鹅掌楸ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为建立鹅掌楸简单序列重复区间扩增ISSR的PCR优化反应体系,以鹅掌楸叶片基因组DNA为材料,系统地测试了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR-PCR反应体系的影响。结果表明:优化的PCR反应体系为:20μL总体系中,含30 ng模板DNA,0.3μmol.L-1随机引物,0.2 mmol.L-1dNTPs,1.4 mmol.L-1Mg2+,0.8 UTaqDNA聚合酶;最佳退火温度为60℃;PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,60℃退火45 s,72℃延伸2 min;45个循环;72℃再延伸7 min。     

桢楠DNA提取和RAPD条件的优化

以桢楠（Phoebe zhennan）新鲜叶片、硅胶干燥叶片为材料,研究了DNA的提取方法,并对影响RAPD反应的各因素进行了优化。得到了桢楠RAPD的优化反应体系及程序,适合桢楠RAPD反应的体系总体积为25μL,DNA模板2μL,Taq DNA聚合酶用量0.3μL,引物用量1μL,Mg2＋用量5μL,dNTPs用量0.5μL,ddH2O16.2μL;适合桢楠RAPD扩增的程序是94℃预变性3 min,94℃变性1min,36℃复性1 min,72℃延伸2 min,42个循环,最后72℃延伸10 min,产物于4℃保存,同时结果表明硅胶保存的样品完全可以与传统的新鲜叶片得到同样的PCR扩增结果,完全可以满足研究需要。     

利用正交设计优化茶树ISSR反应体系

为优化茶树ISSR分子标记反应体系,对影响茶树ISSR反应较大的Mg2+浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度5个因素在4水平上进行优化试验,建立了适合于茶树ISSR-PCR(Inter Simple Sequence Repeats-Polymerase Chain Reaction)的最佳体系:20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶0.75U/μL,10×buffer(含Mg2+)2.0mmol·L-1,模板DNA20ng,dNTP0.1mmol·L-1,引物0.3μmol·L-1。反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,50～60℃退火40s,72℃延伸90s,34次循环,72℃延伸7min,4℃保存。     

红花石蒜ISSR-PCR反应体系的建立

以红花石蒜叶片基因组DNA为模板,分析了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2 的浓度及Taq DNA聚合酶的用量对ISSR-PCR扩增结果的影响.建立了石蒜ISSR分析最优化的反应体系及应用程序:即25 μL反应体系中,有20 ng模板DNA、0.5 μmol·L-1随机引物、150 μmol·L-1 dNTPs、2.0 mmol·L-1 Mg2 、1.0 U Taq DNA聚合酶.反应程序为:94 ℃预变性5 min;然后45个循环:每个循环94 ℃变性45 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸2 min;循环结束后72 ℃延伸7 min.     

麻竹RAPD反应条件的优化

以麻竹DNA为模板,对影响麻竹RAPD扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立麻竹RAPD反应的最适体系。最终得出的麻竹RAPD反应体系为:20μL反应体系,2μL10倍反应缓冲液,模板含量为50ng,2 5mmol·L-1的Mg2+,1 5U的Taq酶,dNTP为1 75mmol·L-1,引物浓度为0 4μmol·L-1。优化后的RAPD反应程序为:94℃3min→[94℃1min→37 5℃1min→72℃1min20sec]40个循环→72℃8min→4℃保持。     

SRAP标记体系优化及在茶树种质资源研究中的应用

以Me3和Em5正反向引物组合对凤凰水仙茶树品种进行了SRAP分析体系的优化。结果表明：茶树SRAP-PCR最佳反应体系为：Mg2＋浓度3.0 mmol.L-1;Taq酶2.0 U;dNTPs浓度0.2 mmol.L-1;引物浓度2.0μmol.L-1;10×Buffer 2.0μL;模板DNA 20 ng;反应总体积为25μL。经过重复试验,确定茶树SRAP-PCR扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸100 s,5个循环;94℃变性1 min,50℃复性1 min,72℃延伸100 s,35个循环;最后72℃延伸5 min。采用已优化的体系对30份茶树品种进行SRAP分析,经2%的琼脂糖凝胶电泳得到了清晰且重复性好的扩增谱带,说明该反应体系稳定可靠,适用于茶树种质资源的分子标记分析。     

松口蘑与栎松口蘑RAPD反应体系的优化

以长白山松口蘑与栎松口蘑为材料,建立了松口蘑与栎松口蘑RAPD反应优化体系。即在20μl反应体积中,模板DNA 10ng,引物0.3μmol.L-1,dNTP 200μmol.L-1,MgCl22mmol.L-1,Taq DNA聚合酶1unit,1×Buffer;反应程序为预变性94℃5min,94℃45s、36.3℃60s、72℃90s共循环45次,最后72℃延伸7min。     

香樟ISSR-PCR反应体系的正交优化

应用L9(34)正交表建立了适合于樟树ISSR-PCR的优化反应体系,即20μL ISSR反应体系中含有1×PCR buffer、dNTP0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L、Mg2 2.0 mmol/L、Taq酶1 U和模板DNA50 ng.适宜的扩增条件为:94℃预变性4 min;94℃变性40 s,58℃退火1 min,72℃延伸2 min,42个循环;72℃延伸10 min;4℃保存.     

构树ISSR反应体系的优化与建立

利用正交试验对Taq酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和模板DNA浓度5个因素进行优化,从而建立了一套适宜构树的ISSR-PCR反应体系.在20 μL的反应体系中,各反应物的最适宜含量为:0.07 U·μL-1 TaqDNA聚合酶、0.35 μmol·L-1ISSR引物、0.3 mmol·L-dNTPs,2.0 mmol·L-Mg2+、1.2 ng· μL-1模板DNA.PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环.     

云南箭竹基因组DNA的提取及RAPD反应条件的优化

用改良的SDS法从云南箭竹硅胶干燥的叶片中提取基因组DNA进行RAPD扩增。通过正交法对RAPD反应条件优化,6个试验因子的最适条件为:模板DNA1.5ng/μL,随机引物0.8～1.0μmol/L,dNTPs浓度0.1～0.15mmol/L,Mg2+浓度2.0～2.5mmol/L,Taq酶用量0.5～1.0U。最佳热循环参数为:94℃预变性2min,之后进行40次循环(94℃变性30s,36℃退火60s,72℃延伸90s),最后72℃总延伸7min后在4℃终止反应。     

七叶树RAPD反应体系的优化

以七叶树新鲜叶片为材料,研究了七叶树RAPD分析过程中的影响因素包括Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间、循环次数等,建立了适合七叶树RAPD反应的PCR体系。即20μl反应体系中含有dNTP 0.25 mmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,Taq酶1.0U,引物0.8μmol/L,DNA模板50ng。扩增程序为:94℃预变性5min,然后40个循环(94℃变性30 s,33℃退火40 s,72℃延伸60 s),最后72℃延伸10min,4℃保存。     

湖南宽皮柑橘SRAP的反应体系

为研究湖南宽皮柑橘的血缘与起源关系,以湖南宽皮柑橘为试验材料,探讨其SRAP分子标记的反应体系.结果表明:设计并筛选了110对引物,其中28对引物扩增带型丰富,以引物组合Me5-Em11、Me9-Em10多态性最高,研究确定在25μL的反应体系中,Mg2 浓度在1.5 mmol.L-1,dNTP 0.3 mmol.L-1,上下引物各为0.2μmol.L-1,Taq酶浓度为0.3 U效果好,最佳PCR程序为94℃预变性5 min,然后94℃,1 min;50℃,1 min;72℃,1 min,35个循环,最后72℃延伸10 min,利用优化后的反应体系成功构建了湖南宽皮柑橘的指纹图谱.     

松口蘑SRAP反应体系的优化

以松口蘑为材料,建立了松口蘑SRAP反应的优化体系。即在20μL反应体积中,模板DNA 10ng,引物浓度0．3μmol／L,dNTP 250mmol／L,MgCl 22．5mmol／L,Taq DNA聚合酶0．5U,1×Buffer;反应程序为：94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,共5个循环;94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环：72℃延伸5min。     

八角RAPD-PCR反应体系的建立及引物筛选研究

在提取高质量八角基因组DNA的基础上,通过对其RAPD反应体系的Taq DNA聚合酶、dNTPs浓度、Ｍg2+浓度、引物浓度等因子的优化,建立了稳定、重复性高的八角RAPD-PCR反应体系.研究结果表明,在25 μL PCR反应体系中,含1.0 UTaq DNA聚合酶,0.15 mmol·L-1 dNTPs,2.0mmol·L-1 Mg2+,2.0 μmol·L-1引物,20～ 80 ng模板.最佳反应程序为,94℃预变性5 min,扩增后94℃变性30 s,31 ～37℃退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环;72℃完全延伸7 min,4℃保存.在建立RAPD-PCR反应体系的基础上,从240条RAPD引物中筛选出15条扩增条带清晰、稳定性好的引物,并通过各引物的退火温度梯度实验,确定了各引物的最适退火温度.     

云南松SSR—PCR反应体系的优化研究

本项研究以云南松实生苗幼嫩针叶为材料,采用单因素试验设计,分析云南松SSR—PCR扩增反应体系中各组分对扩增结果的影响,并进一步采用正交试验设计对SSR—PCR扩增反应程序进行优化。结果表明,在15μL SSR-PCR反应体系中包括,1×TaqPCRBuffer,模板DNA用量30ng,Taq聚合酶用量1．0U,0．2mmol L-1dNTPs,3．0mmol·L-1Mg2＋以及正、反引物各0．2μmol．L-1;扩增反应程序为,94℃预变性4min;94℃变性30s,退火30s,72℃延伸45s,35个循环;最后72％延伸10min,4℃保存。该反应条件的建立为开展云南松种质资源SSR分子标记研究提供了参考依据。     

岷江百合ISSR-PCR反应体系的优化

以岷江百合为材料,对影响ISSR-PCR反应的主要参数进行优化,建立了适用于岷江百合的ISSR-PCR反应体系.20μL反应体系中,内含1×PCR buffer、1.25 mmol/L Mg2 、0.4 mmol/L dNTPs、0.6 μmol/L引物、0.5 U Taq DNA聚合酶、20ng模板DNA.扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性40 s,52.8℃退火45 s,72℃延伸1min 30s,共45个循环;最后72℃延伸8 min.该优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术开展岷江百合遗传多样性研究奠定了基础.     

红花檵木SRAP反应体系的建立及优化

为了获得红花檵木清晰的SRAP标记图谱,对红花檵木DNA的提取方法以及SRAP-PCR反应体系的影响因子进行了初步探讨,筛选和建立了扩增多态性高、重复性好、带型清晰的DNA模板和SRAP-PCR反应体系,同时提出了应用SRAP分子标记构建红花檵木遗传图谱的可行性.最佳SPAR-PCR反应体系为:在50μL的反应体系中,Mg2 1.6 mmol/μL,dNTPs 1.0 mmol/μL,DNA模板150 ng,DNA聚合酶3.6 U,上下引物各0.20 mmol/L.扩增程序为:94℃预变性4 min,反应前5个循环在94℃1 min、35℃1 min、72℃1 min条件下运行,随后的30个循环复性温度提高到55℃,最后72℃延伸5 min.     

狗牙根ISSR—PCR反应体系的建立与优化

以改良的CTAB法提取的狗牙根叶片DNA为模板,采用单因素多水平方法对狗牙根ISSR反应体系进行构建和优化,系统分析Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物和buffer这6种1SSR反应成分的浓度对扩增结果的影响,结果表明:20.0μL PCR反应体积中,20.0 ng模板DNA,0.4 μmol/L引物,0.5mmol/L Mg2+,0.05mmol/L dNTPs,0.2U TaqDNA聚合酶,2.0 μL 10×buffer.反应程序为;94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55 C退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;再72℃延伸7 min,4℃保温.     

漾濞核桃RAPD反应优化体系的建立

以漾濞核桃中的大姚三台核桃为实验材料,通过对影响RAPD扩增结果的主要因子Tag酶、Mg+2、引物、模板DNA、dNTPs等不同的浓度和组合的试验研究,确定了漾濞核桃的最适反应体系和扩增程序,即在25μL反应体系中,0.75 u.L-1Taq DNA聚合酶,3.0 mmol.L-1Mg+2,0.3 mmol.L-1引物,含1.6 mg.L-1模板,2.5 ul 10×Buffer,dNTPs各0.2 mmol.L-1。扩增程序为:94℃预变性300 s,94℃变性40 s,36℃退火60 s,72℃链延伸120 s,45次循环后,72℃延伸600 s。     

杨树基因组SRAP扩增体系的建立与优化

以响叶杨和银白杨及F1代为实验材料,利用正交设计直观分析法和单因素随机试验对杨树SRAP反应体系中各组分(TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和Mg2+)的浓度进行优化;通过实验确定10μL反应体系为:引物0.35μmol/L,TaqDNA聚合酶0.5U,dNTP0.2 mmol/L,Mg2+2.0 mmol/L,10×PCRbuffer 1μL,模板DNA 1μl(20 ng/μL).同时利用最佳反应体系以及正交设计直观分析法对PCR扩增程序进行筛选,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.结果表明最佳反应程序为:开始94℃变性5min,反应前5个循环在94℃1 min,37℃30 s,72℃ 1min条件下运行;之后35个循环在94℃1 min,54℃ 1 min,72℃ 1 min条件下运行,最后延伸7 min;12℃保存.并利用两树种的杂种F1代对优化的反应体系和程序的可行性进行了验证.