东乡野生稻苗期耐冷QTL qCTS3.3候选基因LOC_Os03g53670-DX在低温胁迫下的表达及克隆

【目的】研究东乡野生稻苗期耐冷QTL qCTS3.3候选基因的功能。【方法】结合课题组前期完成的转录组分析数据,将落在qCTS3.3 QTL区域的东乡野生稻苗期耐冷相关差异表达基因LOC_Os03g53670-DX作为qCTS3.3的候选基因,通过实时荧光定量PCR验证不同冷胁迫处理下东乡野生稻中该基因表达情况,并利用RT-PCR技术从东乡野生稻幼苗中扩增LOC_Os03g53670-DX的全长cDNA,并进行该基因的过表达载体构建。【结果】测序结果表明:LOC_Os03g53670-DX基因的cDNA全长为1 986 bp,共编码661个氨基酸,蛋白分子量为173 ku,理论等电点(pI)为4.92。在线分析软件预测LOC_Os03g53670-DX氨基酸序列近C端包含1个高度保守结构域YTH,表明该基因属于RNA结合蛋白。系统进化分析表明:LOC_Os03g53670-DX与高粱(XM_021447002.1)和菠萝(XM_020225621.1)的YTH结构域基因位于同一进化分支上,亲缘关系最近。进一步利用农杆菌介导转化方法,经潮霉素筛选及转基因苗叶片GUS化学染色阳性鉴定,最终得到了转入LOC_Os03g53670-DX基因的26株阳性转基因植株。【结论】本研究为后续LOC_Os03g53670-DX基因在冷胁迫条件下的功能和作用机制研究奠定材料基础。     

东乡野生稻MYB转录因子LOC_Os01g62410-DX苗期低温诱导荧光定量表达分析及克隆

为了阐明东乡野生稻中MYB转录因子基因 LOC_Os01g62410-DX在低温胁迫条件下的功能作用机制,依据课题组前期的转录组分析数据,以东乡野生稻和籼稻品种"93-11"为材料,通过实时荧光定量PCR分析该基因位点在冷胁迫条件下的表达模式。并参考公共数据库中测序水稻品种日本晴对应位点的序列信息设计引物,利用RT-PCR技术,从东乡野生稻中扩增获得 LOC_Os01g62410-DX基因的全长cDNA,构建该基因的过表达载体。序列分析结果表明, LOC_Os01g62410-DX基因的cDNA全长为1 500 bp,共编码499个氨基酸,蛋白质分子质量为55.04 ku,理论等电点(pI)为7.62。在线分析软件预测 LOC_Os01g62410-DX氨基酸序列N端包含2个高度保守结构域SANT,表明该基因属于R2R3类MYB转录因子。系统进化分析结果表明 LOC_Os01g62410-DX与水稻Osmyb3和 Osmyb4编码的蛋白位于邻近分支上,亲缘关系最近。进一步利用农杆菌介导转基因方法,获得转入 LOC_Os01g62410-DX基因的37株阳性转基因植株,为深入研究东乡野生稻 LOC_Os01g62410-DX基因在低温胁迫条件下的作用机制奠定材料基础。     

水稻LOC_Os10g05490位点冷胁迫条件下表达分析及CRISPR/Cas9定向编辑

为探明LOC_Os10g05490位点冷胁迫条件下的表达特性和耐冷性功能,以耐冷东乡野生稻和冷敏感水稻93-11为试验材料进行了半定量分析,结果表明,LOC_Os10g05490在冷敏感水稻93-11冷处理前后表达丰度相当,而在耐冷东乡野生稻中冷处理后表达丰度下调,这一结果与前期转录组测序(RNA-seq)结果相符,进一步验证了该位点可能与水稻耐冷相关,随后利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对LOC_Os10g05490编码区于同样具有较强耐冷性的粳稻品种台北309中实施定向基因敲除,并成功获得了26株转基因阳性植株。     

东乡野生稻苗期根系耐冷性生理生化特性

利用沙培法,研究了耐冷性不同的东乡野生稻和水稻品种幼苗在不同低温胁迫下根系活力、CAT活性、POD活性及MDA含量等根系生理活性的变化规律。结果表明：不同耐冷性水稻品种在3叶1心期经过3d的不同低温胁迫后,其根系生理活性发生了显著变化。强耐冷东乡野生稻和东野1号的根系活力、CAT活性和POD活性都随着低温胁迫的加剧而呈现先降后升再降的趋势;冷敏感的2个籼稻品种的根系活力和CAT活性则一直呈下降趋势,POD活性却先升后降;4个水稻品种的MDA含量都随着低温胁迫的加剧而加幅上升,但2个冷敏感品种的增幅更大。另外,常温或轻微低温胁迫下,冷敏感品种的CAT活性和POD活性不一定比强耐冷品种低。因此,认为低温胁迫下根系活力和根系MDA含量的相对大小可作为耐冷性生理鉴定指标。     

水稻苗期抗冷QTL的检测

利用2011年夏初(5月30日至6月3日)的低温天气,对粳稻Nipponbare、籼稻Kasalath及其杂交后回交衍生的98个BC1F5回交重组自交系群体进行苗期自然低温处理.通过分析其对应的包含245个分子标记的连锁图谱与苗期抗冷能力的关系,共检测到控制苗期抗冷的2个主效QTL和1个微效QTL,主效QTL分别是位于第1染色体上的qCTS1和位于第3染色体上的qCTS3;微效QTL是位于第8染色体上的qCTS8.其中,两个主效QTL的抗冷等位基因来自于粳型亲本日本晴,而微效QTL的抗冷等位基因来自于籼型亲本Kasalath.三者的表型贡献率分别为30.8％、22.7％和10.3％.这些QTL将为水稻抗冷设计育种提供“元件”,同时为阐明水稻抗冷分子机制提供基础信息.     

基于高密度遗传图谱定位水稻籽粒大小相关性状QTL

【目的】通过对水稻籽粒大小相关性状进行QTL定位及候选基因的筛选,为水稻籽粒大小相关基因的精细定位、克隆及基因功能等研究奠定基础。【方法】以籼稻品种特华占搭载高空气球空间诱变后产生的特异矮秆突变体CHA-1为母本,以籼稻品种航恢7号搭载"神州八号"飞船经空间诱变后筛选出的突变体H335为父本杂交衍生出的275个RIL群体作为供试材料,利用GBS测序技术构建高密度遗传图谱,RIL群体及亲本分别于2017年早季和2017年晚季在华南农业大学实验教学基地种植。成熟收获后通过扫描仪获取水稻籽粒图像,利用SmartGrain软件获取籽粒大小相关性状表型数据。采用QTL IciMapping v 4.0软件基于完备复合区间作图法,对水稻籽粒大小相关性状进行QTL定位。【结果】构建的高密度遗传图谱包含2 498个Bin标记,总图距2 371.84cM,标记间平均遗传图距为0.95 cM。两季共检测到26个籽粒大小相关QTL,分布于第1、2、3、4、7和9染色体上,单一QTL贡献率为0.16%—14.41%。在第1、2、3、7染色体上检测到5个QTL簇(qGS1、qGS2、qGS3-1、qGS3-2和qGS7)。其中qGS1、qGS3-2和qGS7与前人报道相似,qGS2和qGS3-1是新发现的籽粒大小相关QTL,qGS2在2个季别的不同性状中被检测在同一标记区间附近,LOD值介于4.00—8.08,贡献率为6.67%—11.38%。qGS3-1在2个季别下均检测到与籽粒厚度相关,LOD值介于2.94—8.59,贡献率为4.69%—14.41%。使用的高密度遗传图谱定位区间较小,结合功能注释和CREP数据库表达谱,在qGS2位点筛选到4个潜在的与籽粒大小相关的注释基因LOC_Os02g42310、LOC_Os02g42314、LOC_Os02g42370和LOC_Os02g42380。其中LOC_Os02g42310编码一个丝氨酸羧肽酶;LOC_Os02g42314编码一个泛素E2结合酶;LOC_Os02g42370编码一个类受体蛋白激酶;LOC_Os02g42380编码一个TCP转录因子。在qGS3-1位点筛选到3个潜在的与籽粒大小相关的注释基因LOC_Os03g39020、LOC_Os03g39150和LOC_Os03g39230。其中LOC_Os03g39020编码一个驱动蛋白结构域;LOC_Os03g39150编码一个蛋白激酶结构域;LOC_Os03g39230编码一个具有去蛋白质泛素化功能的OTU-like半胱氨酸肽酶。其中编码泛素E2结合酶的LOC_Os02g42314和编码驱动蛋白结构域的LOC_Os03g39020在幼穗和授粉后的胚乳中表达量较高,推测其为最可能的调控籽粒大小的候选基因。【结论】共检测到26个水稻籽粒大小相关QTL。在第1、2、3和7染色体上检测到5个QTL簇(qGS1、qGS2、qGS3-1、qGS3-2和qGS7),其中qGS2和qGS3-1为新发现的控制籽粒大小QTL,并在该位点筛选到2个可能调控水稻籽粒大小相关的候选基因。     

水稻Os09g29390基因冷胁迫表达模式及亚细胞定位分析

为了研究水稻Os09g29390基因在冷胁迫条件下的功能,以水稻苗期冷胁迫基因表达谱芯片中编码水稻质体蓝素类蛋白(Plastocyanin like protein)的下调表达基因Os09g29390为研究对象,对Os09g29390基因进行冷胁迫下表达特性分析、同源性分析及亚细胞定位分析.结果表明,Os09g29390基因在冷胁迫处理下表现为下调表达模式;氨基酸相似性分析与保守结构域分析显示,Os09g29390基因与其同源基因的氨基酸编码序列具有一个保守的铜结合位点;将Os09g29390基因与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合,转化烟草原生质体,结果Os09g29390基因定位于细胞叶绿体中.以上结果初步阐明该基因在冷胁迫下的表达特性及作用位点,为以后更深入的研究该基因的功能提供了指导.     

东乡野生稻根系抗氧化系统对冷胁迫的反应

以强耐冷的东乡野生稻和冷敏感的晚籼稻926为材料,研究了它们根系抗氧化系统对冷胁迫的反应。经过3 d不同水平的冷处理后,东乡野生稻根系的电解质渗透率和丙二醛(MDA)含量受影响较小,而晚籼稻926根系的则随着冷胁迫的加剧而加速上升;东乡野生稻根系的过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性仍然较高,而晚籼稻926的则随着冷胁迫的加剧而加速下降。这些结果表明:在冷胁迫下具有较小的电解质渗透率、较低的丙二醛含量和较高活性的抗氧化酶是东乡野生稻根系强耐冷的主要原因。     

东乡野生稻耐冷片断导入系基因表达谱的比较分析

通过对东乡野生稻的渗入系群体进行低温筛选,获得了5个耐冷性较强的株系。通过对耐冷株系IL732和轮回亲本赣香B常温和低温下基因表达谱(DEG)差异的分析,筛选得到22个在IL732中特异响应冷胁迫的基因,其中存在多个参与糖类代谢的酶。这些酶基因的特异表达表明东野的耐冷机制可能与东野独特的能量代谢或多糖类物质代谢调控过程有关。     

东乡野生稻耐冷片断导入系基因表达谱的比较分析

通过对东乡野生稻的渗入系群体进行低温筛选,获得了5个耐冷性较强的株系。通过对耐冷株系IL732和轮回亲本赣香B常温和低温下基因表达谱(DEG)差异的分析,筛选得到22个在IL732中特异响应冷胁迫的基因,其中存在多个参与糖类代谢的酶。这些酶基因的特异表达表明东野的耐冷机制可能与东野独特的能量代谢或多糖类物质代谢调控过程有关。     

水稻卷叶突变体rlm1的基因克隆

叶片是植物光合作用的主要场所,优良的叶片形态有利于塑造理想的株型,提高光合效率。为了研究叶片形态建成的分子机制,自水稻T-DNA插入突变体库中筛选获得1个叶片半卷曲的卷叶突变体(roll leaf mutant,命名为rlm1),突变体rlm1主要特征为成熟叶片沿中脉向内卷,叶片最终卷成直立半圆筒状,叶片卷曲度达0.64,叶片直立参数达95,且光合效率显著优于野生型。通过图位克隆技术,确定突变体rlm1突变位点位于LOC_Os03g06654基因的第1个内含子,LOC_Os03g06654基因编码黄素单氧化酶(flavin-containing monooxygenase),RT-PCR表达分析表明LOC_Os03g06654基因因T-DNA插入而导致完全失活。该基因与已报道的水稻卷叶基因Os COW1(Constitutively Wilted 1)为等位基因,而且突变体rlm1所表现的农艺性状均佳,可期待利用该突变体进行高光合的育种实践。     

水稻穗长基因qPL9的精细定位及其候选基因分析

[目的]本研究旨在发掘水稻产量相关基因,为水稻产量性状改良提供新的种质资源,为水稻穗发育遗传研究提供分子证据。[方法]利用表型差异明显的粳稻‘茭白稻’和籼稻‘Saber’构建F_2群体,对其株高及穗部性状进行QTL检测。根据F_2结果,构建F_(2∶3)分离群体,对效应值较高的穗长QTL qPL9进行验证、精细定位和候选基因预测,并对候选基因进行克隆、测序和序列比对分析。[结果]在F_2群体中检测到株高、穗长、每穗颖花数、二次枝梗数、粒长和粒宽共6个性状的16个QTL。其中效应最高的qPL9解释了32.8%的穗长变异,位于SSR标记RM1189和L171之间,LOD值为8.27。对qPL9所在位点进行验证后进行精细定位,最终将其定位在InDel标记L174与L171之间,物理距离为90.47 kb,含有9个开放阅读框(ORF)。分析候选基因序列,发现LOC_Os09g28300、LOC_Os09g28310和LOC_Os09g28320的编码序列在‘茭白稻’和‘Saber’间有差异,且导致氨基酸序列差异。[结论]qPL9是新位点,其候选基因可能为LOC_Os09g28300、LOC_Os09g28310和LOC_Os09g28320。     

水稻苗期高温RNA-SEQ分析

利用水稻苗期转录组数据,分析在高温处理条件下不同时间段基因表达水平变化,筛选出可能参与高温热害的基因.LOC_Os04g04970、LOC_Os03g15960和LOC_Os03g51459,其在受到热处理1 h的表达水平显著上调,随着热处理的时间延长,其表达水平逐渐降低,可能与热处理相关.该研究可为进一步揭示水稻苗期高温热害分子生物学研究提供参考.     

东乡野生稻苗期根系形态性状耐冷性遗传分析

采用沙培法,应用主基因多基因混合遗传模型分析了低温胁迫下强耐冷的东乡野生稻与两个冷敏感籼稻所配组合6个世代材料苗期根系形态性状的遗传,发现东乡野生稻最长不定根长的遗传属于1对加性主基因+加性-显性多基因遗传,不定根数为2对显性-加性-上位性主基因遗传。其中主基因的遗传力都不是很高,表明环境对水稻根系耐冷性的遗传有着不可忽视的影响。     

水稻耐冷基因研究进展

低温冷害是影响水稻高产、稳产的重要限制因素之一.鉴定优异的耐冷种质资源,采用合适的方法发掘其优异的基因源,通过分子育种等手段高效和精确地培育耐冷的水稻品种,是解决上述低温冷害的关键.加快耐冷性状的改良对促进水稻的高产、稳产具有重要意义.以水稻耐冷基因研究为核心,综合述评了水稻耐冷QTL定位、克隆和水稻耐冷转录因子调控,探讨了水稻耐冷相关基因研究存在的问题.由于以往耐冷QTL定位的精度有限,很难在分子育种中应用;且已克隆的耐冷相关基因由于其耐冷机制的复杂性,在育种中的应用也很少.联合连锁和关联分析可以提高QTL检测的效应和定位精度.因此,利用联合连锁和关联定位方法,挖掘耐冷基因,构建高效的水稻耐冷基因精细定位的策略,并应用于分子育种,值得深入研究.     

水稻B-box锌指蛋白基因OsBBX26的 克隆及表达分析

[目的]克隆水稻B-box锌指蛋白基因(OsBBX26),并分析其在非生物胁迫下的表达模式,为探究水稻B-box蛋白的非生物胁迫响应机制提供理论依据.[方法]以水稻模式品种日本晴为材料,采用RT-PCR克隆OsBBX26基因,对其进行生物信息学分析,并通过构建pBA-OsBBX26-YFP植物表达载体进行亚细胞定位.同时,采用实时荧光定量PCR检测分析OsBBX26基因的组织特异性及非生物胁迫(干旱、ABA、低温和高盐)下的表达模式.[结果]克隆获得的OsBBX26基因(LOC_Os08g42440)cDNA全长序列为1467 bp,编码488个氨基酸,其编码蛋白分子量为51.86 kD,理论等电点(pI)为6.63,包含1个B-box锌指结构域和1个CCT结构域,其中B-box结构域位于第13~60位氨基酸,CCT结构域位于第435~478位氨基酸,该蛋白定位于细胞核中.OsBBX26基因位于8号染色体上,启动子区域除了含有TATA-Box和CAAT-Box等基本转录元件外,还含有与逆境相关的顺式作用元件,包括低温响应元件LTR、脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、厌氧响应元件ARE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,以及MYB转录因子结合位点.OsBBX26蛋白与粳稻B-box蛋白亲缘关系最近,其次与籼稻B-box蛋白亲缘关系较近,与其他植物B-box蛋白也存在较高的相似性,其中与小米、大麦、高粱、玉米和短柄草B-box蛋白的氨基酸序列相似性分别达72%、72%、71%、69%和68%.OsBBX26基因在幼叶中的表达量最高,其次是在成熟叶片中,在幼根、成熟根、茎和幼穗中的表达量均极低,表明该基因表达具有明显的组织表达特异性.干旱、高盐、ABA和低温胁迫处理下OsBBX26基因均上调表达,干旱、高盐和ABA胁迫处理12 h达峰值,但低温胁迫处理在24 h后才达峰值.[结论]OsBBX26基因受干旱、高盐、ABA和低温胁迫诱导均上调表达,推测其参与水稻植株响应多种非生物胁迫,在逆境响应中发挥重要调控作用.     

利用高密度 Bin 图谱定位水稻叶绿素含量 QTL

【目的】探索水稻叶绿素含量及其对氮肥响应的遗传机理,为氮高效、高光效的水稻品种培育提供新的标记区段。【方法】以珍汕 97× 明恢 63 重组自交系 RIL（F11）113 个家系为 QTL 分析的试验材料,在大田栽培条件下,以施氮量为主区、家系为裂区,设计低氮处理（不施氮肥）和正常氮处理（纯氮130、135 kg/hm2）,分别于水稻移栽后 30 d 测定 1.5 叶的 SPAD 值,于抽穗期测定剑叶的 SPAD 值。利用包含1 619 个 Bin 标记的高密度遗传图谱,使用 IciMapping V3.4 软件和完备区间作图法,定位控制水稻叶片叶绿素含量的 QTL。【结果】在两年、两个氮处理和两个发育时期共检测到 15 个调控叶片叶绿素含量的 QTL,分别分布在第 1、2、3、6、7、10、11 号染色体上。单一 QTL 贡献率为 1.21%~40.74%。通过物理位置比较,发现其中 6个 QTL 已经被克隆或与前人定位到的叶绿素含量相关位点在同一区间。其中,在第 6 染色体的 8.45~9.12 Mb 处定位到 1 个调控抽穗期剑叶叶绿素的位点,命名为 qHDCHL6-1,该位点在两年和两个氮处理下均被检测到,贡献率为 1.55%~28.01%。结合功能注释,共筛选到 4 个与叶绿素代谢密切相关的基因,分别为 LOC_Os06g15370（OsNPF3.1）、LOC_Os06g15420（OsAS2）、LOC_Os06g15620（GAST）和 LOC_Os06g15590,其中前 3 个基因已被鉴定克隆。【结论】共检测到 15 个控制水稻移栽后 30 d 和抽穗期叶片叶绿素含量的 QTL,鉴定了 1 个稳定表达的 QTL 位点 qHDCHL6-1,在该区间筛选到 4 个候选基因。     

东乡野生稻苗期耐冷性的QTL定位

【目的】研究东乡野生稻苗期耐冷性的QTL和连锁标记,为水稻耐冷种质资源的利用及分子标记辅助选择育种提供理论和实践依据。【方法】以东乡野生稻作为非轮回亲本,南京11号为轮回亲本,构建144株BC2F1分离群体。通过SSR标记以根电导率作为耐冷性指标,以复合区间定位法对东乡野生稻苗期耐冷性进行QTL定位。【结果】检测到2个QTL qRC10-1和qRC10-2均位于第10染色体,对表型的贡献率分别为34.13%和37.02%,是两个主效的QTL。在与2个QTL的连锁标记RM171周围发展分子标记进一步定位,检测到3个QTL位于标记RM171附近。【结论】东乡野生稻第10染色体上的2个QTLqRC10-1,qRC10-2与苗期耐冷性有关,并位于SSR标记RM304-RM1108区间,可用于水稻耐冷性分子标记辅助选择育种。     

低温环境下水稻种子活力QTL鉴定

【目的】提高水稻芽期低温抗性,发掘低温环境下水稻种子活力相关基因,可为培育抗冷品种提供新的基因和种质资源。【方法】以耐冷型粳稻龙稻5号和冷敏感型籼稻中优早8杂交衍生的重组自交系(recombinant inbred lines,RILs)群体为试验材料,鉴定自然和人工低温环境下种子活力相关的QTL。【结果】不同低温胁迫环境下,龙稻5号种子具有较强的活力,中优早8种子的发芽率均显著低于龙稻5号;群体中不同株系低温发芽率存在较大差异,籼粳属性影响水稻种子低温环境下发芽率,但相关性未达到显著水平。共检测到10个控制低温环境下种子活力相关的QTL,自然和人工低温胁迫环境下各检测到5个相关的QTL,分布于第2、3、7、8、11和12号染色体上,3个QTL在不同环境下共性表达;共检测到17对上位性互作位点,第1、2、3和12号染色体区域上位性效应明显,加性效应QTL qLTGN2和qLTG12参与上位性互作。【结论】自然和人工低温胁迫环境下种子活力表型和QTL有较好的重复性,稳定表达的QTL qLTG8、qLTG11和qLTG12对低温环境下发芽率具有明显的调控效应,且上位性互作也是调控水稻芽期耐冷性的重要组成部分。     

普通菜豆14-3-3蛋白基因PvGF14h的克隆及冷胁迫诱导表达分析

根据14-3-3蛋白的保守性及菜豆基因组信息,从普通菜豆品种东北小油豆中克隆了一个14-3-3蛋白基因PvGF14h.生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白以α螺旋为主导结构,具有典型的14-3-3蛋白结构域,主要分布在细胞质与过氧化体中,具有磷酸化位点;序列比对及进化树分析表明,它与大豆14-3-3蛋白SGF14h有较高的同源性(可达98.1％);进一步利用实时定量RT-PCR分析PvGF14h响应冷胁迫的表达模式,结果表明该基因的表达随着冷胁迫处理时间的增长而增加,因此推测PvGF14h可能参与了冷胁迫的信号转导过程.这些关于菜豆14-3-3蛋白基因的基本信息为进一步研究其功能尤其在响应低温胁迫方面奠定了基础.