TLR4基因在绵羊不同生理状态下子宫内膜组织中的mRNA表达

为了研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)在绵羊胚胎附植期和发情周期子宫内膜中mRNA的表达模式。采用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR分别检测妊娠21 d母羊全身组织和妊娠9、13、17、21、25 d的母羊子宫内膜组织TLR4基因的表达以及绵羊卵泡期与黄体期母羊子宫内膜组织TLR4基因的表达。结果表明,TLR4基因在肝脏、脾脏、卵巢、输卵管、子宫、小肠、膀胱、肌肉及松果体等组织出现表达,其中在输卵管、卵巢、子宫、膀胱、脾脏及松果体中表达量较高,在肝脏、小肠、肌肉中表达较弱,而在心脏、垂体、脂肪等组织中不表达。从妊娠9 d开始,绵羊胚胎TLR4基因表达量呈逐渐下降趋势;至胚胎附植点17 d,TLR4基因表达量最低,之后又呈现上升趋势,到25 d达到峰值。不管是在细毛羊还是在湖羊子宫内膜组织中检测,TLR4基因黄体期的表达水平均显著高于卵泡期(P 0. 05)。说明TLR4的mRNA表达具有组织特异性,在胚胎附植期绵羊子宫内膜中呈现先低后高的趋势,以及其在绵羊发情周期中表达出现黄体期显著高于卵泡期现象,也初步说明了TLR4可能在胚胎附植早期和发情周期中均发挥一定作用。     

牦牛HSP27基因的克隆及其在雌性生殖器官中的表达

【目的】克隆牦牛热休克蛋白27(heat shock proteins27,HSP27)基因,分析其生物学特性,研究正常生理条件下HSP27基因在母牦牛主要生殖器官中的表达差异。【方法】采取卵泡期后期、黄体期后期同侧的卵巢、输卵管和子宫,以及妊娠期早期（胚胎约长2.3cm）妊娠侧的卵巢、输卵管和子宫组织,以其cDNA为模板,利用RT-PCR扩增牦牛HSP27基因,并将纯化的PCR产物克隆到pMDTM18-T Vector 载体中进行测序;利用生物信息学软件对HSP27基因的特征进行生物信息学分析,预测功能结构域;采用实时荧光定量 RT-qPCR 测定繁殖周期母牦牛主要生殖器官中的相对表达量,用SPSS19.0软件对试验数据进行差异显著性分析。【结果】成功克隆出包含完整编码区的牦牛HSP27基因序列,其编码区长450bp（GenBank 登录号：KP716832）,可编码149个氨基酸,其中含量最高的是亮氨酸Leu（10.7%）,含量最低的是色氨酸Trp（0.7%）。HSP27编码区蛋白原子个数为2 366,分子式为C747H1189N205O220S5,分子量为16.722kD,理论等电点为5.33;HSP27编码蛋白为非跨膜可溶性蛋白。同源性分析显示,牦牛HSP27基因的核苷酸序列与家牛、印度水牛、绵羊、藏羚羊、虎鲸、野骆驼、野猪、马、灰狼、人和猩猩的核苷酸序列同源性分别为99.8%、98.4%、97.8%、97.6%、90.3%、89.7%、89.7%、86.7%、86.7%、85.5%和85.3%,牦牛HSP27基因的氨基酸序列与家牛、印度水牛、绵羊、藏羚羊、虎鲸、野骆驼、野猪、马、灰狼、人和猩猩的氨基酸序列同源性分别为100%、100%、100%、100%、96.3%、100%、96.8%、100%、100%、96.3%和96.3%;系统进化树表明,牦牛HSP27基因与家牛、印度水牛、绵羊和藏羚羊的进化水平较为相近,与灰狼、猩猩和人类的较远。RT-qPCR结果表明,牦牛HSP27基因在卵泡期、黄体期、妊娠期不同时期的卵巢、输卵管和子宫组织中均有表达,其中在卵泡期卵巢中的表达量最高,在黄体期子宫中的表达量最低;在不同繁殖周期,牦牛HSP27基因在卵巢中的表达均极显著大于在子宫中的表达,其在卵巢、输卵管和子宫的表达因妊娠而发生了显著变化。【结论】通过与其他物种HSP27基因的同源性对比分析,发现HSP27基因在进化中具有高度保守性,同时也存在种属特异性;通过对HSP27在繁殖周期母牦牛主要生殖器官中的表达情况分析,推测出HSP27可能参与了母牦牛妊娠的调控,为进一步探讨HSP27在牦牛生殖过程中发挥的作用提供了参考资料。     

兰州大尾羊PPARG全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆兰州大尾羊过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARG）基因,分析其序列及编码蛋白的生物学特性,阐明PPARG基因在绵羊中的生物学作用,为生产应用提供理论依据。【方法】根据绵羊PPARG基因CDS序列设计特异性引物,利用RACE和RT-PCR技术克隆获得兰州大尾羊PPARG基因序列,结合生物信息学方法分析其生物学特性。【结果】克隆获得兰州大尾羊PPARG cDNA 序列全长1 774 bp（GenBank序列号：KF727439）,其CDS区片段长1 428 bp,编码475个氨基酸,编码区两侧翼分别具有5’-UTR 131 bp（1-131 nt）和3’-UTR 214 bp（1 560-1 774 nt）。预测兰州大尾羊PPARG蛋白分子量为54.40 kD,理论等电点为4.94。预测PPARG编码蛋白疏水性最大值为3.600,最小值为-2.744,为非跨膜的疏水性蛋白。亚细胞定位主要在细胞质（65.2%）和细胞核（21.7%）中,少量作用于细胞支架（4.3%）和过氧化物酶体（4.3%）,无信号肽,不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有26个磷酸化位点,无糖基化位点,含有1个ZnF_C4结构域、1个HOLI结构域和1个LCR结构域,二级结构以随机卷曲为主。同源性分析显示兰州大尾羊PPARG核苷酸序列与山羊、野牛、水牛、绵羊、虎鲸、野猪和人类核苷酸序列间的同源性分别为99% 、98% 、97% 、99%、 94%、92%和90%,兰州大尾羊PPARG氨基酸序列与山羊、野牛、水牛、绵羊、虎鲸、野猪和人类核苷酸序列间的同源性分别为100% 、99.8% 、100% 、100%、 98.7%、98.5%和97.5%。系统发育树表明,兰州大尾羊与山羊、绵羊和水牛的进化水平更为接近,与鱼类、人类和鼠类较远。其基因第486位发生碱基转换（C←→T）,第828位发生碱基转换（C←→A）,但其所编码氨基酸不变。【结论】兰州大尾羊与其他物种PPARG在结构上相似性较高,说明该基因具有高度的保守性。推测PPARG蛋白大部分在游离核糖体上合成,其功能与过氧化物酶体有关,该预测结果符合其过氧化物酶体增殖物激活受体的身份。PPARG氨基酸序列有26个可以成为蛋白质激酶磷酸化的位点,某些位点被磷酸化后,可导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化, 如胰岛素增敏激素,脂联素( adiponectin)的表达减少。其序列包含的ZnF_C4锌指结构域具有与脂质结合的功能,HOLI即LBD配体结构域在激素信号转导过程中发挥重要作用,其中PPARG锌指结构域中的磷酸化位点Ser112,被MAPK磷酸化后,可以抑制PPARG同配体的结合,从而降低PPARG蛋白的活性,两个结构域均与成脂分化过程相关联。文章为进一步研究PPARG在成脂分化过程中的作用提供了参考。     

绵羊LDHβ基因的生物信息学分析及其在不同剩余采食量绵羊肝脏和肌肉组织中的表达

【目的】为鉴定绵羊乳酸脱氢酶β(lactate dehydrogenase B,LDHβ)基因的分子特征,研究其在不同剩余采食量绵羊肝脏和肌肉组织中的表达差异.【方法】测定了137只‘湖羊’公羔的剩余采食量(residual feed intake,RFI),按RFI进行排序,分别筛选出RFI最高(high-residual feed intake,H-RFI)和RFI最低(low-residual feed intake,L-RFI)的羊各15只,屠宰后,采集肝脏和肌肉组织,利用Q-PCR技术检测绵羊LDHβ基因分别在H-RFI和L-RFI羊肝脏和肌肉中表达量,并利用生物信息学软件构建了该基因的系统进化树和预测其结构与功能.【结果】绵羊LDHβ基因开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 005bp,编码334个氨基酸,其蛋白质分子质量为36 479.43U,理论等电点为6.40.绵羊LDHβ基因与山羊的亲缘关系较近,其次为牛,序列同源性高.功能结构域预测结果显示,该基因编码产物在内质网中参与辅酶因子生物合成的可能性最高.Q-PCR结果显示,绵羊LDHβ-mRNA基因在L-RFI羊肝脏和肌肉中表达量均显著低于H-RFI羊(P0.01).【结论】绵羊LDHβ基因作为能量代谢的关键酶参与绵羊饲料效率的调控.     

藏绵羊生长激素(GH)基因的克隆及序列分析

【目的】对藏绵羊生长激素(GH)基因进行了克隆和序列分析,以期为进一步开展藏绵羊GH基因与其生长发育性状的相关分析以及基因定位、表达调控等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对藏绵羊GH基因进行PCR扩增、克隆和测序,使用DNAMAN4.0、BioEdit 7.0.0、DnaSP 4.10.1等生物信息学软件进行序列分析和比较基因组学研究。【结果】藏绵羊GH基因(GenBank登录号EF077162)由5个外显子和4个内含子组成,完整编码序列(Complete coding sequence,CDS)全长为654 bp。5个外显子大小分别为13,161,117,162和201 bp;4个内含子大小分别为246,227,229和275 bp;内含子与外显子的连接区序列遵循基因组成规则。信号肽由26个氨基酸组成,成熟肽由191个氨基酸组成。藏绵羊与已报道的其他绵羊GH基因编码区核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性均为99.0%~100%;而与山羊、普通牛、瘤牛、大额牛、牦牛、水牛各物种在GH基因编码区核苷酸序列上同源性分别为98.4%,98.0%,97.7%,97.5%,97.5%,98.1%;相应的氨基酸序列间同源性分别为100%,99.0%,99.0%,98.1%,98.6%,98.1%。【结论】成功地克隆了藏绵羊GH基因;牛科物种内,藏绵羊与已报道的其他绵羊以及与山羊、普通牛、瘤牛、大额牛、牦牛、水牛等物种在GH基因编码区核苷酸序列和推导的氨基酸序列上均具有较高的保守性。     

绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列,并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列;利用生物信息学技术,对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性,蛋白质序列的跨膜区,亚细胞定位,亲水性,潜在信号肽剪切位点,糖基化位点,磷酸化位点,编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构,三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp,包括1 212 bp的编码区序列,编码403个氨基酸。同源性分析发现,绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高,分别达到78.77%和92.51%,而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白,相对分子量为44079.0Da,理论等电点为4.91,无信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在细胞核,不属于分泌蛋白;预测含有33个磷酸化位点,7个糖基化位点,具有两个WW结构域,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示,YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。     

发情相关基因在小尾寒羊性腺轴组织中的表达分析

[目的]探究绵羊繁殖性状相关候选基因ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1在小尾寒羊性腺轴组织(大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管)的表达差异,为阐明绵羊发情期调控分子机理提供理论依据.[方法]以FecB BB型小尾寒羊为研究对象,利用实时荧光定量PCR检测上述6个基因在小尾寒羊黄体期和卵泡期与性腺轴相关的7种组织中的表达差异.[结果]ATF4在小尾寒羊黄体期卵巢组织中的表达量最高且极显著高于卵泡期(P<0.01);CCNG1在小尾寒羊黄体期卵巢组织中的表达量最高,在卵泡期大脑组织中的表达量极显著高于黄体期(P<0.01);KDM3B在小尾寒羊黄体期小脑中的表达量最高,且黄体期小脑和下丘脑中的表达量均显著高于卵泡期(P<0.05);NPTX1在小尾寒羊黄体期小脑中的表达量最高且显著高于卵泡期(P<0.05);PLCB3在小尾寒羊黄体期卵巢中的表达量显著高于卵泡期(P<0.05);RASD1在小尾寒羊卵泡期垂体组织中的表达量最高,在黄体期大脑、小脑、子宫中的表达量显著高于卵泡期(P<0.05).[结论]ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1基因可能对绵羊的发情期转换起到一定的调控作用,为进一步阐明绵羊发情期转换过程的分子机理提供了新思路,为进一步研究上述6种基因的功能奠定了理论基础.     

奶山羊POU1F1基因CDs区的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆奶山羊垂体特异性转录因子POU1F1基因CDs区,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】采集关中奶山羊垂体组织,提取其总RNA,根据绵羊POU1F1基因序列,利用反转录RT-PCR克隆POU1F1基因CDs区,对其进行生物信息学分析,并构建原核表达载体pET-32a-POU1F1,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。【结果】关中奶山羊POU1F1基因(GenBank登陆号:FJ547813)开放读码框由876个碱基组成,编码291个氨基酸,基中包含1个POU-specific结构域(从第124～198个氨基酸)和1个Homeobox结构域(从第214～276个氨基酸);奶山羊POU1F1基因CDs区核苷酸序列与绵羊(NM_001009350)、牛(NM_174579)、人(NM_000306)和小鼠(NM_008849)的同源性分别为98%,97%,91%和86%,其氨基酸序列与绵羊、牛、人和小鼠的同源性分别为98%,98%,96%和92%;成功构建了重组质粒pET-32a-POU1F1的原核表达系统,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白His-POU1F1。【结论】POU1F1基因编码的功能氨基酸在奶山羊、绵羊、牛、人和小鼠上高度保守,推测奶山羊POU1F1基因与其他物种的POU1F1基因具有相似的功能。     

发情相关基因在小尾寒羊性腺轴组织中的表达谱研究

[目的]探究绵羊发情相关基因KITLG、MAPK1、NOTCH4和NR5A2在小尾寒羊性腺轴组织(大脑、小脑、下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管)中的表达差异,为阐明绵羊高繁殖力的分子机理提供理论依据。[方法]以FecB BB型小尾寒羊为研究对象,利用实时荧光定量PCR检测上述4个基因在小尾寒羊发情周期(黄体期和卵泡期)性腺轴相关的7种组织中的表达差异。[结果]KITLG基因在小尾寒羊卵泡期输卵管组织中的表达量最高,其在黄体期小脑与垂体中的表达量显著高于卵泡期(P<0.05);MAPK1基因在小尾寒羊卵泡期大脑组织中的表达量最高且极显著高于黄体期(P<0.01),其在黄体期下丘脑和小脑组织中的表达量显著高于卵泡期(P<0.05),而其在卵泡期输卵管组织中的表达量显著高于黄体期(P<0.05);NOTCH4基因在小尾寒羊黄体期下丘脑中的表达量最高,而其在黄体期子宫中的表达量显著高于卵泡期(P<0.05);NR5A2基因在小尾寒羊黄体期卵巢组织中的表达量最高,其在黄体期子宫组织中的表达量显著高于卵泡期(P<0.05)。[结论]KITLG、MAPK1、NOT...     

HAS2和PTGS2在牦牛不同时期卵巢中的表达与定位

【目的】探究透明质酸合成酶2(hyaluronate synthase 2,HAS2)和前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)在牦牛不同时期卵巢中的定位与表达情况,为进一步提高耗牛生育能力提供理论依据。【方法】采集临床健康牦牛不同时期(卵泡期、黄体期、妊娠期)的卵巢作为试验样品,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blotting方法检测牦牛不同时期卵巢中HAS2、PTGS2基因水平和蛋白水平的表达量,采用免疫组化(IHC)法检测HAS2和PTGS2在牦牛不同时期卵巢中的分布情况。【结果】HAS2基因在耗牛黄体期卵巢的表达量显著高于卵泡期和妊娠期(P0.05),在卵泡期卵巢的表达量显著高于妊娠期(P0.05);PTGS2基因在黄体期卵巢的表达量显著高于其他2个时期(P0.05),在卵泡期卵巢的表达量显著高于妊娠期(P0.05)。HAS2蛋白在耗牛3个时期卵巢中均有表达,其中在黄体期卵巢的表达量显著高于其他2个时期(P0.05),且妊娠期卵巢的表达量显著高于卵泡期(P0.05);PTGS2蛋白在黄体期卵巢的表达量显著高于其他2个时期(P0.05),且卵泡期卵巢的表达量显著高于妊娠期(P0.05)。IHC试验表明,HAS2和PTGS2蛋白在耗牛卵巢黄体细胞中表达量最高,在卵泡颗粒层和卵丘细胞中也有表达。【结论】HAS2和PTGS2在牦牛不同时期卵巢中的表达具有显著差异性,推测HAS2和PTGS2可能参与牦牛生殖生理过程的调控。     

牦牛CCND2基因的克隆及其在不同发情时期卵巢中的表达

【目的】研究牦牛细胞周期蛋白D2(Cyclin D2,CCND2)基因序列特征及其在牦牛不同发情时期卵巢中的表达。【方法】以牦牛为研究对象,提取卵巢的总RNA进行反转录为第一链c DNA,根据Gen Bank中黄牛CCND2的m RNA序列(Gen Bank登录号:NM_001076372.1),使用Primer 5.0软件设计引物。应用PCR方法对CCND2基因扩增克隆,并测序获得CCND2基因完整的CDS区序列及部分5′端和3′端UTR区。使用Protparam、SOPMA、SWISS-MODEL及SMART分别对牦牛CCND2蛋白的理化性质、二级结构、三级结构及结构域进行预测分析,并进行同源性分析和系统进化树构建,利用半定量PCR方法对CCND2基因在牦牛各组织中的表达进行检测;同时采用实时荧光定量PCR技术分析CCND2基因在牦牛不同发情时期(卵泡期、红体期、黄体期)卵巢中的相对表达量。【结果】克隆获得牦牛CCND2基因序列为909 bp,其中包含可编码289个氨基酸残基的长为870 bp的CDS区。与黄牛相比,牦牛CCND2的CDS区存在5个碱基突变,导致其中一个氨基酸改变。牦牛CCND2基因CDs序列与野牦牛、黄牛、印度水牛、绵羊、野猪、马、家犬、猫、人类的进行比对同源性分别是99.54%、99.31%、99.31%、98.16%、94.81%、90.46%、90.80%、91.49%、88.62%,物种之间同源性较高,与进化树分析显示的亲缘关系远近一致,表明CCND2基因编码区在进化中较为保守。对CCND2蛋白预测分析知牦牛CCND2基因编码蛋白的分子式为C1445H2315N377O440S18,相对分子质量约为32.59k D,理论等电点为4.75,总平均亲水性为-0.107,不稳定指数为44.56,属亲水不稳定的酸性蛋白,该蛋白无跨膜区和信号肽;二级结构主要包含α-螺旋和无规卷曲,且与三级结构分析结果一致。蛋白含位于第26—152位氨基酸处的Cyclin_N和位于第154—257位氨基酸处的Cyclin_C两个结构域。CCND2基因在牦牛各组织中均有表达,其中在胃、卵巢和脑中表达相对较高;q RT-PCR结果显示在牦牛不同发情时期卵巢中CCND2 m RNA均有表达,且卵泡期卵巢中的表达水平最高(P0.01),在红体期和黄体期卵巢中表达水平无差异(P0.05)。【结论】成功获得了牦牛CCND2基因的CDS区全长序列和组织表达谱,对其进行生物信息分析及蛋白功能结构分析为该基因在牦牛繁殖调控中的进一步研究提供理论依据;在牦牛不同发情时期卵巢中CCND2m RNA表达水平存在差异,可能与卵泡发育过程中颗粒细胞增殖分化、卵泡发生波及卵巢内分泌有关,为进一步研究牦牛卵巢发育机制及改善牦牛繁殖效率提供了基础资料。     

黄体期和卵泡期小尾寒羊KiSS-1与RFRP-3组织表达研究

为分析KiSS-1和RFRP-3基因在小尾寒羊不同繁殖时期(黄体期和卵泡期)下丘脑、垂体、性腺轴各组织中的表达差异,阐明这2个基因在绵羊发情转换中的表达模式,以常年发情的小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,对比分析了KiSS-1和RFRP-3基因在黄体期和卵泡期的小尾寒羊下丘脑—垂体—性腺轴各组织中的表达差异。结果表明:1)KiSS-1和RFRP-3基因在下丘脑、垂体、卵巢等10种组织中均有表达;2)黄体期和卵泡期下丘脑中KiSS-1基因表达量均显著高于其他组织(P0.05),卵泡期下丘脑和松果体中KiSS-1基因表达量均显著高于黄体期(P0.05);3)黄体期和卵泡期下丘脑和卵巢中RFRP-3基因的表达量均显著高于其他组织(P0.05),且卵巢中RFRP-3基因在黄体期的表达量显著高于卵泡期(P0.05)。综上,研究发现KiSS-1和RFRP-3基因在绵羊发情调控中均发挥重要作用,KiSS-1促进发情而RFRP-3抑制发情。     

绵羊KRTAP20-1基因变异及其在不同组织的表达特征

【目的】研究角蛋白关联蛋白(keratin-associated proteins,KAPs)编码基因的遗传变异对绒毛性状的影响,以丰富绵羊功能基因组学并开发基因标记。【方法】采用PCR-SSCP和DNA测序技术,检测KAP20-1编码基因(KRTAP20-1)在甘肃高山细毛羊(细毛羊)、青海半细毛羊(半细毛羊)和藏绵羊(粗毛羊)3个群体中的变异情况;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测KRTAP20-1基因在甘肃高山细毛羊、小尾寒羊(粗毛羊)成年母羊和羔羊不同组织中的表达情况。【结果】3个绵羊群体KRTAP20-1基因共检测到4个SNPs,其中3个为非同义突变导致氨基酸的改变(P.Gly10Ser、P.Tyr29Phe和P.Ser61Gly),1个为同义突变。等位基因A在3个绵羊群体中均为优势等位基因,其余3个等位基因在不同绵羊群体中分布差异较大。甘肃高山细毛羊KRTAP20-1基因的遗传杂合度、有效等位基因数和多态信息含量均高于其他2个群体。KRTAP20-1基因只在绵羊皮肤中表达,在其他组织中均无表达;在小尾寒羊和甘肃高山细毛羊2个群体中,羔羊皮肤组织中KRTAP20-1表达量均高于母羊,且在小尾寒羊皮肤组织中的表达量高于同期甘肃高山细毛羊,即表现出明显的群体差异性和时空差异性。【结论】绵羊KRTAP20-1基因在不同用途毛用绵羊中的等位基因分布差异及组织表达的种群特异性和时空特异性提示,该基因对羊毛相关性状的形成和表型均有影响。     

玉米大斑病菌转录因子StSte12的活性及其对酵母生长的功能互补分析

【目的】分析玉米大斑病菌StSte12的结构、转录活性及功能。【方法】利用生物信息学方法,对获得的StSte12进行保守结构域和进化树分析,推测该基因的功能;利用β-半乳糖苷酶法检测StSte12的转录活性;将StSTE12转化至酿酒酵母ScSTE12基因缺失突变体ste12Δ中,筛选酿酒酵母ScSTE12的功能互补突变体并对其分析,验证玉米大斑病菌StSTE12的功能。【结果】通过蛋白比对发现StSte12具有转录因子特有的STE homeodomain和ZnF_C2H2锌指结构;同源性分析显示,该基因与其它植物病原真菌的STE12-like基因有较高的同源性;利用β-半乳糖苷酶法检测发现,StSte12具有转录激活活性;酵母互补试验表明,StSTE12可以回复酿酒酵母ste12Δ的功能,能够调控酵母细胞的生长。【结论】玉米大斑病菌StSTE12属于STE12-like基因;转录因子StSte12具有转录活性;对酵母细胞在YPD培养基上的侵入生长有重要的调控作用。     

牦牛Cygb基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛Cygb基因进行克隆与序列分析,为进一步深入研究Cygb基因在牦牛对低氧环境适应性中的作用提供理论基础。【方法】参照GenBank中牛的Cygb基因序列设计引物,提取牦牛肝组织RNA,以反转录合成的cDNA为模版,克隆牦牛Cygb基因并进行测序,运用生物信息学软件对所得序列进行分析。【结果】牦牛Cygb基因编码区全长573bp,编码190个氨基酸,编码产物分子质量21.5ku,理论等电点为6.61。蛋白预测表明,Cygb编码蛋白整体表现为亲水性,蛋白质的二级结构主要由α螺旋及延伸链构成。同源性分析表明,11条序列当中牦牛与牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,其中牦牛与牛的同源性最高,达到99.0%。【结论】克隆到573bp的牦牛Cygb基因编码区全长序列,该序列在哺乳动物中具有很高的保守性。     

绵羊痘病毒甘肃古浪株RING finger基因的克隆表达及序列分析

【目的】对绵羊痘病毒甘肃古浪株RING finger蛋白的基因进行克隆,表达以及序列分析,初步探究绵羊痘病毒RING finger蛋白是否具有E3泛素连接酶活性,为阐明其在绵羊痘病毒感染过程中对泛素蛋白酶体系统的调控作用奠定基础.【方法】以绵羊痘病毒甘肃古浪株DNA为模板,通过PCR扩增RING finger基因.利用Pfam数据库、DNAstar等软件进行序列及遗传进化分析;将RING finger基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-SPPVRFP重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并进行SDS-PAGA和Western-blot分析.【结果】绵羊痘病毒RING finger基因由723个核苷酸组成,编码的240个氨基酸的分子量约为28.5 ku,具有RING finger结构域.不同羊痘病毒株间RING finger基因核苷酸序列同源性高达99.2%,氨基酸序列同源性高达98.3%.不同的RING finger蛋白都含有8个保守的半胱氨酸和组氨酸.SDS-PAGA分析显示,重组SPPVRFP大小约为55 ku,Western-blot分析显示,重组SPPVRFP不能与绵羊痘病毒阳性血清反应.【结论】成功克隆、表达并纯化了绵羊痘病毒RING finger基因,对SPPV GS-GL株RING-finger蛋白进行序列分析,推测其可能具有E3泛素连接酶活性.     

盐芥STZ转录因子基因的克隆及序列分析

【目的】克隆盐芥STZ转录因子基因,对其进行序列分析,为进一步研究ThSTZ转录因子在逆境应答中的作用奠定基础。【方法】利用GenBank数据库中盐芥STZ转录因子的EST序列设计特异引物,通过3′RACE技术克隆ThSTZ基因的全长序列,应用生物信息学手段对该基因编码蛋白的结构与功能、亚细胞定位等进行预测,并对其编码氨基酸序列的同源性和系统进化进行分析。【结果】盐芥STZ转录因子基因全长717 bp,编码238个氨基酸。其编码蛋白含有2个C2H2型锌指结构域,位于细胞核内,属于C2H2家族转录因子;多重序列比对和系统进化分析表明,盐芥STZ转录因子与拟南芥属植物同源蛋白的相似性最高。【结论】获得了ThSTZ转录因子基因的全长序列,为进一步探讨ThSTZ转录因子在逆境应答中的功能奠定了基础。     

猪FAM213B基因mRNA和启动子的克隆及序列分析

【目的】获得猪FAM213B基因完整mRNA和启动子序列,研究猪FAM213B基因表达,为探讨母猪妊娠的建立和胚胎发育调控机制奠定基础。【方法】通过5'RACE和3'RACE技术,获得基因完整mRNA序列,分析不同物种该基因氨基酸序列相似性;通过PCR克隆启动子区,并通过双荧光素酶报告基因载体系统转染猪子宫内膜细胞,研究其转录活性。【结果】猪FAM213B基因mRNA全长808 bp,其中5'UTR、CDS区和3'UTR长度分别为67、609(含终止密码子)和132 bp(不含poly A序列),在17~106位氨基酸之间存在硫氧还蛋白折叠结构域;与猪FAM213B基因其他2个潜在转录本相比,三者都包含硫氧还蛋白折叠结构域,但蛋白三级结构存在较大差异;猪FAM213B氨基酸序列与山羊、牛和绵羊高度相似,相似性分别为94.03%、93.03%和91.54%。克隆获得2 261 bp(-2 231/+30)的基因启动子序列,将其连接至双荧光素酶报告基因载体,转染猪子宫内膜细胞,发现获得的启动子片段能够启动下游报告基因的转录,在启动子区存在潜在的典型NFκB等转录因子结合位点。【结论】本研究获得猪FAM213B基因转录本长度为808 bp,其蛋白存在硫氧还蛋白折叠功能结构域,其启动子序列(-2 231/+30)在猪子宫内膜细胞中具有较强的转录活性。     

绿尾虹雉(Lophophorus lhuysii)Toll样受体5基因的克隆和适应性进化分析

【目的】获得绿尾虹雉(Lophophorus lhuysii)Toll样受体5基因(TLR5)编码区序列,并对其编码区蛋白的特征及适应性进化进行分析。【方法】以绿尾虹雉基因组DNA为模板,采用PCR扩增克隆获得TLR5基因编码区序列。使用MEGA、PAML等软件对其序列特征及选择压力进行分析。【结果】绿尾虹雉TLR5基因编码区序列全长2 583 bp,共编码860个氨基酸,以亮氨酸含量最高(133/860),色氨酸含量最低(11/860)。编码蛋白为典型的Ⅰ型跨膜结构,包括富含LRRs结构域的胞外区、跨膜区和胞内TIR结构域。绿尾虹雉TLR5基因极其保守,与雉鸡(P. colchicus)的同源性最高(97.75%),与小白鹭(E. garzetta)同源性最低(85.17%)。采用位点-特异模型在胞外区共检测到3个正选择氨基酸位点(263F, 280K和645I)。【结论】绿尾虹雉TLR5基因编码区受到较强的纯净化压力,胞外区LRRs结构域可能为识别病原微生物的区域。