柑橘品种鉴定的SSR标记开发和指纹图谱库构建

【目的】筛选出一套SSR核心引物,用于构建柑橘品种的DNA指纹图谱库,为柑橘种苗认证、品种登记和植物新品种保护提供技术支撑。【方法】以柑橘属8个主要栽培种类为试材进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,筛选出多态性丰富、扩增条带稳定的引物对部分参试品种进行PCR扩增,扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进一步的引物筛选;筛选得到的引物进行荧光标记,并选用部分柑橘品种进行PCR扩增,扩增产物利用基因分析仪检测,分别计算各引物的PIC值、等位基因数目,选取一套多态性丰富的适合进行荧光毛细管电泳检测的SSR引物组合,进而对所有参试品种进行分析,构建柑橘品种的DNA指纹图谱库,同时利用筛选的SSR标记对参试品种进行鉴定。【结果】初期以柑橘属8个种的代表品种(太田椪柑、沙田柚、沅江酸橙、大红甜橙、邓肯葡萄柚、枸橼、费米耐劳柠檬和墨西哥来檬)为材料,用362对SSR引物进行PCR扩增,扩增产物经4%琼脂糖凝胶电泳检测,初步筛选出80对种间多态性高、扩增稳定的SSR引物;进一步从8个种类里选择不同类型的64个柑橘品种,用上述筛选出的80对SSR引物进行PCR扩增,扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,再筛选出60对品种类型间多态性高、扩增稳定、条带清晰的SSR引物,并分别进行荧光标记;另以168份柑橘品种为材料对上述60对SSR引物进行PCR扩增,经荧光毛细管电泳检测,依据各引物的PIC值、等位基因数目、峰图读取难易程度、扩增稳定性及染色体位置等,最终筛选出21对SSR引物作为指纹图谱库构建的核心引物。为消除不同仪器、不同试验批次等引起的误差,为21对SSR引物各主要等位变异选择相应的参照品种。根据各引物标记的荧光颜色及扩增片段大小进行合理组合,21对SSR引物可分成5组进行多重电泳,共采集500份柑橘品种的DNA指纹。利用SSR标记,有111份品种仅用1对引物即可鉴别,86份品种用2对引物组合即可鉴别,24份品种用3对引物组合即可鉴别,另外279份品种虽无法单独一一鉴别,但可分为87个小组,组内品种无法区分,组间品种易鉴别。【结论】利用筛选出的21对SSR核心引物,构建了包含500份柑橘品种的DNA指纹图谱库,筛选出部分品种的特异标记,可以鉴别221份柑橘品种和87个品种组合,构建了基于毛细管电泳平台的柑橘SSR分子标记品种鉴定体系。     

肉中猪源性成分Real-time PCR定量检测技术

【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA,根据微卫星DNA核酸序列设计引物,对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增,通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列,设计特异性引物和探针,建立猪源性成分Real-time PCR检测方法,采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量,计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA（Accession EF172428）,根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带,其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25 μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分,百分误差分别约为1.32%和1.06%—7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。     

利用Agilent 2100 Bioanalyzer检测食源致病性沙门氏菌

探讨Agilent 2100 Bioanalyzer芯片分析系统在检测食源致病性沙门氏菌的应用.根据致病性沙门氏菌的致病基因invA设计特异性引物扩增出致病性沙门氏菌特异性序列,然后分别用常规的琼脂糖电泳技术和Bioanalyzer对PCR产物进行检测,并比较两种检测方法的准确度、重复性和灵敏度.Bioanalyzer的准确度和重复性比琼脂糖凝胶电泳高,Bioanalyzer的准确度在95%以上,琼脂糖凝胶电泳仅为85%;Bioanalyzer的检测灵敏度也比琼脂糖凝胶电泳高.Bioanalyzer芯片分析系统结合PCR方法可对食源性致病菌进行特异、准确、稳定、灵敏的检测和鉴定,具有重要的推广价值.     

枣瘿蚊微卫星标记筛选及微卫星多态性分析

【目的】研究枣瘿蚊基因遗传变异程度,分析基因多态性。【方法】从枣瘿蚊部分基因组序列中搜索SSR并设计相应引物,挑选引物48对进行有效筛选。枣瘿蚊样本来自新疆阿拉尔市、昆玉市、且末县等地区,以枣瘿蚊DNA为模板进行PCR扩增,筛选特异性微卫星引物;通过琼脂糖凝胶电泳进行定性检测,再以毛细管电泳检测其多态性。【结果】有42对引物能扩增出条带,选择其中20对特异性较好的引物进行多态性分析。观测杂合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(Expected heterozygosity,He)和多态信息含量(PIC)平均值分别是0.358、0.649和0.635,其中18对引物PIC值＞0.5,具有较高的多态性。【结论】开发的微卫星标记多态性较高,可用于枣瘿蚊种群遗传多样性及遗传结构研究。     

山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件的优化

[目的]优化山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件.[方法]以山楂为研究材料,采用改良的CTAB法分步提取叶绿体DNA和核DNA.从8对候选引物中分别筛选适合对叶绿体DNA和核DNA进行PCR扩增的引物,同时进行PCR-SSCP反应体系和反应条件的优化.琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物.[结果]筛选出ropB、ropL、rpoC1、ITS2和psbA-tmH五对引物适用于山楂的PCR-SSCP分析.电泳时,上样缓冲液(不含甘油)与PCR产物等量混合,98℃碱(1％NaOH)变性15min,采用6％的聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),电泳缓冲液0.5×TBE,在4℃恒温和200 V恒压的条件下,电泳3～4 h,可得到较好的山楂PCR-SSCP电泳图谱.[结论]建立了山楂PCR-SSCP最优反应体系与反应条件,为山楂SSCP分析奠定基础.     

山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件的优化（英文）

[目的]优化山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件。[方法]以山楂为研究材料,采用改良的CTAB法分步提取叶绿体DNA和核DNA。从8对候选引物中分别筛选适合对叶绿体DNA和核DNA进行PCR扩增的引物,同时进行PCR-SSCP反应体系和反应条件的优化。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物。[结果]筛选出ropB、ropL、rpoC1、ITS2和psbA-trnH五对引物适用于山楂的PCR-SSCP分析。电泳时,上样缓冲液(不含甘油)与PCR产物等量混合,98℃碱(1%NaOH)变性15min,采用6%的聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),电泳缓冲液0.5×TBE,在4℃恒温和200 V恒压的条件下,电泳3~4 h,可得到较好的山楂PCR-SSCP电泳图谱。[结论]建立了山楂PCRSSCP最优反应体系与反应条件,为山楂SSCP分析奠定基础。     

三叶崖爬藤DNA提取及RAPD引物筛选

采用CTAB法提取三叶崖爬藤基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测,选择条带清晰的模板进行RAPD试验.设计PCR扩增程序,构建RAPD反应体系,在PCR仪上进行扩增反应,通过琼脂糖凝胶电泳检测筛选出4条具有多态性的RAPD引物.     

柑橘大实蝇微卫星标记的筛选

【目的】筛选可用于柑橘大实蝇（Bactrocera minax）种群遗传研究的微卫星标记。【方法】选取33对柑橘大实蝇同属种柑橘小实蝇（B. dorsalis）、木瓜实蝇（B. papayae）、瓜实蝇（B. cucurbita）、东澳番茄实蝇（B. cacuminata）中多态性较好微卫星引物,通过对PCR扩增产物进行琼脂糖电泳初筛选及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳再筛选,并对其等位基因频率、多态信息含量和有效等位基因数等指数进行分析。【结果】33对微卫星引物中有12对引物对柑橘大实蝇有扩增条带,其同源率为36.4%。6个微卫星位点在柑橘大实蝇上共检测到 23个等位基因,平均等位基因数为3.83 个;6对微卫星引物的平均多态信息含量（PIC）为0.2248,最高为0.4105,最低为0.0869。【结论】所筛选出的6对微卫星引物表现出较好的多态性,可用于后续对柑橘大实蝇的种群遗传研究。     

柑橘黄龙病病原DNA提取方法比较

【目的】筛选出一种快速高效获取柑橘黄龙病病原DNA的提取方法,为黄龙病亚洲种病原的检测奠定基础。【方法】选取5份疑似黄龙病症状柑橘叶片样品,分别采用4种试剂盒（快捷型基因组DNA提取系统、新型植物基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒、快速DNA提取扩增套装）及CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA,并用柑橘黄龙病亚洲种的16SrDNA特异引物fD1／fD2和01I／012c进行PCR扩增,DNA提取产物及PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳上检测。【结果】快捷型基因组DNA提取系统获得的DNA质量最好,植物基因组DNA提取试剂盒和CTAB法提取DNA方法提取得到的DNA质量较好,新型植物基因组DNA提取试剂盒所获得的DNA质量较差,快速DNA提取扩增套装所获得的DNA质量最差。除陕速DNA提取扩增套装外,其余4种DNA提取方法均扩增出黄龙病亚洲种病原。【结论】快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒操作简单快捷,耗时短,提取的DNA效果较好,能够满足黄龙病病原PCR检测的要求。     

柑橘黄龙病病原DNA提取方法比较

【目的】筛选出一种快速高效获取柑橘黄龙病病原DNA的提取方法,为黄龙病亚洲种病原的检测奠定基础。【方法】选取5份疑似黄龙病症状柑橘叶片样品,分别采用4种试剂盒（快捷型基因组DNA提取系统、新型植物基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒、快速DNA提取扩增套装）及CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA,并用柑橘黄龙病亚洲种的16S rDNA特异引物fD1/fD2和OI1/OI2c进行PCR扩增,DNA提取产物及PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测。【结果】快捷型基因组DNA提取系统获得的DNA质量最好,植物基因组DNA提取试剂盒和CTAB法提取DNA方法提取得到的DNA质量较好,新型植物基因组DNA提取试剂盒所获得的DNA质量较差,快速DNA提取扩增套装所获得的DNA质量最差。除快速DNA提取扩增套装外,其余4种DNA提取方法均扩增出黄龙病亚洲种病原。【结论】快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒操作简单快捷,耗时短,提取的DNA效果较好,能够满足黄龙病病原PCR检测的要求。     

基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究

【目的】建立基于荧光显色的可视化禽传染性支气管炎病毒（IBV）环介导等温扩增（LAMP）检测体系,为IBV的快速临床检测提供有力的技术支持。【方法】根据NCBI中收录的IBV 5a+5b基因的8个区域设计了3对LAMP引物,通过对反应体系各组分和条件的优化,建立IBV LAMP检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行验证。分别用SYBR Green I和一定浓度比的钙黄绿素/锰离子混合物作为显色剂,对IBV LAMP检测结果进行可视化判定。应用该检测体系和PCR方法对临床送检的60份样品同时进行检测,比较2种方法的阳性检出率。【结果】成功建立了IBV LAMP检测方法,该方法能够在等温（63 ℃）条件下1 h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低可以检出1拷贝/μL的阳性重组质粒,比普通PCR方法敏感100倍,而对其他病毒检测结果均为阴性。应用SYBR Green I和钙黄绿素/锰离子显色时,阴阳性样品均有强烈的颜色对比,其中0.05 mmol/L钙黄绿素与0.6 mmol/L锰离子混合液可以用于LAMP扩增产物的判断,其结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。在对60份临床样本的检测中,LAMP和PCR方法检测出的阳性样本数量分别为49份和42份。【结论】建立了基于荧光显色的IBV LAMP检测方法,该方法具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力。     

基于SSR荧光标记的79份桃种质遗传多样性分析

【目的】利用SSR荧光标记毛细管电泳技术对取自国家果树种质南京桃资源圃的79份种质进行基因分型和遗传多样性分析,筛选出多态性高的引物可用于桃品种间鉴定、亲缘关系分析,并用于分子标记辅助选种体系建立。【方法】对母本‘中油4号’进行从头测序,以物理距离1 Mb为单位在全基因组范围内开发SSR标记。以79个桃品种为材料进行PCR扩增,扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后筛选目标条带清晰且多态性丰富的标记。对筛选出的标记进行5′端荧光修饰,PCR产物在ABI3730XL测序仪测序,实现对标记的复筛。利用Genemapper 4.0软件对测序结果进行统计,Data Formater 2.1软件将统计得到的bp数据转换成Power Marker v3.25软件所需要的数据格式。对筛选出的引物进行多态性分析,选择多态信息含量（PIC）大于0.45的荧光SSR引物作为79份种质材料的核心引物。以Nei’s为参数,利用NTSYSpc 2.1软件中的UPDM聚类方法分析品种间的遗传多样性。利用基于贝叶斯模型的Structure v2.3.4软件解析79份种质的居群遗传结构。【结果】基于79份种质,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对覆盖全基因的SSR标记进行初筛,共筛选出207对多态性良好的引物;利用SSR荧光标记毛细管电泳技术对207对引物进行复筛,最终筛选出26对核心引物,利用其中5对核心引物可将79份品种完全区分开。26对SSR核心引物在79份桃种质中共扩增出174种多态性基因型,每对引物扩增出的基因型为4—13种,平均每对引物扩增出6.69个基因型,每对引物的多态信息含量PIC在0.45以上。基于207对SSR引物在79份种质中扩增出的位点信息,构建了79份种质的遗传关系图谱和居群遗传结构图。207对引物从遗传距离上将79份种质划分为7组,从居群结构上分为2组。79份品种遗传多样性较高,部分品种聚类结果与系谱图相符。【结论】构建了79份材料的聚类分析图和居群遗传结构图,在一定程度上揭示了79份材料的亲缘关系。由于桃复杂的遗传背景,不能依据单一特性对品种间亲缘关系进行判定。本研究筛选出的26对核心引物可用于全基因组范围内连锁性状的鉴定、桃种质资源鉴定、新品种鉴定及保护、分子标记辅助育种体系构建。     

海岛棉抗枯萎病性状与 SSR标记的关联分析

【目的】运用SSR( Simple sequence repeat) 分子标记关联分析204份海岛棉种质资源的抗枯萎病性状,为抗枯萎病棉花育种材料的利用、分子标记辅助选择提供参考。【方法】采用前期实验室研究的抗病基因序列,设计出40对SSR分子标记,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测筛选标记引物特异性,并鉴定204份海岛棉种质资源。【结果】(1)从40对引物中筛选出6对引物具有多态性,多次重复后选用CHS-04和CHS-05两个分子标记,均来自类黄酮代谢途径;(2)引物CHS-04扩增条带与群体抗病性一致率介于41.67%~52.94%,平均值为46.67%;引物CHS-05扩增条带与群体材料一致率介于30.39%~54.68%,平均值为35.78%。【结论】引物CHS-04和CHS-05可以作为海岛棉枯萎病抗性的分子标记鉴定指标。     

草莓植株中病毒dsRNA的分离和鉴定

 【目的】病毒核酸分离是病毒基因组解析的基础，本研究旨在建立草莓病毒的dsRNA分离方法，获得草莓主要病毒的部分基因组序列。【方法】采用改进的dsRNA分离方法，对草莓病毒指示植物和栽培品种中的病毒dsRNA进行分离，通过琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR来鉴定。【结果】不同草莓品种中病毒dsRNA的含量不同，试管苗叶片中dsRNA含量高于露地苗幼叶，而露地苗幼叶中dsRNA含量明显高于完全成熟叶。dsRNA对DNase Ⅰ具有很强的耐性；当酶解缓冲液中含0.5 mol·L-1 NaCl时，dsRNA对RNase A具有较强的耐性。利用DNA凝胶回收试剂盒，能够有效回收凝胶中的dsRNA片段。应用RT-PCR技术，从凝胶回收的dsRNA及DNase Ⅰ/RNase A两酶酶解处理后的dsRNA中分别扩增出草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒的特异片段。【结论】建立了从草莓植株中分离和鉴定病毒dsRNA的完整技术体系，为草莓病毒中国分离物的基因组解析奠定了重要基础。     

RT-PCR检测CPIV方法的建立与应用

【目的】建立CPIV的RT-PCR检测方法。【方法】从临床上疑似犬副流感(CPI)的犬鼻腔分泌物中提取CPIV总RNA。根据Genebank中收录的CPIV(序列号AY581307)中NP基因保守序列,设计一对特异性引物,扩增出667 bp片段,以此建立CPIV的RT-PCR检测方法。【结果】特异性试验表明该引物不能扩增犬其它常见的传染病病毒基因。敏感性试验表明该引物能检测到10~(-6)的CPIV总RNA量。重复性试验表明该引物具有良好的稳定性和重复性。对临床采集的32份样品进行RT-PCR检测时,阳性率为53.12%。【结论】实验建立了CPI的RT-PCR检测方法,可适合于临床CPIV的早期快速诊断和小规模的分子流行病学调查。     

广西砂糖橘黄龙病亚洲种的Nested—PCR检测

【目的】利用柑橘黄龙病病原亚洲种16S rDNA序列的特异引物检测疑似黄龙病的砂糖橘叶片样品,为砂糖橘黄龙病的综合防控提供理论依据。【方法】选取采自广西9市17个采样点的214份疑似黄龙病及无症状砂糖橘叶片样品,用试剂盒法提取叶脉基因组DNA,采用柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA特异引物进行PCR扩增,扩增结果在1%琼脂糖凝胶电泳上检测,统计待检样品柑橘黄龙病病原菌亚洲种的带菌率。【结果】对214份样品的Nested-PCR扩增结果,部分样品可得到1160 bp左右的特异条带,与预期大小相符但条带明暗不同。来自广西9市17个采样点的砂糖橘叶片样品均检测出黄龙病亚洲种病原,平均检出率均在66.0%以上,其中检出率最高的是来自东兴市的样品,检出率为100.0%,检出率最低的是来自南宁市的样品,检出率为66.9%;斑驳、缺素型黄化、叶脉黄化、小叶和无症状叶片样品中均可检测出黄龙病亚洲种。【结论】Nested-PCR技术具有灵敏度高、特异性强的特点,能够快速、准确检测出各种症状样品的黄龙病病原,可用于柑橘黄龙病的早期诊断。     

梨树苹果茎痘病毒PRINS检测中引物的设计及退火温度的测定

[目的]利用5条引物目的片段进行扩增,完成PRINS检测中引物及其退火温度的测定.[方法]采用确认带有ASPV的库尔勒香梨叶片,以叶片为试验材料,并采用经RT - PCR检测技术健康香梨的叶片作为阴性对照.引物采用NCBI提供的BLAST工具中的ASPV病毒的全基因组序列的外壳蛋白的保守区域进行设计.并根据PRINS特有的性质及ASPV病毒有片断相互重叠现象来设计相应的引物.[结果]这5条引物之间没有太多的干扰,且都在目的区域出现了比较清晰的条带.[结论]证明所设计引物可以在进一步的PRINS检测ASPV病毒时直接使用,为PRINS在梨树病毒检测方面发挥更大的作用奠定了基础.