牛胚胎体外生产技术概要

胚胎体外生产也称体外受精技术,是继人工授精、胚胎移植技术之后,家畜繁殖领域的第三次革命。牛胚胎体外生产包括卵子的成熟培养、精子获能、体外受精和胚胎早期培养等4个连续过程。自1982年以来,家畜体外受精技术,尤其是牛体外受精技术的发展十分迅速,仅仅10年时间,就已从理论     

中国黄牛体外受精的研究进展

阐述了体外受精技术在牛胚胎工程和育种研究中的意义，介绍了牛体外受精的方法和当前研究进展，对当前牛体外受精技术研究中存在的问题作了评述．     

培养基的保存温度对牛卵母细胞体外受精的影响

研究了培养基保存温度对牛卵母细胞体外受精的影响。结果表明,基础培养基中激素不同添加时间对牛卵母细胞体外成熟率、牛体外受精胚胎卵裂率及囊胚率差异不显著(P0.05);提前添加激素在4℃不能长期保存,而在-20℃能长期冷冻保存,并不会对牛卵母细胞体外受精胚胎的发育产生太大的影响。     

谷胱甘肽（GSH）对牛卵母细胞体外受精胚胎发育的影响

［目的］研究谷胱甘肽（GSH）对牛体外受精胚胎发育的影响。［方法］通过对牛卵母细胞进行体外受精和受精卵体外培养，研究了谷胱甘肽（GSH）对牛胚胎体外发育的影响。［结果］添加谷胱甘肽组的桑囊率分别比对照组高3.34%和2.26%，囊胚发育率分别比对照组高4.57%和4.05%，但差异不显著（P〉0.05）。［结论］GSH在牛体外受精的胚胎发育过程中有一定的保护和促进作用。     

体外生产的牛胚胎在不同发育期的性比率

本研究旨在证实牛体外培养的雄性胚胎生长发育是否快于雌性胚胎。胚胎的性别鉴定采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术。在体外受精的第５天，胚胎根据发育期划分为三个组：１６细胞期，多于１６细胞期和桑椹期。在３个组中，雄性胚胎所占百分率分别是３２％，５３％和６３％。在体外受精的第７天，胚胎根据发育期划分为４个组：桑椹期、早期囊胚期、囊胚期和扩张囊胚期。在性别鉴定后，４个组中雄性胚胎所占百分率分别是２８％，３８％，６０％和７０％。结果表明：牛早期胚胎在体外培养条件下，雄性发育快于雌性。     

生长因子和体细胞共培养对牛体外受精的影响

为研究表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对牛卵母细胞体外发育的影响以及体细胞共培养对体外受精胚胎体外发育的影响,将获取的牛卵泡卵母细胞在含有30μg,LEGF或50mg／L Insulin或30μg／LEGF＋50mg／L Insulin的成熟培养液中进行成熟培养,比较不同生长因子对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响;将受精卵用颗粒细胞单层培养系统或牛输卵管上皮细胞单层培养系统进行体外培养,比较体细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30μg／LEGF或者30μg／LEGF＋50mg／L Insulin可以显著提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率（P〈0．05）;输卵管上皮细胞共培养系统可以显著提高受精后的囊胚发育率（P〈0．05）,可以用于牛体外受精胚胎的体外培养。     

长春花碱在牛体外受精胚中染色体标本处理及性别分析

长春花碱是一种常用的细胞分裂阻止剂,在细胞遗传学分析及体外受精胚的性别鉴定等方面有着重要意义.该研究对牛体外受精胚的第一卵裂期染色体标本制作及性比进行了分析.废弃牛卵巢内卵子经体外成熟培养,体外受精20h后,在培养基中添加100ng/ml长春花碱处理8h或10h.结果表明,用长春花碱处理8h的胚胎标本大部分含有可分析的中期分裂像并可进行性别判断,明显高于10h处理的胚胎标本(P<0.05).性比分析表明,牛体外受精的胚胎的雄性发生率略高于雌性发生率.     

我国首批“试管猪”在江苏省农科院诞生

江苏省农科院胚胎工程研究室范必勤研究员承担了农业部生物技术重点研究项目中的牛、猪、兔体外受精课题。研究者利用屠宰母猪卵巢分离未成熟的卵母细胞,在体外培养成熟处理,后与射出的新鲜精子体外受精,移植8头受     

牛细胞核移植研究简报

本研究探讨了用体外受精胚胎作供体、体外成熟卵母细胞作受体进行核移植的可能性。比较了两种不同核移植方法的效果。本研究结果在我国首次获得牛核移植的成功。     

奶牛性控胚胎体外生产的影响因素及控制措施

针对奶牛胚胎体外生产环节,对体外受精和培养等技术进行了研究,旨在建立奶牛性控胚胎体外生产技术体系。结果表明,卵母细胞外周卵丘细胞至少保持3层以上,在成熟基础液中添加10ng/ml的EGF,利于核质成熟;在精子获能液中添加咖啡因降低精子的存活时间;牛胚胎前3d用CR1aa BSA培养,再用SOFaa 5?S培养,获得高的囊胚发育率,并且添加50ng/mlIGF-I后胚胎的发育得到了很大的改善。利用性控精液进行体外受精,受精率有轻微下降,但对生产的胚胎发育质量无明显(P>0.05)影响,胚胎移植后受胎率为40%左右。     

家畜胚胎体外生产技术

家畜胚胎体外生产技术是胚胎工程技术的重要内容之一。本文对家畜胚胎体外生产的相关主要技术环节,包括卵母细胞的体外成熟技术、体外受精技术及早期胚胎的体外培养技术等进行了综述,同时对该技术的发展前景进行了展望。     

试管奶山羊的研究

1990年6月7日,1只“试管奶山羊”在我校家畜生殖内分泌研究室降生,这是国内首例、世界第二例。 家畜精子体外获能与体外受精是本世纪80年代以来迅速发展起来的一项胚胎工程技术,是纯粹通过体外培养条件达到生产“试管动物”的先进繁殖技术。体外受精研究己有120多年历史,1951年张明觉和Austin分别发现精子获能现象后,开创了哺乳动物体外受精研究的新纪元。当今,通过此项技术已有20种动物获得成功,其中10种动物获得试管后代,包括牛、猪、绵羊和山羊等家畜。 精子体外获能与体外受精主要包括以下技术:(1)精子体外获能;(2)获能精子与成熟卵母细胞共同培养;(3)受精卵的体外培养与移植。其中精子体外获能是关键技术之一。     

现行牛IVF程序在水牛体外受精的应用研究

本研究对我所现行的牛体外受精程序（ＩＶＦ）应用于水牛体外受精的可行性进行了探讨。结果表明，水牛卵巢生长卵泡少，平均仅可回收５枚卵母细胞，只相当于黄牛（１４．３）的１／３。水牛卵母细胞的体外成熟率为５１．７％，体外受精卵裂率为５８．７％，均极显著地低于黄牛黄牛快，体外受精后的第６ｄ囊胚发育率占３６．４％，累计至第７ｄ时占８０．７％，极显著地高于黄牛（５７．６％，Ｐ〈０．００１）。水牛早期胚胎的体外囊     

家畜繁殖生物技术研究现状及趋势

牛胚胎移植技术已趋于成熟。我国新疆牧科院用一步细管法移植牛冻胚受胎率达41%;牛和羊鲜胚四分胚移植也产下1头犊牛和6只羔羊。家畜体外受精,因卵子体外成熟和受精卵体外培养尚不过关,目前仍停留在实验室阶段。胚胎性别鉴定,1990年Koopman发现单拷贝基因,该基因是Y染色体的性决定区,命名为SRY,可利用PCR技术制成雄性特异DNA探针盒,进行马、牛、羊、猪早期胚胎性别鉴定。北京农学院等单位用PCR扩增牛SRY序列进行奶牛胚胎性别鉴定准确率达100%。英、日、法等国已获得牛胚胎细胞核移植后代;我国也获得1只核移植兔。北农大和新疆牧科院合作以绵羊精子为载体导入牛生长激素基因rMTbGH DNA成功,外源基因整合率为3%。     

家畜体外受精技术研究进展

综述了家畜卵母细胞的采集和体外成熟培养,体外受精及胚胎培养的研究进展,指出了家畜体外受精技术存在的问题和发展前景。     

牛体外胚胎生产技术初探

在体外,选择动物的卵母细胞或胚胎并对其进行人工改造,简称为体外胚胎工程技术。进入21世纪,胚胎发展尤为迅速,由于牛的体内胚胎费用较高,而获得的数量又较少,达不到养牛业及研究的需求。因此,开展体外胚胎生产技术尤为重要,对家畜繁殖领域的发展及科学研究也具有重要意义。本文主要对牛体外胚胎生产技术及过程中需要注意的相关问题进行了阐述和分析。     

微流控技术在解决猪体外受精中多精入卵问题中的应用进展

凭借自动化、高灵敏度和高精确度的优势,微流体技术可以实现复杂精细的生物学实验流程控制,保证对试验现象与试验结果的实时准确获取。通过检索近年来微流体装置在哺乳动物卵母细胞体外成熟、体外受精以及胚胎体外培养中的研究报道,总结了微流控技术在哺乳动物胚胎学研究中的应用,提出了将微流控技术应用于猪体外受精技术,目的在于解决并克服猪体外受精中存在的多精入卵,为完善猪体外受精技术提供可行的解决方案,同时为人类医学辅助生殖技术的优化完善提供新思路。     

猪体外胚胎生产的研究进展

与牛羊等动物的体外胚胎生产（in vitro production，IVP）技术相比，猪IVP技术尚不成熟。猪IVP主要存在卵母细胞的细胞质成熟差、多精子受精率高和胚胎质量差的问题，这严重制约了该繁殖生物技术在转基因猪生物反应器领域的应用。笔者在查阅近10年的国内、外相关研究后，从如何优化猪卵母细胞的体外成熟（in vitro maturation，IVM）、体外受精（in vitro fertilization，IVF）和胚胎的体外培养（in vitro culture，IVC）3个方面进行了探讨。     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术制备牛MSTN基因编辑胚胎

为了给双肌肉牛品种的培育提供新的遗传素材,拟利用CRISPR-Cas9基因编辑技术制备牛MSTN基因编辑胚胎。从采集到的86对牛卵巢中收集卵母细胞进行成熟培养以及体外受精,并使用在线软件设计能够在体外高效编辑牛MSTN基因的gRNA序列,将验证后所得的体外切割活性最高的gRNA与Cas9 mRNA的混合物显微注射牛的受精卵,培养至囊胚后,利用T7EI核酸内切酶法检测囊胚中MSTN基因的编辑情况,然后将基因编辑阳性的囊胚样品进行测序验证。结果表明,牛胚胎体外培养平均囊胚率为21.28%;在设计的多条gRNA序列中,gRNA5的体外切割活性最高,为96.00%;将Cas9 mRNA和gRNA5的混合物显微注射受精卵并培养至囊胚后,T7EI核酸内切酶检测表明囊胚MSTN基因切割阳性率为15.40%;对MSTN基因编辑囊胚阳性样品测序表明,在gRNA5靶位点存在部分片段缺失。综上,说明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功获得了牛MSTN基因编辑胚胎。     

5-Aza-CdR 联合TSA对牛核移植胚胎体外发育及表观遗传状态的影响

【目的】探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2-′Deoxycytidine,5-Aza-CdR)联合曲古抑菌素A(Trichosta-tin A,TSA)对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响。【方法】以体外受精胚胎作为对照组,将部分体细胞、核移植胚胎以及体细胞联合核移植胚胎用5-Aza-CdR+TSA(5-Aza-CdR:20 nmol/L,72 h;TSA:50 nmol/L,12 h)进行处理,统计核移植胚胎体外发育率,并对2-细胞、8-细胞和囊胚阶段胚胎进行DNA甲基化和组蛋白乙酰化检测,研究5-Aza-CdR+TSA处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响。【结果】与对照组相比,5-Aza-CdR+TSA单独处理供体细胞和核移植胚胎均可以显著提高克隆胚胎的囊胚发育率和囊胚细胞数(P<0.05);供体细胞和核移植胚胎均用5-Aza-CdR+TSA处理后,核移植胚胎体外发育能力进一步提高,囊胚发育率显著高于单独处理供体细胞或核移植胚胎组(P<0.05)。免疫荧光检测发现,体细胞和核移植胚胎均用5-Aza-CdR+TSA处理,不但显著降低了2-细胞和8-细胞阶段DNA甲基化水平,而且也显著增加了组蛋白乙酰化水平(P<0.05),使核移植胚胎附植前各发育阶段的表观遗传状态更接近于体外受精胚胎。【结论】5-Aza-CdR联合TSA处理供体细胞和核移植胚胎可以更明显地提高克隆胚胎的体外发育能力,改变核移植胚胎的DNA甲基化和组蛋白乙酰化水平,使它们的表观遗传状态及体外发育率更接近于体外受精胚胎。