辽宁省辣椒疫霉菌生理小种鉴定

辣椒疫病是辽宁省辣椒生产上的重要病害,开展辽宁省辣椒疫病病菌生理小种鉴定,可为抗疫病辣椒新品种的选育提供理论依据。对来源于辽宁省不同辣椒产区的30个病样进行了分离鉴定,经致病性测定和形态特征观察,确定所分离的病菌均为辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian);利用中国辣椒疫霉菌生理小种鉴别通用寄主,对其进行了生理分化鉴定。根据供试菌株在鉴别寄主上的抗感反应,鉴定结果表明:辽宁地区辣椒疫霉菌划分为1号、2号和3号生理小种,发生频率分别为3.33%、26.67%和70%;其中3号生理小种为辽宁省辣椒疫霉菌的优势小种。从不同地区测定结果表明不同生理小种的分布与地域间的相关性不强。     

辣椒抗疫病基因初步定位

辣椒疫病是威胁辣椒生产主要病害,改良品种抗性是解决这一问题最有效途径.选用对辣椒疫霉菌3号生理小种免疫的高代自交系ZCM334为父本抗源,构建F1、BC1F1、F2群体分析辣椒抗疫病遗传规律性.结果表明,在感病对照全部发病时,ZCM334对辣椒疫霉菌3号生理小种抗性由一对显性主效基因控制;利用SLAF-BSA技术对BC1F1抗、感极端分离群体混池测序,将辣椒抗疫病基因定位在辣椒第5号染色体5.1 Mb范围内,候选区域内共有26个候选基因,为下一步目标基因精细定位奠定基础.     

致病性和非致病性辣椒疫霉菌群体的遗传多样性

从辣椒疫病病土和病株上分离鉴定辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）,得到11个致病性和11个非致病性菌株。利用RAPD分子标记对其遗传多样性进行分析,结果表明受试致病性和非致病性辣椒疫霉菌株分别聚为1个组,但其中3个非致病性菌株与致病性菌株聚为1个组。ITS序列分析发现,受试致病性和非致病性辣椒疫霉菌株分别聚为1个组,但是非致病性辣椒疫霉菌的遗传多样性比致病性的高,这说明致病性菌株可能是单系群起源。此外,在辣椒疫霉菌的遗传表型和地理来源方面,致病性和非致病性辣椒疫霉菌之间不存在任何关系,这表明辣椒疫霉菌的起源并不单独依赖其地理来源。     

寄主诱导的基因沉默对辣椒疫霉菌的影响

由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是生产中最严重的病害之一。本研究利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术,通过瞬时表达疫霉菌基因沉默信号,在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)-疫霉菌互作系统中建立寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)体系,为防治辣椒疫病提供新思路。首先,在TRV2-GFP和对照TRV2-GUS的本氏烟叶片上接种表达GFP的致病疫霉菌菌株14-3-GFP,结果显示TRV2-GFP植株中致病疫霉菌的GFP表达显著降低,表明利用VIGS技术构建的HIGS体系在本氏烟草—疫霉菌体系中可行。此外,选取辣椒疫霉菌致病相关基因 PcAvh1、 Pchmp1和 PcGK4,构建到TRV2载体上,通过在本氏烟草中表达结合接种辣椒疫霉菌,结果显示,与对照相比植物生长表型无明显变化,表达TRV2- PcGK4的植株对辣椒疫霉菌表现抗病,表达TRV2- PcAvh1和TRV2- Pchmp1的植株对辣椒疫霉菌的抗感性没有显著影响,表明 PcGK4可能是辣椒疫霉菌致病必须的基因之一。以上结果表明,利用HIGS技术沉默辣椒疫霉菌 PcGK4基因可有效降低辣椒疫霉菌对寄主的侵染,HIGS技术可用于辣椒疫霉菌致病关键基因的筛选和鉴定。     

陕西辣椒疫病病原鉴定及其防治剂的室内筛选

通过对陕西辣椒疫病病原菌的分离培养和形态学观察,将引起陕西辣椒疫病的病原菌鉴定为辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonia);利用一套鉴别寄主,通过常规抗病性鉴定技术,对陕西辣椒疫霉菌进行生理小种鉴定,并采用菌丝生长抑制法和孢子囊萌发抑制法测定了12种常用的防治剂对辣椒疫霉菌的毒力.结果表明:陕西辣椒疫霉菌分离物属于生理小种3;不同供试药剂对菌丝生长和孢子囊萌发的抑制中浓度差异达到极显著水平;对辣椒疫霉菌菌丝生长抑制效果较好的是辣椒病菌清和活康壮,EC50分别为252.76 μg/mL(r=0.8669)和376.18 μg/mL(r=0.9304);对孢子囊萌发抑制效果较好的是69%烯酰吗啉WP和80%代森锰锌WP,EC50分别为317.61 μg/mL(r=0.9767)和421.70 μg/mL(r=0.9573);60%椒霸菌毒克星WP和50%扑海因WP对辣椒疫霉菌菌丝生长和孢子囊萌发几乎没有抑制作用.     

辣椒几丁质酶基因受疫霉菌及灰霉菌侵染时的表达变化

通过对已知全部辣椒表达序列标签(EST)数据分析发现,辣椒中至少含7个编码几丁质酶基因(分别为CaCHT-1、CaCHT-2、CaCHT-3、CaCHT-4、CaCHT-5、CaCHT-6和CaCHT-1.1)。采用半定量RT-PCR技术,分析辣椒幼苗在分别接种疫霉菌和灰霉菌后CaCHTs表达强度的变化。结果表明:在受到辣椒疫霉菌侵染时,除CaCHT-6外,CaCHT-1、CaCHT-2、CaCHT-3、CaCHT-4、CaCHT-5和CaCHT-1.1的表达水平均明显上升;而受到辣椒灰霉菌侵染时,CaCHT-1、CaCHT-4、CaCHT-5和CaCHT-1.1的表达水平均有不同程度的上升,CaCHT-3未检测到有表达,CaCHT-2和CaCHT-6的表达水平无可见的变化。结果提示,辣椒几丁质酶基因大部分成员均可受辣椒疫霉菌和灰霉菌的侵染诱导表达。     

不同来源辣椒疫霉菌的系统发育分析

运用PCR直接测序法,对9个辣椒疫霉菌株和1个外类群大豆疫霉菌株的nrDNA的ITS区(包括ITS1、5.8SrDNA和ITS2)进行序列测定。结果表明,不同来源的辣椒疫霉菌的ITS序列总长度为750~753bp。采用PAUP软件进行系统发育分析表明:来自辣椒寄主和土壤的辣椒疫霉菌各自聚为一组,与其地理来源没有明显的相关性。     

韩国、日本辣椒资源疫霉菌抗性鉴定试验研究

对引进的辣椒品种在5~6叶期,接种孢子囊浓度为15000个/ml,体积为5ml,进行疫霉菌抗性鉴定试验。结果表明:韩国引进15份辣椒资源中,有高抗病资源7份,抗病资源3份。日本引进13份辣椒资源中,有高抗病资源7份,抗病资源3份。     

辣椒疫霉可溶性蛋白和酯酶同工酶电泳分析

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)和PAGE电泳技术分别对安徽不同地区的46个辣椒疫霉进行可溶性蛋白和酯酶同工酶分析,从蛋白质和酶学水平上分析辣椒疫霉的生理生化特征。可溶性蛋白电泳表明,每个辣椒疫霉分离出了25~37条谱带,平均31.5条。其中具有多态性的条带共有24条,多态性比率达64.9%,可溶性蛋白图谱与地理来源相关,但与致病力不相关。酯酶同工酶PAGE电泳显示辣椒疫霉菌株各有1~8条条带,Rf值为0.05~1.00,不同辣椒疫霉菌株间某些同工酶谱带数和同一迁移率谱带的颜色和宽度差异显著,其中弱致病力菌株的条带数为1~3条,说明菌株的致病力差异可在酯酶同工酶水平上得到反映。     

辣椒疫病抗性相关的共显性RGA STS标记的开发及应用

采用辣椒抗病基因同源序列(Resistance gene ahalogues)(RGA2)设计1对特异引物,对高抗辣椒疫病品种CM334和极感疫病品种Early Calwonder(EC)进行多态性扩增,开发出共显性的RGA-STS1200标记.利用STS1200标记在具有不同疫霉菌生理小种抗性的辣椒材料CM334、PBC459、PBC137-1和对辣椒疫霉菌3个生理小种都不具抗性的辣椒材料EC、茄门和B2间进行多态性扩增.结果表明,由3个辣椒疫病抗性材料所扩增出的条带大小一致,而由3个感辣椒疫病品种所扩增出的条带大小一致.说明STS1200标记可用于鉴定辣椒疫病抗、感材料.同时,利用共显性的RGA-STS1200标记在苗期及时剔除CM334和EC正反杂交所得F1代假杂种,进一步构建用于辣椒疫病抗性研究用的F2代分离群体.这是少数报道利用RGA-STS标记对辣椒疫病抗性进行鉴定,也是第一次利用RGA-STS标记对作物种子真伪进行鉴定.     

辣椒疫霉交配型及其与对辣椒致病力的关系初步研究

采用单孢菌落直接配对法对来自安徽合肥、淮南、和县、潜山、岳西等县市的发病辣椒上分离鉴定获得22个辣椒疫霉菌株进行交配型测定,并采用离体叶片接种法测定了辣椒疫霉不同菌株的致病力。结果表明,安徽省辣椒疫霉菌存在A1和A2两种交配型,以A2占优势,均有分布,发生频率达81.8%。不同来源菌株对2个辣椒品种的致病力存在显著差异,各菌株对艳阳离体叶的平均病级范围为1.0～4.8,对合丰天瑞离体叶的平均病级范围为1.5～4.5。不同地区的菌株致病力有强弱之分,同一地区中不同菌株的致病力也存在一定的差异性。辣椒疫霉菌的致病力与品种之间存在互作关系,菌株的交配型与致病力无明显的相关性。     

不同地区辣椒疫霉致病力分化及其DNA多态性分析

从山东、湖北、广东、浙江、云南、重庆和湖南7个不同省份采集辣椒疫病病株和病土,经分离纯化获得31株辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）菌株,利用浸根法进行致病力测定,并从100个RAPD随机引物中选出多态扩增性强的14个引物用于对其全基因组DNA的RAPD分析。结果表明,31个菌株具有明显的致病力差异,并有非致病、弱致病、强致病的分化。利用RAPD分子标记方法对受试31个菌株的基因组进行扩增,并用UPGMA软件对受试菌株间的遗传距离进行聚类分析构建系统树状图。结果显示,不同致病力分化的辣椒疫霉具有丰富的遗传多样性,遗传聚类组的划分与菌株的致病力没有显著的相关性。由此说明,来自不同地区的辣椒疫霉的DNA存在较高的遗传多样性,但与其致病力无直接的相关性。     

甘肃白兰瓜、西瓜疫霉种的鉴定研究

从甘肃白兰瓜、西瓜上分离出15株疫霉,鉴定出两个种:掘氏疫霉Phytophthoradrechsleri Tuckcr,辣椒疫霉P.capsici Lconian。分离物经过配对培养,均可产生性器官,10株掘氏疫霉为A_1交配型,5株辣椒疫霉为A_2交配型。     

对甲霜灵不同敏感程度的辣椒疫霉的遗传多样性分析

为研究不同地区及对甲霜灵不同敏感程度的辣椒疫霉菌株间的遗传差异,采用RAPD分子标记对分离自安徽省和县等(15株)、江苏省南京市(1株)、四川省邛崃市(1株)的17个菌株及经甲霜灵处理筛选得到的3个抗性突变菌株进行了RAPD指纹分析。结果显示10对引物共扩增出30个比较清晰的条带,且均为多态性条带;当以遗传相似系数0.7为阀值时,可以将供试的20个菌株分为4个遗传聚类组,说明辣椒疫霉具有一定的遗传多样性。同时,RAPD分析结果还表明,经甲霜灵处理所筛选得到的抗性突变株与野生型敏感亲本之间存在一定的遗传变异,但是辣椒疫霉菌株对甲霜灵的敏感程度与RAPD的聚类分组没有相关性。     

辣椒疫霉病菌对内吸性杀菌剂抗药性的研究

从江西省采集分离的辣椒疫病菌（ＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉＬｅｏｎｉａｎ）１５３个菌株对甲霜灵抗药性测定结果表明：野生已有５５．６０％的菌株存在抗药性,其中中、高抗菌株占２７．５０％;甲霜灵与恶唑烷酮、甲呋酰胺之间存在交互抗性,与霜霉威之间没有交互抗性;甲霜灵对敏感菌株菌丝生长、游动孢子囊的形成和游动孢子的释放均有明显的抑制作用,其ＥＣ５０分别为０．２７７６ｍｇ／ｋｇ、０．２６６３ｍｇ／ｋｇ、２．２９５ｍｇ／ｋｇ,而霜霉威浓度达５００ｍｇ／ｋｇ时,对菌株菌丝生长、游动孢子囊的形成和游动孢子的释放均没有明显的抑制作用,但在活体寄主上对病菌有较好的防效。     

广东柑橘疫霉研究

从广东省柑橘栽培老区的苗圃和果园采集的罹病柑橘组织样本中分离获得36个疫霉菌株，鉴定出6个种，其中柑橘褐腐疫霉Phytophthora citrophthora 11株，烟草疫霉P．nicotianae 9株，棕榈疫霉P．palmivora 7株，辣椒疫霉P．capsici和掘氏疫霉P．drechsleri各4株，柑橘生疫霉P．citricola 1株．     

陕西辣椒疫病菌种的鉴定

通过对3个辣椒疫病病原分离物鉴定结果表明,陕西辣椒疫病致病菌为Phytophthora Capsici Leon.病原菌的抱子囊有卵形、近球形、长椭园形、梨形和不规则形,长宽比1.5-1.6,乳突明显,没有层出现象,会脱落,带有长柄,对浓度为1:8×10⁶的孔雀绿不敏感,寄主范围广泛.此外,确认ph₁的致病性较强,可用于杭性筛选.     

辣椒疫病菌生物学特性的研究

研究表明，辣椒疫病菌（ＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉＬｅｏｎｉａｎ）的菌落形态多为绒毛型，孢子囊会脱落，带有长柄，形态大小变化很大，长宽比１．４～１．７，乳突明显；混合菌株可形成藏卵器，雄器底生；菌株在１２～３５℃范围内均可生长，最适生长温度为２８℃；对浓度为１／８×１０－６的孔雀石绿不敏感；不同菌株利用淀粉的能力差异很大；孢子囊的形成受湿度的影响，湿度越大，孢子囊形成越多；形成孢子囊的最适温度为２０～２８℃；ｐＨ值影响孢子囊萌发方式和萌发率，适当偏酸，孢子囊萌发率高，有利于形成游动孢子；病菌可侵染茄科、葫芦科等多种作物。