三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶定点突变和定向进化研究

三孢布拉氏霉菌中carRA基因编码的CarRA为双功能酶,该酶的R结构域具有番茄红素环化酶的功能,是三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素合成途径过程中的关键酶,其酶活性的高低即环化能力的强弱决定了番茄红素的积累水平。为深入研究三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶的功能,以酿酒酵母菌株W303为出发菌株,首先构建了二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸高效合成的酿酒酵母底盘菌株W303-thmgr-Bts1,在该底盘菌株中表达三孢布拉氏霉菌的carB和carRA基因,完成类胡萝卜素代谢途径的构建。在此基础上对R结构域进行定点突变和随机突变,并成功构建了5个单一保守位点的突变酶和依赖于酵母同源重组的番茄红素环化酶随机突变体库。通过评估各突变株的菌落颜色和测定类胡萝卜素的产量来确定一系列位点的突变对R结构域催化番茄红素合成β-胡萝卜素能力的影响,最终筛选出了影响该蛋白活性的关键氨基酸位点,为三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶的催化机制研究与酶活性改良奠定了理论基础。     

β-胡萝卜素高产菌株的选育

采用紫外线和硫酸二乙酯对三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)负菌进行了2次诱变处理,通过平板初筛和三角瓶摇瓶复筛,得到了一株突变菌株U-D-2,其β-胡萝卜素产量(1 236 mg/L)较原始菌株(635mg/L)提高了94.6％.遗传稳定性试验结果表明,该突变菌株具有较好的遗传稳定性.     

基于诱变和抗性突变的多杀霉素高产菌株的选育

为提高菌株发酵液中多杀霉素产量,本试验利用常温常压等离子体(ARTP)诱变、紫外(UV)诱变和抗性突变技术处理刺糖多孢菌株DS0322-3,结合高通量筛选和摇瓶发酵选育多杀霉素高产菌株。结果显示,通过ARTP诱变和UV诱变育种,筛选获得384株突变菌株,其中有9株突变菌株的效价较原始菌株增加10%以上,且1株效价较原始菌株增加20%以上,经过ARTP诱变30 s,得到的突变菌株AR1019-4效价为547.78 mg/L,较原始菌株增加了21.88%。以ARTP诱变得到的高产突变菌株AR1019-4为出发菌株,通过抗性突变筛选技术筛选获得1 152株突变株,其中13株突变菌株的效价较出发菌株增加10%以上,且2株效价较出发菌株增加15%以上,在0.5 mg/L的氯霉素平板上得到的突变菌株Chl 1215-5效价为637.12 mg/L,较出发菌株增加了16.31%;12 mg/L的庆大霉素抗性突变筛选到了突变菌株Gen 1207-8,效价为597.59 mg/L,该菌株的Spinosyn D组分由10%～15%增加至30%～35%左右,经遗传稳定性试验验证,突变菌株Chl1215-5和Gen1207-8可稳定遗传。试验结果表明ARTP诱变、紫外诱变和抗生素突变技术对选育多杀霉素高产菌株具有重要意义。     

β-胡萝卜素发酵及提取工艺的研究

[目的]研究三孢布拉氏霉菌β-胡萝卜素发酵及其提取工艺的优化。[方法]利用三孢布拉氏霉菌发酵β-胡萝卜素,并通过分析发酵时间、干燥方法、保藏方式等因素对β-胡萝卜素含量的影响,确定β-胡萝卜素的制取工艺。[结果]试验得出,最适发酵时间为5 d,干燥方法为真空冷冻干燥机干燥法,保藏方法为下罐后较短时间内提取。按此工艺条件得到的β-胡萝卜素胞内含量为5.80%,发酵液中β-胡萝卜素含量可达到0.44 g/L。[结果]研究可为发酵法生产β-胡萝卜素及其提取工艺研究提供参考依据。     

常压室温等离子体(ARTP)对脱落酸产生菌的诱变效应

[目的]研究ARTP对脱落酸产生菌的诱变效应及有效性,以期获得高产突变菌株。[方法]应用ARTP在电源功率100 W、等离子体温度25℃、气流量10 SLM、照射距离2 mm的条件下,进行不同照射时间的诱变处理,统计致死率、正变率、变异幅度等。[结果]在100 s的处理剂量下,ARTP对脱落酸产生菌的正变率在20%以上,诱变幅度在-30.53%~22.06%,高产突变株6-2的S-ABA产量比出发菌株提高22.06%,且经连续5次传代试验,产量无明显变化。[结论]ARTP对脱落酸产生菌的正变率高、诱变幅度大,所获高产突变株的稳定性好。     

三孢布拉氏霉中β-胡萝卜素的提取研究

[目的]确定从三孢布拉氏霉干菌体中提取β-胡萝卜素的溶剂种类及提取条件。[方法]以发酵所得的三孢布拉氏霉干菌丝体为原料,通过单因素试验考察了不同溶剂种类、料液比、提取时间和提取温度对β-胡萝卜素提取得率的影响。[结果]试验得出,乙醇提取得率较低,而丙酮、石油醚、乙酸乙酯和正己烷4种溶剂从三孢布拉氏霉干菌体中提取β-胡萝卜素的得率几乎相同。从价格因素考虑,选取石油醚作为提取溶剂。适宜的提取条件为料液比1∶15 g/ml,提取时间2 h,提取温度40℃,提取得率可达约16 mgβ-胡萝卜素/g干菌体。[结论]该研究可为利用三孢布拉氏霉发酵法生产天然β-胡萝卜素提供依据和参考。     

木霉菌素产生菌的诱变育种

[目的]筛选高产木霉菌素菌株,提高木霉菌素产量。[方法]以从枸骨中分离到的产木霉菌素的内生真菌———哈茨木霉为出发菌株,进行紫外线二次复合诱变处理,将筛选出的突变菌株连续转接5代,测定其遗传稳定性。[结果]随着照射时间的延长,哈茨木霉的致死率增大,选取致死率为88.1%的紫外线照射45 s作为最适处理剂量进行诱变育种。经过2次诱变的菌株的产孢时间提前,长出的菌落更为致密。经过初筛和复筛,最终获得1株高产突变株UV-5-3,其产抗生素的水平最高,为164.75μg/m l,比初次诱变筛选获得的突变株UV-3-1提高了56.77%,是出发菌株的2.3倍。传代试验表明,突变株UV-5-3的高产性能遗传特性稳定。[结论]利用紫外线二次复合诱变处理哈茨木霉可以获得高产木霉菌素菌株。     

三孢布拉霉菌发酵生产β-胡萝卜素的代谢调控

[目的]研究三孢布拉霉菌发酵生产β-胡萝卜素的代谢调控途径,为通过优化发酵培养条件来提高β-胡萝卜素的产量提供依据和参考。[方法]采用紫外分光光度计测定β-胡萝卜素的含量,优化正负菌孢子接入种子培养基的接种比例,通过对三孢布拉霉菌发酵生产β-胡萝卜素的代谢调控分析,确定最佳补液时间,优化培养温度和接种比例来提高β-胡萝卜素的产量。[结果]最佳孢子接种比例为正菌∶负菌=10∶1,最佳补液时间为52 h,最佳培养温度为27℃,最佳种子液接种比例为8%。[结论]通过对菌体生长代谢的分析优化了培养条件,并将β-胡萝卜素的产量从1.45 g/L提高到2.26 g/L,产量提高了55.9%,取得了较好的效果,为β-胡萝卜素的工业化生产奠定了基础。     

NTG-LiCl复合诱变选育链霉菌702菌株

为筛选出产新农抗702的高产链霉菌702突变株.分别以链霉菌702菌株为试验材料和以庆大霉素为敏感抗生素,NTG-LiCl复合诱变链霉菌702菌株,获得抗庆大霉素突变株.NTG处理90 min对菌株的致死率可达71.56%,抗药性突变率高达19.46%,获得的抗药性突变株经过摇瓶初筛和复筛,获得高产突变株13-18-52菌株,产抗新农抗702的摇瓶发酵单位达到1 946 μg/mL,比出发菌株发酵单位1 416 μg/mL提高了37.43%.采用抗药性致死突变标志的NTG-LiCl复合诱变筛选模型可以获得产新农抗702的链霉菌702高产菌株.     

60Coγ射线对辅酶Q10产生菌三孢布拉氏霉的诱变选育

采用不同剂量的60Coγ射线对辅酶Q10产生菌——三孢布拉氏霉JSF 4菌株的孢子进行处理。结果表明,诱变剂量1.5 kG y对孢子的致死率为85%,具有较好的诱变效果。经复筛,分离得到了1株F 4-3菌株,其发酵平均单位达24.766 m g/L,较出发菌株提高了76%,且该菌株遗传性状稳定。     

~(60)Co射线对辅酶Q_(10)产生菌三孢布拉氏霉的诱变选育

采用不同剂量的60Coγ射线对辅酶Q10产生菌——三孢布拉氏霉JSF 4菌株的孢子进行处理。结果表明,诱变剂量1.5 kG y对孢子的致死率为85%,具有较好的诱变效果。经复筛,分离得到了1株F 4-3菌株,其发酵平均单位达24.766 m g/L,较出发菌株提高了76%,且该菌株遗传性状稳定。     

壳低聚糖高产菌的诱变选育

[目的]探讨壳低聚糖高产菌诱变选育的方法。[方法]以壳低聚糖产生菌蓝色犁头霉ZH08为出发菌株,经紫外诱变和亚硝酸诱变处理,以对硝基乙酰苯胺为指示剂,利用双层平板颜色反应法,挑取菌落黄色比较深的脱乙酰酶高活性突变株,再经摇瓶发酵复筛,以获得壳低聚糖产量较高的菌株。[结果]通过对出发菌株ZH08进行理化诱变,获得突变株共7株（XH01～07）,经过反复传代和筛选,这几株突变株的壳低聚糖含量均高于出发菌株,其中XH05菌株的壳低聚糖含量最高,其产量稳定在1.07 g/L,比出发菌株提高72.6%。[结论]利用对硝基乙酰苯胺作为筛选具较高甲壳素脱乙酰酶酶活的跟踪试剂,用于筛选壳低聚糖高产菌株,是一种快速、有效的筛选方法。     

多重复合诱变选育金霉素高产菌株

为提高金色链霉菌产金霉素水平,增大突变多样性,研究常压室温等离子体(ARTP)、紫外线与氯化锂复合诱变对构建金色链霉菌突变库的影响。结合前体物及高浓度产物耐受性确定筛选模型,通过初筛及摇瓶复筛,选育获得2株菌落形态特性改变、金霉素效价较出发菌株提高20%以上,且其高效价特性稳定的高产金霉素突变菌株。基于多重复合诱变和前体/产物耐受构建了高产菌株选育模型,不仅突变库的多样性更高,而且简便快捷,提高了筛选效率,并减少筛选工作量,对金霉素及其他链霉菌来源抗生素的生产成本降低和产能提高都具有一定的应用价值和指导意义。     

Co60γ射线照射技术在阿维菌素产生菌诱变育种中的应用

为了筛选获得阿维菌素总效价及有效组分Bla含量高的阿维链霉菌突变株,应用Co60γ射线照射并结合甲硫氨酸筛选模型和5-氟尿嘧啶筛选模型对出发菌株阿维链霉菌H20-16进行诱变处理,使用高效液相色谱法检测发酵单位与有效组分B1a的含量.通过筛选获得发酵单位提高的菌株Co3-15和CF(20)-39-61,比出发菌株分别提高了173.3%、76.5%;Bla组分提高的菌株Co35-9和CM35-12,比出发菌株分别提高了12.1%、16.7%.从而得出,利用Co60γ射线照射并结合甲硫氨酸和5-氟尿嘧啶筛选模型诱变处理阿维菌素产生菌,诱变效果显著.     

复合诱变选育高产洛伐他汀红曲菌

为了提高紫色红曲霉菌M21发酵产洛伐他汀的含量,首先确定了紫外线、亚硝酸和氯化锂单诱变剂的最适诱变剂量,再采用紫外-亚硝酸和紫外-氯化锂复合诱变剂对出发菌株M21进行诱变选育。结果表明:最适处理剂量为紫外线照射时间90s,亚硝酸处理时间30min,氯化锂处理浓度0.8‰。紫外-氯化锂复合诱变剂在最适处理剂量下对原始出发菌株M21的复合诱变效果更佳,得到了3株高产突变菌株ULi17、ULi19和ULi26,洛代他汀产量比出发菌株分别提高75.2%、60.4%和67.0%,遗传稳定结果显示ULi17产量最高、遗传性状较为稳定,因此将ULi17确定为后续研究的出发菌株。     

低能离子注入诱变选育盐霉素高产菌株

[目的]研究N+离子注入对白色链霉菌的诱变效应,同时筛选高产盐霉素的变异菌株。[方法]利用不同剂量的氮离子对白色链霉菌S-11-04菌株进行诱变处理,研究低能氮离子注入对其存活率、菌落形状及产盐霉素能力的影响。[结果]低能氮离子注入对白色链霉菌的诱变效应显著,试验得到了13株盐霉素产量较高的突变菌株,其中N3-6菌株经连续传代4次,遗传稳定性较好,其摇瓶发酵水平较对照提高了41%,发酵生产后平均发酵水平提高了20.5%。[结论]离子注入诱变是获得高产盐霉素突变菌株的有效方法。     

毒死蜱降解菌枝孢霉菌的紫外诱变和筛选

通过紫外诱变毒死蜱降解菌枝孢霉菌Cladosporium cladosporioidesHu-01,利用高效液相色谱(HPLC)检测,筛选获得12株突变菌株,其中突变株Hu-01-4和Hu-01-6的降解效果明显高于初始菌株Hu-01.突变株Hu-01-4和Hu-01-6经过加药斜面传种10代,Hu-01-6的降解率比初始菌株提高11.74%,并且保持良好的稳定性.突变菌株Hu-01-6在28℃、pH6.5培养条件下的生长量最大,降解率最高,且均明显高于初始菌株Hu-01.     

常压室温等离子体(ARTP)诱变快速选育对亚洲玉米螟高毒的苏云金芽孢杆菌突变株

采用常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变苏云金芽孢杆菌Bt-NBIC-380菌株,选育对亚洲玉米螟高毒力突变株。经过4轮的ARTP诱变、镜检及摇瓶发酵筛选得到的突变株Bt-NBIC-380-18-407,其摇瓶发酵液对玉米螟二龄幼虫效价达到6 835 IU/μL,杀虫晶体蛋白含量6.3 mg/mL。该突变株的效价较初始菌株提高了25.7%,杀虫晶体蛋白含量提高了18.9%。经过5次传代,证实该突变株具有良好的遗传稳定性。     

纳他霉素高产菌株的诱变选育

以褐黄孢链霉菌(ATCC13326)为出发菌株,紫外诱变后,结合链霉素抗性筛选法选育纳他霉素高产菌株.原始菌株活化后,测定其最小链霉素抑制质量浓度为8 μg/mL.采用90% 的紫外致死剂量,照射108 mL-1 ATCC13326孢子悬液,诱变后涂布于8 μg/mL链霉素选择培养基上,筛选链霉素抗性突变株.通过形态指标初步选择5株突变株进行发酵性能测定,种子培养26 h,摇瓶发酵96 h,用紫外分光光度计在303 nm下测定其吸光值,计算纳他霉素发酵产量.结果表明原始菌株纳他霉素发酵产量为1.229 g/L,诱变获得的两株高产突变株纳他霉素发酵产量分别为1.552和1.776 g/L,分别高出原始菌株26.3%、44.5%.     

红曲霉紫外诱变选育多糖高产菌株

利用紫外线(波长254 nm)对出发菌株红曲霉AS 3.4701进行诱变处理,经过初步筛选确定最佳诱变时间为2.0 min。再经过复筛获得了1株最佳突变株ZH-100,该突变株经连续3次传代,红曲粗多糖的产量分别是4.26,4.69,4.10 g/L,平均4.35 g/L,证明该菌株具有稳定的遗传性,比出发菌株多糖产量提高286%。