鸡传染性支气管炎免疫预防的研究进展

鸡传染性支气管炎病毒（IBV）目前已知至少有27个血清型,IBV基因组中的S1基因长度约为1.73Kb,S1基因变异性大,它与IBV的血清型有重要关系。通过对分离出的IBV进行血清型鉴定和致病机理的研究,制定正确的免疫程序和合理选用疫苗或利用自家组织灭活油乳苗对鸡进行预防接种,可有效地免疫预防鸡传染性支气管炎（IB）。     

免疫鸡群肾型传染性支气管炎病毒的分离和鉴定

[目的]鉴定免疫鸡群肾型传染性支气管炎病毒（IBV）。[方法]以接种IBV的鸡胚尿囊液为模板,根据GenBank中登录的IBV的N基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出目的片段,经酶切鉴定后对其进行测序鉴定。[结果]PCR扩增片段长度为409bp,将其Ⅳ基因核苷酸序列与不同地区分离株（山东、黑龙江等）以及欧洲呼吸型疫苗株（M41）的IBV核苷酸序列进行比较,结果表明,不同毒株的核苷酸同源性在85．6％～100．0％,此次分离所得IBV的N基因与IBVSD0708株（EU352625）N基因的核苷酸同源性高达99．3％,而与呼吸型疫苗株M41（M28566）的同源性仅为87．3％。测序结果及序列分析可以证实分离到的病毒为IBV,命名为HN／HL株。[结论]该研究为鸡传染性支气管炎病毒的控制奠定了基础。     

产蛋鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及其遗传变异和血清型分析

[目的]明确产蛋鸡源传染性支气管炎病毒(IBV)分离株(GX-YL170808)的结构基因及抗原变异情况,为广西种鸡场的传染性支气管炎(IB)防控提供科学依据.[方法]通过鸡胚尿囊液血凝试验、鸡胚侏儒化试验及3'端非编码区(3'-UTR)测序对分离株进行鉴定;采用RT-PCR扩增S1、E、M和N基因,以MegAlign和MEGA 6.0分别进行核苷酸序列相似性及系统发育进化树分析,运用RDP4和SimPlot对S1、E、M和N基因进行重组分析,利用NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0进行糖基化位点预测分析,并通过中和试验进行血清型鉴定.[结果]分离株的鸡胚尿囊液血凝试验呈阴性,鸡胚盲传5代后出现侏儒胚典型病变,其3'-UTR序列与IBV的3'-UTR序列相似性为99.13%;综合病鸡临床症状及其病理变化可确定该病毒为IBV,命名为GX-YL170808.GX-YL170808分离株S1、E、M和N基因的开放阅读框(ORF)长度分别为1620、327、675和1230 bp,对应编码540、109、225和410个氨基酸残基,与参考株的核苷酸序列相似性分别为60.4%~96.5%、81.8%~97.2%、85.6%~93.5%和85.7%~92.0%;GX-YL170808分离株的S1、M和N基因属于LX4型,而E基因属于LDT3型;4个结构基因内部均无重组区域;除S1基因同时具有N-糖基化和O-糖基化位点外,E、M和N基因均只有N-糖基化位点;S1蛋白裂解位点为HRRRR,与参考株LX4的裂解位点相同.GX-YL170808分离株属于血清4型,不同于常用的疫苗株H120(血清3型)和4/91(血清5型),也不同于广西主要侵害雏鸡的IBV优势血清型.[结论]产蛋鸡源IBV分离株并非疫苗株,其基因型和血清型均已发生变异,且该毒株的血清型不同于广西地区侵害雏鸡的优势血清型,提示了广西地区IB防控的严峻性及新型多价疫苗研发的紧迫性.     

2010—2013年我国鸡传染性支气管炎病毒分离株S1基因分子特性分析

为掌握近年来我国传染性支气管炎病毒的流行动态和变化规律,利用检测转化至克隆载体鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列,应用MEGA5分析软件进行聚类分析,并对瑞普生物疫病诊断研究服务中心2010—2013年间从我国野外分离并测定的30株传染性支气管炎的S1基因序列与常用疫苗毒株和GenBank中代表性IBV毒株的对应基因序列进行比较,结果发现:1)30株野外分离株可分为2个基因型:LX4型和TW型,分别占总数的93.3%和6.7%;2)LX4型分离株S1基因和氨基酸序列与常见疫苗毒株序列差别很大,同源性仅分别为77.6%~86.3%和75.8%~85.7%;3)分析S基因裂解位点时发现同一基因型毒株的裂解位点氨基酸序列高度趋同,且型间差异性较大。可见,近年来我国主要IBV分离株属于LX4型,并且彼此间亲缘关系较近,与我国现用传染性支气管炎主要弱毒疫苗和国外参考株属于不同的基因型,这可能是导致疫苗免疫失败,传染性支气管炎(IB)在鸡群中爆发的主要原因。该研究结果为筛选针对我国目前流行IBV毒株的疫苗株提供参考。     

鸽冠状病毒的分离与鉴定

从有呼吸道症状、有胰脏充出血、肺脏肉样病变的肉鸽中,通过鸡胚接种、电镜观察和反转录套式PCR分析,证实分离的病毒为冠状病毒;经过动物试验,鸡传染性支气管炎标准毒株（IBV M41）不引起试验鸽感染,而本次分离株对试验鸽具有一定的致病性,表明该分离株与IBV有较大差异,暂命名为鸽冠状病毒（PSH）.     

鸡肾型传染性支气管炎油佐剂灭活苗的研制及应用

以分离的地方肾型IBV为制苗毒株，研制出鸡肾型IB油佐剂灭活苗。疫苗剂型为油包水型，适宜注射并具有较高稳定性。效检免疫保护率100％。疫苗在宁夏3个地区使用5万羽，对鸡安全、有效，能预防和控制肾型IB。     

鸡肾型传染性支气管炎的初步诊断与治疗

【目的】研究河北秦皇岛地区的鸡肾型鸡传染性支气管炎（IB）流行病学、分离鉴定地方代表毒株,为有效防制当地鸡肾型IB及研制具有免疫针对性的疫苗制剂提供参考依据。【方法】通过流行病学调查、临床症状、病理变化观察,取新鲜病死雏鸡肝脏、肾脏组织悬浮液接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔,收集鸡胚尿囊液,分别进行琼脂扩散试验、血细胞凝集（HA）试验和动物试验,并对症进行综合治疗。【结果】接种鸡胚出现典型的蜷缩、侏儒等病变,尿囊液琼脂扩散试验结果表现为阳性,经血清学试验及动物试验证实,该分离毒株为鸡传染性支气管炎病毒（IBV）,结合病理变化,确诊为鸡肾型IB。经对症治疗5d后,病鸡死亡率由1．0％下降至0．4％,鸡群呼吸道症状减轻,产蛋量回升,治愈率为92．4％。【结论】该起病例为鸡肾型IB,防制该病时应根据毒株性状针对性地选择用药及免疫接种。     

鸡肾型传染性支气管炎病变毒株的分离和鉴定

从疑似肾型传染性支气管炎(IB)死鸡肾脏中分离到1株病毒,经鸡胚传代,到第3代,出现卷缩胚,第8代,卷缩胚达到50%。第3~8代的尿囊液经胰蛋白酶处理后对鸡红细胞可引发凝集。以琼脂凝胶沉淀试验检测,病料处理后的收获液、第3~8代鸡胚尿囊液与肾型IBV抗血清均可形成沉淀线,其沉淀线与肾型IBV阳性抗原和肾型IBV抗血清之间形成的沉淀线发生完全融合。该分离株在鸡胚病毒干扰试验中对新城疫病毒LaSota株的增殖有显著干扰作用。动物回归试验,试验鸡感染分离毒株,发病率达100%,死亡率达40%,死鸡的病理变化明显而典型。结果表明,该分离毒株是鸡肾型IBV。     

鸡传染性支气管炎的研究进展

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)易变异,不同血清型毒株之间具有较小的交叉保护性甚至无交叉保护性,因此,IB仍是危害世界养禽业的重要疫病之一。本文收集该病毒分子生物学和免疫学研究进展,认为基因工程疫苗将是未来一个重要的研究方向,并且会有广阔的应用前景。     

鸡传支气管炎病毒分离及S1基因特性研究

应用常规实验室方法对广东地区疑似传染性支气管炎病例进行病原分离鉴定,利用分子生物学技术对分离株S1基因进行克隆与特性鉴定,并与经典株等相应毒株S1高变区氨基酸序列进行相似性比较分析。结果显示,6株病毒分离株均具有明显IBV特征,序列分析证实广东地区存在多种基因型IB流行毒株,主要以LX4血清型为主,与常用疫苗株H52、H120及M4-91亲缘关系较远。     

鸡传染性支气管炎病毒河南流行毒株S1基因的变异分析

经鸡胚接种、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、气管环培养等方法从河南不同地区发病鸡群中先后共分离、鉴定出7株鸡传染性支气管炎病毒(IBV).应用RT-PCR方法对7株病毒以及IBV H120疫苗株的S1基因全序列进行扩增,并对其进行克隆测序及序列分析.结果显示:8株IBV的S1基因全长分为4类,分别是1632、1620、1617和1611 bp;序列相互之间存在多位点变异,同时存在型特异性的插入和缺失;其S蛋白裂解位点序列模式有HRRRR、RRFRR和RRSRR 3种;同源性及遗传进化分析显示Jin-13为呼吸型毒株,YI为ArkDPI型肾型毒株,HN/SG株与国内其他肾型分离株亲缘关系均较远;河南肾型分离株HN/HL、XP/1/09、XP/3、WZL与山东肾型分离株之间的同源性较高且其亲缘关系最近,而与河南HN99株的亲缘关系较远.说明河南地区存在不同的IBV流行毒株,这些漉行毒株在主要保护性抗原蛋白S1基因上发生了一定的变异.     

鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

[目的]从发病鸡群中分离出鸡传染性支气管炎病毒,并对其进行鉴定。[方法]从安徽某鸡场发病鸡群中分离出鸡传染性支气管炎病毒,采用鸡胚盲传,观察病毒对鸡胚的致病作用。通过动物回归试验,在SPF鸡上复制出支气管堵塞的症状,扩增分离毒株的S1基因片段,并与IBV疫苗毒株进行比较。[结果]对分离到的毒株进行HA检测,结果表明收获的尿囊液对鸡红细胞无凝集活性,说明分离到的病毒中无NDV、AIV等,但经1%胰酶处理则可凝集鸡红细胞,符合传染性支气管炎病毒的生物学特征。该毒株的第6代SPF鸡胚尿囊液通过滴鼻接种SPF鸡,可复制出与现场相似的临床症状,其发生了支气管堵塞的现象,初步证实分离的病毒为一株鸡传染性支气管炎病毒,命名为XZ株。[结论]该研究为鸡传染性支气管炎的防治提供了理论依据。     

检测感染鸡体内传染性支气管炎病毒反转录套式PCR方法的建立

根据先前克隆并测定的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列，设计了2对引物，通过对IDV各毒株(M41，H52，H120，Aust-T以及野毒株等)攻毒鸡的组织中的IBV进行反转录套式PCR检测，结果均为阳性，而对鸡的其他传染病病毒(IBDV，AIV，NDV)进行检测，结果均为阴性。结果表明所建立的反转录套式PCR方法可用于感染鸡体内IBV各血清型毒株的检测。     

传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因变异及在大场杆菌中的表达

核衣壳蛋白(N)是传染性支气管炎病毒的主要结构蛋白之一. 以前的研究结果显示IBV-ZJ971毒株以引起腺胃肿大为特征,IBV-X和N毒株以引起肾炎为特征.为了探讨不同组织嗜性传染性支气管炎病毒N基因的变异,我们依据已发表的IBV- Beaudette 毒株N基因的序列设计和合成引物,RT-PCR扩增IBV-ZJ971、N、X和H52的核衣壳蛋白基因,并测序、分析和在E.coli中进行表达.结果显示:IBV-ZJ971、N、X和H52毒株的N基因的ORF由1230 bp组成,编码409个氨基酸.与来源于GenBank中的IBV毒株比较,IBV-ZJ971、N、X和H52与其它IBV毒株的核苷酸同源性分别是87.0-98.6%、86.6-99.7%、86.3-99.7%、87.2%-98.5%,氨基酸的同源性分别是90.0-97.8%、 90.5-98.8%、 90.0-98.8%、 91-98%.IBV-ZJ971毒株的N蛋白不同于其他IBV的独特变异是111,117, 142, 171 和 401位点上的氨基酸改变,IBV-N和X毒株的N蛋白不同与其它IBV的独特变异是46, 48, 189,190, 220, 223, 236, 237, 240, 286, 299, 301 334, 335, 336 and 351位点上的氨基酸改变.说明IBV嗜腺胃毒株(ZJ971)和嗜肾毒株(N和X)的N基因以散在的点突变为特征.将IBV-ZJ971毒株的N基因在E.coli中表达,并用western-blotting检测,发现IBV-ZJ971的N蛋白是一分子量约为45 kD的蛋白.     

鸡肾型传染性支气管炎(IB)疫苗的研制

用鸡传染性支气管炎病毒X株接种10日龄鸡胚尿囊腔,收集尿囊液,经甲醛灭活后,按一定的比例,以矿物油为佐剂制成油乳剂灭活苗,免疫鸡30d后,保护率达100％,并呈现良好的体液免疫应答,血凝抑制抗体效价达2     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。     

RT-PCR和Digoxigenin标记的核酸探针检测鸡传染性支气管炎病毒试验研究

用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一ＩＢＶＨ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ，分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０ｂｐ，２２８ｂｐ，６０２ｂｐ，的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０，Ｈ５２，Ｍ４１，Ｃｏｎｎ，Ｇｒａｙ，Ｔ，Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒，上毒，云毒，ＨＫ，１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ。结果除Ｈｏｌｔｅ株，２个分离株（宜毒，云毒）外，其余均被成功地扩增出６０２ｂｐ的片段。将ＩＢＶＨ１２０株０６ｋｂＰＣＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记为探针，分别与上述各ＩＢＶ毒株的核酸及其扩增产物进行核酸杂交，均呈现阳性反应，而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＤＮＡ，ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液抽提物反应。ＲＴ－ＰＣＲ和核酸杂交技术提供了直接从尿囊液中快速检测出病毒，作为诊断ＩＢＶ的新方法。