miRNA在调节植物抗逆等生理功能中的作用

植物microRNA（miRNA）是一类约21-24个核苷酸组成的小分子RNA。在细胞核中将非编码的茎环结构的单链RNA前体（pri-miRNA）加工成miRNA/miRNA＊双链,然后运到细胞质中解开双链。成熟的miRNA通过形成miRNA诱导的沉默复合物（miRNA-induced silencing complex,miRISC）与靶标mRNA互补配对结合,并对其进行剪切或抑制翻译,实现对靶标基因的负调控。miRNA在抗逆反应、植物发育、信号转导等方面起着重要作用。     

植物MicroRNA研究进展

MicroRNA,简称miRNA,是一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码小分子RNA,在生物发育过程中起着重要作用。笔者详细介绍了植物miRNA的发现与形成过程,包括转录、加工成熟及功能复合体装配3个主要步骤。分析了miRNA在植物生长发育、胁迫适应及自身形成途径三方面的调控作用。     

ceRNA对植物纤维素形成的调控研究进展

植物纤维素的形成是由多个基因参与且呈网络调控。通过对纤维素形成过程中的关键酶基因、转录因子以及ceRNA研究的阐述,深入了解纤维素生物合成调控机制。综述植物纤维素形成过程中的纤维素合酶、蔗糖合成酶、MYB等重要基因以及lncRNA、miRNA、circRNA类ceRNA,阐述其复杂的分子调控网络,以期解析植物纤维素形成过程中的分子调控机制,深入了解植物纤维素形成过程。     

松材线虫侵染下马尾松针叶miRNA和mRNA的关联表达

[目的]微小RNA(microRNA,miRNA)具有靶向沉默信使RNA(mRNA)表达的功能,是基因表达的负调控因子;研究并明确马尾松在遭受松材线虫侵染下是否存类似的调控模式,对于未来探析寄主植物对病原侵染胁迫下的应激机制及获得调控马尾松抗松材线虫病的miRNA及其靶标mRNA都具有重要意义。[方法]以前期高通量测序获得的松材线虫侵染1、2、3 d的马尾松针叶mRNA和miRNA表达谱为研究对象,采用STEM软件分别分析mRNA和miRNA的表达变化模式,并运用斯皮尔曼等级相关法研究松材线虫侵染下的马尾松针叶中miRNA与mRNA的表达关联情况。[结果]松材线虫侵染下的马尾松针叶中的miRNA呈2种显著的表达变化模式,mRNA呈8种显著的表达变化模式,且15个miRNA与其12个靶标mRNA的表达变化模式相反,符合miRNA对靶标mRNA的负调控特点,这些靶标mRNA编码具有识别病原作用的ACRE、CC-NBS-LRR基因等。[结论]松材线虫侵染下的马尾松针叶中miRNA及mRNA均呈多种表达变化模式,且部分miRNA与靶标mRNA的表达变化模式相反,推测其中部分miRNA可能是病原识别基因的负调控因子。     

基于硝态氮或铵态氮条件下杨树根尖miRNAs特征分析

[目的 ]通过小RNAs高通量测序技术,在硝态氮或铵态氮处理下,对杨树根尖差异表达miRNAs及其靶基因调控机制进行了研究,分析和描述了杨树根尖生长和形态特征的规律,为进一步筛选和鉴定硝态氮或铵态氮吸收利用效率高的林木新品种提供依据。[方法 ]以灰杨水培苗根尖为研究对象,应用高通量测序技术进行小RNA文库构建,获得miRNAs表达谱,鉴定差异表达miRNAs,同时利用降解组测序技术鉴定miRNAs靶基因,并对差异表达靶基因进行功能注释以及代谢通路富集等分析。最后通过联合分析,阐明不同氮形态处理下,灰杨根尖miRNA-靶基因调控网络。[结果 ]从2种不同氮形态处理杨树根尖miRNAs文库中鉴定出523个已知miRNAs和42个新miRNAs,其中,有96个miRNAs显著差异表达。与硝态氮处理相比,铵态氮处理下有44个miRNAs上调表达,52个下调表达,其中,vvi-MIR399d-p3_1ss13GA上调倍数最大,新的miRNA PC-5p-35885_222下调最显著。对miRNAs靶基因进行KEGG通路富集分析表明,部分显著差异表达靶基因参与杨树根尖氮响应,从而影响杨树根尖生长发育和形态特征。利用RT-qPCR对7组随机挑选的miRNA-靶基因进行验证,结果与测序数据一致,说明测序结果可靠。[结论 ]miRNAs及其靶基因在不同氮形态处理后对杨树根尖氮响应起着重要的调控作用,从而使硝态氮处理下的灰杨根长比铵态氮处理的几乎长1倍。     

中间锦鸡儿生长发育过程中5个miRNAs及其靶基因的表达模式分析

利用qRT-PCR技术分析了5个miRNAs(cin-miR157a、cin-miR159a、cin-miR165a、cin-miR172b和cin-miR396a)及其靶基因在中间锦鸡儿(Caragana intermedia)不同发育阶段不同器官的表达变化。结果显示,5个miRNAs的表达模式均存在时空特异性,其中cin-miR159a、cin-miR165a、cin-miR172b、cin-miR396a在成年期营养器官中强烈表达,在幼年期和成年期生殖器官中弱表达;cin-miR157a在幼年期和成年期生殖器官中强烈表达,在成年期营养器官中弱表达。除cin-miR159a的靶基因MYB和cin-miR165a的靶基因HD-Zip Ⅲ外,其它被检测的miRNAs靶基因与相应的miRNAs的表达呈现出明显的相互消长的表达模式。该结果表明中间锦鸡儿miRNA可通过调控其靶基因的表达,进而调控发育阶段转变、器官形态建成、细胞分化等生物学过程。研究结果将为中间锦鸡儿的定向改良工作提供理论依据和基因资源。     

MicroRNA转录后调控欧美杨R2R3-MYBs抗锈菌表达

[目的]强致病锈菌亲和型树种欧美杨适合做寄主感病分子机理研究。研究表明转录因子及其调控miRNA在杨树抗/感病过程中起重要的信号传导和调控作用,决定杨树与锈菌的亲和性。为深入研究杨树感病性,对欧美杨R2R3-MYB转录因子及其调控miRNA进行研究。[方法]构建锈菌侵染和未侵染miRNA组、降解组文库和基因表达谱文库,进行高通量测序。对基因表达谱结果进行生物信息学分析鉴定R2R3-MYBs,根据miRNA组和降解组数据确定R2R3-MYBs调控miRNA。应用定量PCR技术鉴定候选R2R3-MYBs和其调控miRNA的表达量。[结果]共鉴定到230个欧美杨R2R3-MYBs,其中55个R2R3-MYBs在锈菌侵染和未侵染叶片间表达量差异显著,其余表达量变化不显著。基于降解组,共鉴定到由22个miRNA调控18个R2R3-MYBs的86个转录后调控关系。定量PCR结果表明PC-3p-2521022_1与Pnd MYB173存在转录后负调控关系。预测的R2R3-MYB靶基因涉及水杨酸、茉莉酸、乙烯和脱落酸等多个植物激素抗性路径。[结论]E4强致病锈菌侵染导致亲和型树种欧美杨23.9%的R2R3-MYBs表达量发生变化,锈菌侵染不但可以影响R2R3-MYBs的表达量,还可以启动或关闭R2R3-MYBs的表达。欧美杨在E4强致病锈菌胁迫条件下,R2R3-MYBs转录后主要受miR159和miR858家族的miRNA调控。     

毛竹笋在快速生长期的木质化调控网络

木本竹因其优质材性而成为传统木材良好的替代品。木质化程度和木质素含量影响着木材材性，然而单子叶植物的木质化调控网络尚不清楚。为了阐明毛竹（Phyllostachys edulis）木质化的分子调控机制，利用转录组、miRNA和降解组测序，并结合实验对竹笋进行综合分析研究。结果表明：木质化程度和木质素含量随笋高度的增加而增加，而苯丙氨酸解氨酶（PAL）和漆酶（LAC）活性则随笋高度的增加表现为先升高后降低。在不同高度笋的代表性节间（第13节）的不同部位中共鉴定了11 504个差异表达基因（DEG），其中与细胞壁和木质素生物合成相关的大部分DEG表达随笋高度上调，而与细胞生长相关的一些DEG表达则下调。通过miRNA测序鉴定出1 502个miRNA，包括已知的1 223个和新鉴定的279个。通过生物信息学预测和降解组分析，共鉴定出691个差异表达的miRNA，共靶向5 756个差异表达基因。据此构建了毛竹笋木质化调控网络，包括11个miRNA、22个转录因子和36个酶基因。另外，根据过表达PeLAC20转基因拟南芥中木质素含量显著增加，提出了一个miRNA介导的‘MYB-PeLAC20’的木质素单体聚合调控模型。研究结果不仅对解析竹子木质素生物合成的调控分子机制具有重要科学价值，而且对理解其他单子叶植物的相关机制具有重要参考价值，有助于制定竹材材性改良策略。     

落叶松体胚发育中12个针叶树特异microRNAs表达分析

以落叶松体细胞胚胎发育8个阶段的材料构建小RNA文库,进行了Solexa测序、miRNA鉴定、靶基因预测、qRT-PCR定量分析等研究。结果表明:发现的87个miRNAs中,29个为针叶树特异的,来自12个家族,分别为miR946、miR947、miR950、miR951、miR1311、miR1312、miR1313、miR1314、miR1316、miR3701、miR3702和miR3704,其中25个长度为22nt,且在小RNA文库中的最低拷贝数为18(miR1311),最高拷贝数为33 009(miR950)。发现12个miRNA家族的34个靶基因可能参与生长发育、抗病、AGO反馈调节等多方面遗传调控;qRT-PCR分析表明:72%miRNAs表达次高峰在后期单胚或早期子叶胚,在中期子叶胚最低,最高峰在后期子叶胚,分别与子叶形成、胚胎后熟、胚胎休眠的生理活动相吻合,而miRNA前体的表达模式不同于miRNA,前体变化幅度小于成熟体。     

辐射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因生物信息分析

利用生物基因组学数据库,对辐射松半胱氨酸OTUBAIN-like基因进行生物信息学分析,预测该基因编码蛋白的理化性质、序列特征、蛋白质结构与生物学功能。结果表明,辐射松半胱氨酸OTUBAIN-like基因编码的蛋白质含294个氨基酸,具有非跨膜结构,含保守的Peptidase_C65结构域,预测其可能在蛋白质的翻译、合成及代谢中对胁迫应答和免疫应答等功能起关键性作用,本研究为辐射松半胱氨酸蛋白酶的OTUBAIN-like基因功能深入研究奠定基础。     

白桦BpGT14基因表达载体及RNA干扰载体的构建

糖基转移酶基因是生物分子糖基化中的关键基因,已有研究表明少数糖基转移酶14(Glycosyltransferase14,GT14)家族基因在植物细胞壁合成及对逆境的响应中发挥重要的生物学功能,然而GT14基因对逆境的响应机制目前仍不清楚。为了研究糖基转移酶基因的生物学功能,本实验室在克隆了白桦Bp GT14基因(JQ409354)编码区序列全长的基础上,利用Bam HⅠ单酶切的方法构建了白桦Bp GT14基因的p BI121植物表达载体,并利用一步PCR之后在同一体系中同时酶切-连接的方法,构建了Bp GT14基因RNA干扰载体,相比于传统的RNA干扰载体构建方法更为高效快捷。测序结果表明,植物表达载体及RNA干扰载体均构建成功。本研究的完成,为Bp GT14基因进一步的遗传转化及转基因植株的获得奠定了基础,同时为今后植物表达载体的构建提供了高效便捷的参考方法。     

过表达C2H2型锌指蛋白基因PdbZFP26提高山新杨耐盐性

【目的】土壤盐渍化是制约农林资源生产力的主要因素之一。为适应环境，植物会通过启动基因表达及生理和形态结构的变化来减缓盐害。越来越多的研究表明，C2H2型锌指蛋白在植物应答盐胁迫调控网络中扮演重要角色。迄今，关于植物C2H2锌指蛋白生物学功能的研究集中于植物特有的Q型，而对于非Q型C2H2锌指蛋白的认识非常有限。前人从毛果杨中鉴定到109个C2H2锌指蛋白的编码基因PtrZFPs,其中62个编码的蛋白为非Q型锌指蛋白。鉴定、解析耐盐相关C2H2锌指蛋白基因的功能将为深入理解植物应对非生物胁迫的分子机制提供重要资料。通过分析过表达PdbZFP26转基因山新杨的表型以鉴定其功能，本文以期为山新杨抗盐遗传改良提供优良资源及理论基础。【方法】本研究利用实时定量PCR方法分析PdbZFP26的组织器官表达模式及对非生物胁迫和植物激素的响应模式；利用叶盘转化法获得过表达PdbZFP26转基因山新杨，观察转基因和对照株系在盐胁迫处理前后的长势，测定其抗逆生理指标，比较不同株系对盐胁迫的耐受能力。【结果】基于前期表达谱数据分析，从山新杨茎中筛选到一个受盐胁迫诱导表达的C2H2锌指蛋白基因PdbZFP26...     

毛竹PeMADS1基因的克隆及转化拟南芥初步研究

采用RT-PCR和RACE技术,从毛竹中分离到1个含完整的编码区和5′端非翻译区的cDNA,长776bp,编码240个氨基酸,命名为PeMADS1(GenBank登记号:EU327784)。序列分析表明,该基因具有典型的植物MADS-box基因结构,与拟南芥的E类功能基因AGL6编码蛋白的一致性为57.2%。将PeMADS1基因置于CaMV35S启动子控制下,构建PeMADS1基因植物表达载体。应用农杆菌介导将目的基因转入拟南芥,RT-PCR证实PeMADS1基因得到异位表达。转基因拟南芥呈现开花提早、莲座叶卷曲、发育迟缓等表型,表明PeMADS1可能参与毛竹由营养生长转向生殖生长的发育调控。     

麻竹DlSCL6基因amiRNA前体合成及表达载体构建

Web MicroRNA Designer(WMD3)是一个专门应用于植物人工miRNA设计和前体序列设计的专业网站,其中利用重叠PCR法合成amiRNA前体序列,涉及多个PCR和纯化回收过程,步骤繁琐,周期较长。本研究利用WMD3设计了麻竹转录因子DlSCL6基因的人工miRNA序列和其前体序列,采用改进的重叠PCR方法,快速克隆获得了该前体序列,并以改造的pCMABIA1301载体为框架,构建了该前体的植物表达载体,为进一步研究利用amiRNA调控SCL6基因的表达奠定了基础。     

油桐LEAFY同源基因片段的克隆与分析

根据不同植物LEAFY（LFY）同源基因序列的保守区,设计合成1对简并引物,利用该引物通过PCR技术从油桐基因组DNA中分离出1条长约1050bp的LFY同源基因（TUNGlfy）片段,克隆到pMD18-T载体,以期为进一步研究LFY基因表达特性及其与油桐成花生物学的关系打下基础.进行测序和生物信息学分析的结果表明,该片段长1059bp,在中间有1个长639bp的内含子,前面的外显子长294bp,后面的长126bp,共编码135个氨基酸,拼接位点与其它植物的LFY同源基因一致;其推导蛋白质序列与其它植物LFY同源基因的相似性为88%～97%,其中与毛白杨的相似性最高,达到了97%,推测它们具有相似的功能.     

胁迫条件下毛竹miR164b及其靶基因PeNAC1表达研究

MicroRNAs(miRNAs)在植物生长发育以及抗逆等过程中起着重要的调控作用。miR164 作为植物特有的miRNA,其主要的靶基因是植物NAC转录因子。为揭示毛竹 miR164 对其靶基因的调控机制,通过茎环引物法和RT-PCR技术,从毛竹(Phyllostachys edulis)中克隆出miR164b成熟序列及其靶基因PeNAC1。序列分析表明miR164b的靶点位于PeNAC1 编码区,RLM-5'RACE PCR产物测序结果证实切割位点位于靶点的第10-11位碱基之间。组织特异性表达分析表明,毛竹 miR164b和PeNAC1在根、茎、叶及鞘中均表达,其中miR164b在根中表达丰度最高,在茎中表达丰度最低;而PeNAC1的表达丰度恰好与miR164b 相反。实时定量PCR结果显示,NaCl(250 mmol·L^-1)、低温(4℃)和强光(1 500 μmol·m^-2·s^-1)处理后毛竹叶片中 miR164b 的表达均明显下调,GA₃(100 μmol·L^-1)处理后 miR164b表达量明显上调;而在同样处理条件下,PeNAC1的表达恰好呈现出与其完全相反的趋势。由此表明,miR164b对靶基因PeNAC1 具有表达调控作用,可能与毛竹响应非生物胁迫的抗逆过程密切相关,这为利用miRNA开展竹子抗逆分子育种提供了参考。     

杨树生物钟节律基因PtCCA1的克隆及表达模式研究

生物钟节律基因CCA1在植物的光周期反应中起着重要的调控作用.利用RT-PCR方法克隆获得了一条包含1902 bp开放阅读框的杨树CCA1基因cDNA序列,其编码633个氨基酸残基,蛋白的分子量约为68.90 kDa,等电点为6.33.分析显示含有1个Myb-like DNA结合域及2个蛋白跨膜结合域.实时荧光定量PCR分析发现,PtCCA1基因主要在杨树叶组织中表达;随着光照时间的变化,该基因在杨树中的表达量呈现白昼不断降低而夜晚逐渐升高的昼夜变化趋势.研究结果为进一步探索PtCCA1基因在调控杨树光周期响应途径中的功能以及杨树光周期敏感机制提供了科学基础.     

KNOX Ⅰ类基因在雌蕊发育中的作用

雌蕊由心皮和花柱组成并最终发育成果实,其发育对作物的产量、质量都有决定性的影响。因此,对雌蕊败育相关基因的研究是植物生物学研究领域的热点,KNOX家族是植物中的5个同源异型盒基因家族之一,分为Ⅰ类和Ⅱ类KNOX亚家族,主要在植物茎顶端分生组织中特异表达,是分生组织发生与维持所必需的关键基因,调控与器官发生相关的细胞分化,最终影响侧生器官的形态建成、该文综述了与雌蕊发育相关的KNOX家族基因功能,重点对KNOX家族中的KNOX Ⅰ类基因进行了阐述。     

LEAFY同源基因系统进化及研究进展

LEAFY(简称LFY)同源基因是一个调控植物花分生组织和花器官形成的特征基因,它是启动开花的枢纽,而且还可防止花分生组织的逆转。本文分别利用软件Vector NTI software(I nvitrog en)和MEGA5.1对36种植物LFY基因编码的氨基酸序列特征、系统进化等进行分析,结果表明,其蛋白质平均含有397个氨基酸,分子量为44.35 kDa,等电点为7.32;多序列比对显示它们有37个完全保守的氨基酸残基,另外还存在丙氨酸、赖氨酸、组氨酸等氨基酸富集区;系统进化显示裸子植物与单子叶植物聚为一类,后与双子叶植物聚在同一进化树中。上述研究不仅对植物成花机理的研究具有重要的参考价值,而且为植物花发育以及早花早果奠定了理论基础。