDREB2 基因在非生物胁迫与生物胁迫中能够被不同程度诱导表达。     

中国芦荟AIDREB2基因的克隆及其胁迫表达

为了研究中国芦荟的抗逆机理,以cDNA为模板,利用3'RACE和PCR扩增方法,克隆得到了一个编码DREB蛋白的基因,命名为AlDREB2,GenBank登录号为FJ560460.其cDNA序列全长为886bp,包含一个636 bp的开放阅读框,推导编码的氨基酸序列(212个氨基酸)与库拉索芦荟AlDREBI的序列相似性很高.进化树分析结果将AlDREB2归入DREB亚家族中A-6亚组.利用RT-PCR技术分析了AlDREB2基因的表达与胁迫的关系,表明AlDREB2基因在非生物胁迫与生物胁迫中能够被不同程度诱导表达.     

低温胁迫下龙眼碳酸酐酶基因（CA）的克隆与表达分析

 应用蛋白质组学研究低温胁迫下龙眼叶片蛋白质组变化时发现碳酸酐酶（CA）蛋白下调表达。利用RT-PCR方法克隆CA基因的全长cDNA,GenBank登录号JN033201,长度为1 119 bp,包括1个966 bp的开放阅读框,编码321 bp的氨基酸序列,同源性分析表明,12个不同植物同源性为81% ~ 88%。龙眼CA基因具有典型的CA结构域,并且非常保守。实时荧光定量分析结果表明,CA在龙眼根、茎、叶中都有表达,为组成型表达,在叶中的表达量最高,茎和根中的表达量最少。CA基因在低温胁迫下随着低温胁迫时间的延长而发生变化。将CA在大肠杆菌中表达,获得1个约40.5 kD的外源蛋白。推测CA表达与低温胁迫有关。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。