寡核苷酸管芯片技术检测和鉴别我国不同组植原体

[目的]不同组植原体检测和鉴别的特异性探针已有报道,为了筛选出适合于我国不同组植原体检测和鉴别的特异性探针,建立管芯片检测和鉴别植原体技术,并对我国发生的疑似植原体病害进行鉴别。[方法]通过PCR扩增结合管芯片杂交技术,对收集到的15种植原体侵染的植物样品及其健康对照进行检测和鉴别。[结果]建立了管芯片检测和鉴别植原体技术体系。15种病害样品中,13种获得显著的阳性杂交信号,并且所有的健康对照都呈现为阴性。13种植原体病害依16Sr DNA直接测序可分为16SrⅠ、Ⅱ、Ⅴ、XIX四组植原体。在所有探针中,植原体的通用探针(Pp-502)可以检测到所有确定的植原体样品。16SrⅠ组特异性探针(PpⅠ-465)可以确定16SrⅠ组的泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩和莴苣黄化4种植原体样品。16Sr II组特异性探针(PpⅡ-629)仅可以确定16Sr II组的花生丛枝、甘薯丛枝和臭矢菜丛枝3种植原体样品。但16Sr V组的枣疯病、樱桃致死黄化和重阳木丛枝及16Sr XIX组的板栗黄化皱缩植原体与其他组专化性探针皆有明显的交叉杂交信号。相比于PCR扩增的凝胶电泳检测,管芯片检测的灵敏度提高了1 000倍。对疑似植原体病害的诊断结果显示河南濮阳的红花槐丛枝的病原应为16Sr V组植原体,福建福州的长春花黄化丛枝应为16SrⅠ组植原体;而北京戒台寺牡丹黄化皱叶和内蒙古包头柳树丛枝未出现任何植原体专化的杂交信号。[结论]管芯片杂交技术作为一种检测和鉴别植原体的方法,可应用于我国植原体病害调查和诊断,并为植原体的鉴别和分类提供可靠的依据。     

植原体检测和鉴定技术

植原体是一种广泛传播的植物病害病原,在世界范围内造成了非常大的经济损失。各国的研究人员对植原体造成的病害,一直进行着不懈研究。利用传统的组织和化学检测技术,取得了很多研究成果。随着现代生物技术的飞速发展,人们又建立了许多植原体的鉴定和检测的新方法,为探索植原体的遗传特征和生物学特性,提供了技术基础。本文就植原体被发现以来,对此病害检测和鉴定技术的发展进行论述。     

车桑子丛枝病的病原分子检测鉴定及风险分析

在攀枝花市米易县车桑子Dodonaea viscosa种植区调查丛枝病的发生情况。应用植原体16S rDNA基因的通用引物R16m F2/R16mRl和R16F2/R16R2对具有典型植原体侵染症状和无症车桑子进行检测,巢式PCR得到约1.2 kb的特异性片段,经过测序并在NCBI数据库进行比对,获得1条植原体特定的16S rDNA基因序列(DvWB-PZHMY1);将测得的序列与已报道的植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,结果显示获得的植原体序列均聚类到16S rI-B亚组中。风险评估分析表明,车桑子丛枝病达到中度风险级别,应给予重视。     

多位点序列分析揭示我国16SrI组植原体不同株系间遗传变异和系统发育关系（英文）

【目的】16SrI组植原体对我国作物和生态植物危害严重。目前植原体尚不能分离培养,对于我国植原体不同株系间遗传变异和种群结构尚不清晰,通过多位点序列分析(MLSA)揭示我国不同地区16SrI组不同植原体株系的遗传多样性及其地理分布特征,比较不同植原体株系间不同持家基因的变异程度,为我国不同植原体株系的检测、分类鉴定和系统发育研究提供一定的参考方法和依据。【方法】应用rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB共10个持家基因序列,结合16S rDNA序列,以全基因序列已完成的洋葱黄化植原体(OY-M)、翠菊黄化丛枝植原体(AYWB)、澳大利亚葡萄黄化植原体(CPA)、草莓致死黄化植原体(SLY)和苹果簇生植原体(CPM)共5种植原体株系为参照,分析我国10个省(市)苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系(共18株)的遗传变异规律和系统发育关系,通过多重序列比对分析不同基因片段的序列多态性和变异程度。【结果】我国18株苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB多位点序列共有15种序列类型,从而揭示16SrI组不同植原体株系间丰富的遗传多样性。基于rp等10个基因多位点序列分析可将16SrI-B、D亚组的不同植原体株系清晰地分开。10株苦楝丛枝植原体株系与2株桑萎缩植原体株系系统发育关系最近,多位点序列分析可将这2种基于16S rDNA序列难以区分的植原体株系清晰地区分。10株苦楝丛枝植原体株系分为4个进化枝,其多位点序列存在8种序列类型,这4个分枝与植原体株系的地理分布关系密切。与我国长春花绿变和泡桐丛枝植原体株系相比,福建三明2株莴苣黄化植原体株系与日本洋葱黄化植原体株系OY-M系统发育关系较近。在已检测分析的植原体不同基因序列片段中,dnaK基因序列片段的变异水平最高。【结论】多位点序列分析可做为一种对植原体鉴定、区分以及株系遗传多样性全面检测的有效、可靠方法。在以后的研究中该方法可广泛应用于深入探讨植原体不同组间或亚组间株系的遗传变异和系统发育关系。     

以tuf基因为靶标的5种16SrⅠ组植原体环介导恒温扩增技术

【目的】建立一种能够特异性检测和鉴定16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,实现16SrⅠ组植原体的快速检测。【方法】以植原体tuf基因作为靶标,通过序列比对,设计多组具有特异性的LAMP引物组,筛选出一套适用于16SrⅠ组植原体的特异性检测体系。以16SrⅡ组、16SrⅤ组、16SrⅩⅨ组植原体样品按照此检测体系进行反应,来验证其特异性;同时将稀释后的感病组织样品同步进行PCR和LAMP检测,以确定其检测灵敏度。对来自不同省市的6份田间样品以及9份组培样品进行检测,以验证其检测的稳定性。【结果】16SrⅠ-LAMP在恒温63℃条件下40 min内完成扩增,能检测5种分别引起泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩、莴苣黄化和长春花绿变病的16SrⅠ组植原体,不能检测其他组植原体包括16SrⅡ组的花生丛枝、甘薯丛枝、臭矢菜丛枝、16SrⅤ组的枣疯病、红花槐丛枝、樱桃致死黄化和16SrⅩⅨ组的板栗黄化皱缩植原体。通过在反应液中加入钙黄绿素肉眼判断绿色为阳性结果,褐色为阴性结果,与用荧光定量设备进行判读扩增曲线的结果一致。相比于PCR检测,16SrⅠ-LAMP检测的灵敏度提高了8倍;16SrⅠ-LAMP能够快速检测出来自不同区域的田间泡桐发病样品、感病泡桐组培苗和嫁接传病脱毒苗。【结论】以tuf基因作为靶标,建立能同时检测5种16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,具有高效、特异、操作简便、检测时间短及成本较低等优点,适合于基层和现场检测。     

桉树人工林“滞长症”植原体探讨

2005年以来,在广东、广西地区出现了大面积桉树商品人工林无性系生长停滞的现象,为了确定该病症是否由植原体侵染引起,用直接PCR和巢式PCR扩增植原体16SrDNA的方法对具有典型症状的样品进行了植原体检测,结果并没有检测到植原体的存在。     

越冬病枝水培与PCR结合检测枣疯病植原体的存活动态

以感染枣疯病的婆枣为材料进行了以下两方面的研究：其一,采集越冬期和越冬前后的枣疯病枝条并对越冬期枝条进行水培,通过萌芽的症状观察和PCR检测,发现病枝条韧皮部和萌芽内均可扩增出1.5 Kb的枣疯病植原体特异性条带,此结果表明,枣疯病植原体可以在-10℃左右的地区在枣树枝条内安全越冬;其二,利用PCR技术检测了冬季轻病树的病枝、根部、主干及树冠内未表现症状的枝条韧皮部,结果只在病枝内检测到植原体的存在,而在其它部位都未发现植原体.     

核酸点印迹杂交法检测枣疯病植原体

该文详细介绍了应用核酸点印迹杂交法 (Dot- blot)检测枣疯病病原植原体(Phytoplasma)的操作步骤和检测结果 ,分析和讨论了检测结果和检测中可能出现的问题 ,认为此法是鉴定枣疯病病原植原体的准确、灵敏的方法 ,并对以后工作方向提出了建议     

枣疯病和泡桐丛枝病原植原体分离物的组织培养保藏和嫁接传染研究

分别从河北唐县赞皇大枣、辽宁凌源梨枣和河南濮阳扁核酸3个品种的枣疯病和来自山东、江西和北京的不同无性系的泡桐丛枝病树上采集丛枝枝条作为组织培养材料,获得的枣疯病和泡桐丛枝病组培苗皆表现典型的丛枝症状。其中感染植原体的赞皇大枣组培苗(Ft)和扁核酸组培苗(HPD)在未加任何激素的MS培养基和其它培养基交替继代培养1a以上仍能维持丛枝苗生长;而发病梨枣(LD)除产生丛枝外,还出现叶片黄化和植株矮化、枯梢等衰退症状。泡桐丛枝病植原体可在不同无性系组培苗上通过各种培养基交替和单纯的MS培养基继代培养,并已在实验室内连续保藏达10a,其引致丛枝症状的能力无明显的改变。用枣树Ft染病材料作接穗,以健康冬枣(DJ)和抗病婆枣(W14)砧木进行组培苗间嫁接传病试验,可使部分DJ和W14发病;而嫁接未发病的砧木多数像健苗一样正常生长。用感染山东泡桐丛枝病植原体ZD株系丛枝组培苗为接穗,嫁接健康泡桐无性系组培苗致使无性系MB33、TY2T和C125发病。用植原体16SrDNA通用引物进行PCR,确证了泡桐和枣树发病苗和嫁接发病组培苗体内存在植原体。用DAPI荧光显微镜技术比较组培苗韧皮部筛管中的植原体浓度,结果显示,Ft和嫁接发病冬枣(DJ-Ft)筛管中植原体浓度相对较高,但仍低于各泡桐无性系染病丛枝组培苗;HPD和LD浓度中等,而发病的W14砧木含有植原体的筛管数量较少、且浓度很低。在嫁接不成功或未发病的DJ和W14砧木组织及健康对照组织中皆检测不到植原体荧光。     

猪屎豆丛枝病植原体的分子检测与鉴定

植原体(phytoplasma),原称类菌原体(MLO),在植物和昆虫中广泛分布,为无细胞壁原核微生物,尚不能在人工培养基上离体培养.迄今,世界各地已统计有1000多种植物自然感染植原体病害(Seemüller et al.,1998),我国也报道了100多种植物植原体病害(赖帆等,2008).     

枣疯植原体的分布特点及周年消长规律

枣疯病是一种典型的致死性植原体病害,是枣树生产中发生最普遍、危害最严重的毁灭性传染病害,被视为枣树的癌症.     

<Emphasis Type="Italic">Broussonetia papyrifera</Emphasis> (paper mulberry): its growth,yield and potential as a fallow crop in slash-and-burn upland rice system of northern Laos

In northern Laos, shortened fallows in the slash-and-burn upland rice system are not sustainable either from a production or economic standpoint. This paper evaluates the potential for using the indigenous fast-growing tree, Broussonetia papyrifera L. Vent. (paper mulberry) as an economic fallow crop. The objectives of this study are to assess the inner bark yield of paper mulberry, and to evaluate rice productivity following paper mulberry cultivation. In addition, allometric models for estimating the inner bark yield of paper mulberry are developed. Inner bark yield of paper mulberry stands ranging in age from 9 to 48 months ranged from 10 to 208 g m⁻², and increased with age. The models using diameter at breast height and stem height, or diameter at breast height only as independent variables explained well the variation in inner bark yield. When paper mulberry was completely removed during the rice growing season, rice yields in these areas were similar to those following weedy bush fallow. When paper mulberry was allowed to grow, rice yields were negatively correlated to paper mulberry stem density. When paper mulberry lateral branches were pruned back, rice yields could be maintained if the paper mulberry stem density was <0.22 stems m⁻², suggesting that if paper mulberry is managed properly, rice yields can be maintained at current levels. The paper mulberry-upland rice rotation system improves the productivity of a traditional slash-and-burn system through harvesting paper mulberry inner bark; however the long-term sustainability of such a system remains unclear and warrants further investigation.     

柞木林内不同高度小气候因子时空分布规律的研究

对柞木林内不同高度的空气温度、相对湿度、绝对湿度和蒸发量进行了日、季节变化规律的研究 ,结果表明 :不同高度气温的日变化为单峰曲线 ,1d内 ,温度随树木高度的降低而减少 ;不同高度气温的季节变化总趋势是一致的 ,在 7月第五候达到最大值 ;不同高度相对湿度日变化是一致的 ,但林内相对湿度有 4种垂直分布型 ;各层次相对湿度季节变化为双峰曲线 ;所有层次绝对湿度日变化为白天高 ,夜晚低 ;日、季节各层次垂直变化不显著 ;不同高度蒸发量具有基本一致的季节变化 ,但达到峰值的时间不一致。     

间作模式下桑树与大豆叶片的光合日变化特点

为了提高桑树与大豆间作模式下地上部分的光能利用率,优化桑树与大豆复合经营的空间配置,研究了在这一间作模式下生育后期速生桑树和大豆叶片的光合日变化特点.结果表明:无论在单作还是间作模式下大豆叶片在13:00时均表现出明显的光合"午休"现象,其光合性能并未因间作桑树而受到影响;一天之中,桑树叶片分别在9:00时和13:00时出现光抑制现象,并且13:00时光抑制的程度和持续的时间均大于9:00时出现的,不同种植模式下桑树叶片的光合日变化情况存在着明显的差异,一天之中,间作模式下桑树叶片的P_r、_r、和F_v /F_m等光合指标值均优于单作模式的桑树叶片,桑树与大豆间作具有一定程度的种间促进作用,1年生桑树幼苗与大豆间作能明显提高生育后期速生桑树叶片的光合生产能力,从而可实现高产的目的.     

Seasonal changes of C and N non-structural compounds in the stem sapwood of adult sessile oak and beech trees

We assessed the pools of non-structural nitrogen compounds (NSNC) through a year, thereby addressing the question of whether mature sessile oak [Quercus petraea (Matt.) Liebl.] and beech (Fagus sylvatica L.), which differ in wood anatomy and growth patterns, exhibit contrasting seasonal dynamics of NSNC pools as previously shown for non-structural carbohydrate (NSC) pools. Seasonal fluctuations of NSNC (amino acids and soluble proteins) and NSC (starch and soluble sugars) pools were analyzed in the inner and the outer stem sapwood. In oak, NSC showed marked seasonal variation within the stem sapwood (accumulation during winter and decrease during bud burst and early wood growth), whereas in beech seasonal fluctuations in NSC were of minor amplitude. Even if the distribution and intensity of the NSNC pools differed between the two species, NSNC of the stem sapwood did not show seasonal variation. The most significant change in NSNC pools was the seasonal fluctuation of protein composition. In both species, two polypeptides of 13 kDa (PP13) and 26 kDa (PP26) accumulated during the coldest period in parallel with starch to sugar conversion and disappeared with the onset of spring growth. The absence of seasonal changes in total soluble protein concentration suggests that the polypeptides are involved in the internal nitrogen (N) cycling of the stem rather than in N storage and remobilization to the other growing organs of the tree.     

抗病和感病泡桐无性系组培苗对嫁接传染植原体的不同反应

用感染了植原体并表现典型丛枝症状的组培苗作接穗或砧木，在无杂菌条件下嫁接７个表现不同田间抗性的无性系健康组培苗，并用ＤＡＰＩ荧光显微镜和１６ＳｒＲＮＡ基因扩增（ＰＣＲ）技术检验嫁接传病效果。Ｃ１２５和ＸｕＨ表现出较强的特异性接种诱发坏死反应，ＺＨ和Ｔ３５０２８坏死反应中等，ＱＬＭ、Ｃ０２０和Ｃ１６１的坏死反应较弱。培养基中添加植物生长调节剂（６ＢＡ或ＮＡＡ）可降低坏死程度，提高嫁接成功率，水杨酸处理或去掉健株砧木叶片和根系皆加重坏死反应程度。用病接穗嫁接抗病的ＱＬＭ无性系时，用ＰＣＲ检测到侵染砧木的植原体，但未表现丛枝症状，而将此无性系健康接穗嫁接到丛枝病砧木上时可诱致典型丛枝症状，从而表现出与根系和成熟叶相关的抗性反应。除Ｃ１２５外，其余６个无性系皆被嫁接传染，其继代培养表现出差异不显著的丛枝症状，其韧皮部金黄色自发荧光随着症状的加重而累积，也与抗病性有一定的联系。     

天目山柳杉古树的液流特征研究

应用热扩散技术法,于2010年4—8月对浙江天目山自然保护区内的2株柳杉古树的树干液流进行连续观测,结合所测定的相关环境因子,分析了柳杉树干液流和耗水量的变化规律,以及液流与各环境因子的关系。结果表明:不同季节柳杉树干液流速率日变化规律基本一致,呈单峰波动曲线,但树干液流启动时间、达到峰值时间及迅速下降时间存在明显差异;树干液流密度与光合有效辐射、空气温度和水汽压差间存在极显著正相关,与空气相对湿度和CO₂浓度呈极显著负相关;液流密度随树干直径的增加,无明显变化差异,但液流速率和日均耗水量均随树干直径的增加而增大;胸径75.6 cm柳杉和胸径62.8 cm柳杉的日均耗水量季节变化过程相同,但2者变化差异较大,6月份日均耗水量最低,分别为(49.356±14.883) kg和(9.531±4.297)kg;4月份日均耗水量最高,分别为(110.022±21.890)kg和(49.352±2.629)kg。     

大青山米老排树干径向生长变化及其对环境因子的响应

【目的】研究南亚热带大青山林区乡土珍贵树种米老排径向生长日变化特征及对环境因子的响应,为理解米老排生长-气候响应的生理机制、森林培育和保护等提供基础数据。【方法】利用点状树木径向生长变化记录仪对米老排径向生长变化进行连续观测,采用气象站同步测量辐射总量、土壤含水量、相对空气湿度、空气温度等环境因子数据。通过径向生长与环境因子的相关分析,研究米老排生长季第一个高峰期(5月)的不同分化等级径向生长日变化规律、不同天气条件下生长变化及径向生长-环境因子相互关系。【结果】1)不同分化等级米老排5月份的径向生长日变化量优势木(17.08μm)>平均木(13.94μm)>被压木(-1.81μm),差异极显著(P<0.01),且不同阶段的起始时间、阶段时长、变化量也有所不同。2)不同天气条件下,三种分化等级米老排径向日净生长量和日变化幅度均表现为雨天>晴天>阴天,受雨水影响,雨天条件下径向变化量远超其自身生长量;同种天气条件下,径向日净生长量优势木最大,日变化幅度则表现为平均木最大。3)不同分化等级米老排径向生长与相对空气湿度、降雨量呈极显著正相关关系,与气温、总辐射呈极显著负相关关系,而20 cm土壤含水率无显著性相关,且各影响因子均存在不同时间滞后效应。【结论】不同分化等级米老排由于林木生长状况的差异,导致其受到环境因子影响程度的不同,进而使得其径向生长变化量产生差异。     

Seasonal variation of paulownia witches’-broom phytoplasma in paulownia trees and distribution of the disease in the Tohoku district of Japan

Seasonal variation of paulownia witches’-broom (PWB) phytoplasma within different organs (leaves, branch and trunk bark and roots) in paulownia trees was investigated by the amplification of a PWB-specific DNA fragment by the polymerase chain reaction (PCR). In leaf samples, PWB phytoplasma was first detected in June and the incidence gradually increased. On the other hand, the PWB was detected at relatively low incidence in branch bark, trunk bark and roots and the incidence did not change among seasons. A survey of PWB in 27 fields in the Tohoku district of Japan showed that malformed flower buds were observed in paulownia trees in almost all of the fields. PWB-phytoplasma was also detected by PCR from paulownia trees in almost all of the fields in Iwate and Fukushima Prefectures. The frequencies of trees in which phytoplasma was detected by PCR were higher than those in which symptoms were observed. These results indicated that PCR amplification of a PWB-specific DNA fragment is an effective tool for practical diagnose and that PWB is widely distributed in the Tohoku district of Japan.