盐胁迫下耐盐番茄根的蛋白质组分析

以导入红海榄总DNA的耐盐番茄及其野生型番茄为材料,于3~4片真叶期分别用调和海水(1.07%盐度)和自来水进行灌溉,处理14d后,采用BPP法提取番茄根部的全蛋白质,通过等电聚焦和SDS–PAGE电泳得到番茄根部全蛋白质双向电泳图谱。利用Image Master 2D Platinum 6.0对双向电泳图谱进行分析发现,供试番茄根部全蛋白质双向电泳图谱大约有550个蛋白质点,其中耐盐番茄与野生型番茄蛋白质表达量比值大于1.5或小于0.66的有139个;海水处理下,耐盐番茄与野生型番茄根部蛋白质表达量比值大于2.0或小于0.5的有69个,其中37个蛋白点的表达量为上调,28个蛋白点的表达量为下调,此外还有4个特异蛋白点。     

一种优化的适用于双向电泳的水稻纹枯病菌蛋白质提取方法

为开展水稻纹枯病菌蛋白质组学的研究,采用TCA-丙酮法、SDS法和TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法对水稻纹枯病菌蛋白质提取质量进行比较,并建立了双向电泳体系。对电泳后的图谱用Quantity One软件进行分析,结果发现:TCA-丙酮法、SDS法和TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法所获得的蛋白质双向电泳图谱中,分别记录得到557、309和877个蛋白质点。SDS法提取的蛋白质样品杂质较多,存在盐离子和小分子物质干扰,得到的蛋白点较少;TCA-丙酮法提取的蛋白质样品呈黄色,有色素残留;而在TCA-丙酮法的基础上,增加酚/SDS抽提步骤,能够有效地去除样品中的盐离子和色素等杂质,获得背景清晰、分辨率高的蛋白图谱。结果表明,本研究建立了一种优化的TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法,该法适用于水稻纹枯病菌蛋白质双向电泳的提取。     

分蘖洋葱叶片总蛋白提取与双向电泳条件优化

以分蘖洋葱叶片为试验材料,比较3种不同蛋白质提取方法对2-DE蛋白质双向电泳结果的影响,并对其中的蛋白上样量、SDS-PAGE凝胶浓度及双向电泳重复性进行筛选与优化。结果表明,与酚提取法和改良的酚提取法相比,TCA-丙酮提取法提取分蘖洋葱叶片总蛋白的操作简便,所得双向电泳图谱背景清晰,蛋白质点圆滑,数量及质量均较好,是一种切实可行的提取分蘖洋葱叶片总蛋白方法。应用Image Master 2D Platinum 7.0软件对图谱进行分析,凝胶上检测到超过650多个蛋白质点,不同凝胶之间蛋白质的匹配率达92.5%,具有较高的分辨率和重复性,建立一套适用于分蘖洋葱叶片总蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)方法。     

NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片蛋白质差异表达谱的建立

目的为了研究刚毛柽柳响应盐胁迫的作用机制, 本研究以刚毛柽柳叶片为材料, 对叶片总蛋白质的提取方法进行优化, 探究出适用于双向电泳的刚毛柽柳叶片总蛋白质的提取方法, 并建立NaHCO₃胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白质的表达谱。方法本研究比较了改良Tris-三氯乙酸, 改良Tris-三氯乙酸+PVP40, 改良Tris-三氯乙酸+丙酮和植物蛋白提取试剂盒法4种提取植物蛋白质的方法提取刚毛柽柳叶片总蛋白质的差异, 并利用蛋白质双向电泳用技术研究NaHCO₃胁迫后刚毛柽柳叶片蛋白质表达变化, 建立了盐胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白表达谱。结果采用改良Tris-三氯乙酸法提取刚毛柽柳叶片蛋白质, 利用该方法可获得高质量的蛋白质样品, 所得到的双向电泳凝胶图谱中蛋白质分离效果好、图谱分辨率高, 通过ImageMaster 2D Platinum 7.0凝胶分析软件对NaHCO₃处理0和12 h的双向电泳凝胶图谱进行分析, 获得了25个响应盐胁迫的差异表达蛋白质, 并分析了差异表达蛋白量的变化。结论研究结果表明, 利用改良Tris-三氯乙酸法提取刚毛柽柳叶片蛋白质适用于双向电泳体系, 该方法可以用于对刚毛柽柳叶片蛋白质组学的研究。本研究建立了NaHCO₃胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白质的表达谱, 为进一步分析刚毛柽柳耐盐分子机制奠定了基础。      

金心黄杨(Euonymus japonica L. cv. aureo-pictus)叶片总蛋白质提取及双向电泳技术

通过比较2种不同的植物叶片总蛋白质提取方法(三氯乙酸/丙酮法和酚法)和优化双向电泳各试验环节,建立金心黄杨叶片总蛋白质的提取方法,以及可以对其蛋白质组进行质谱分析的双向电泳条件。结果采用优化后的酚法进行金心黄杨叶片总蛋白质的提取,IEF蛋白上样量150μg,SDS-PAGE采用12.5%T凝胶,电泳结束后用考马斯亮蓝G-250染色,Melanie 7.0软件分析后得到约274个可分辨蛋白点。     

金心黄杨（Euanymus japonica L. cv. aureopictus ）叶片总蛋白质提取及双向电泳技术

通过比较2种不同的植物叶片总蛋白质提取方法（三氯乙酸／丙酮法和酚法）和优化双向电泳各试验环节,建立金心黄杨叶片总蛋白质的提取方法,以及可以对其蛋白质组进行质谱分析的双向电泳条件。结果采用优化后的酚法进行金心黄杨叶片总蛋白质的提取,IEF蛋白上样量150μg,SDS-PAGE采用12．5％T凝胶,电泳结束后用考马斯亮蓝G-250染色,Melanie 7．0软件分析后得到约274个可分辨蛋白点。     

番茄转导外源DNA耐盐变异后代双向电泳分析

通过采用三氯乙酸(TCA)/丙酮法、酚提取法、DTT/丙酮法3种提取方法提取番茄叶片可溶性总蛋白,用150μg和250 μg2种加样量、浓度为12.5％和15％的聚丙烯酰胺凝胶二向电泳进行电泳,发现TCA/丙酮沉淀法提取番茄叶片可溶性总蛋白、加样量为250μg、12.5％聚丙烯酰胺凝胶二向电泳效果较好,从而建立了番茄叶片总蛋白双向电泳技术优化体系.用该体系对转导碱蓬总DNA的耐盐转化番茄叶片全蛋白的差异分析,鉴定出6个蛋白差异点,其中5个特异蛋白在耐盐转化番茄中表达,1个特异蛋白在未转化番茄中表达.     

广藿香叶片总蛋白双向电泳体系的建立

比较2种方法提取广藿香叶片总蛋白质的得率与聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白条带,同时对广藿香叶片总蛋白质双向电泳条件进行了优化,利用MALDI-TOF-TOF和Swiss-Prot软件对部分蛋白点进行质谱鉴定。结果表明:使用TCA/丙酮法提取广藿香叶片总蛋白,在10万Vhs聚焦强度下,可获得高分辨率双向电泳图谱,BPP酚抽法获得的蛋白不适用于双向电泳分析;经质谱成功鉴定了9个蛋白点,鉴定成功率90%。     

潮间带大型海藻小珊瑚藻蛋白质提取方法及双向电泳体系优化

为建立适用于潮间带大型海藻小珊瑚藻(Corallina pilulifera)蛋白质组学分析的样品制备方法,分别用饱和酚抽提法、三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法、Trizol提取蛋白法、Biozol提取蛋白法、饱和硫酸铵沉淀法对蛋白质进行提取,筛选出小珊瑚藻蛋白质提取的最优方法,并从胶条pH值和分离胶浓度探究双向电泳系统的优化条件。结果表明,在胶条pH值为4～7和分离胶浓度为12.5%条件下,并使用饱和酚抽提法提取蛋白质,所提取蛋白质不仅浓度高且纯度较高,因而可获得稳定清晰、蛋白质点数较多的双向电泳图谱。该体系可为红藻门大型海藻的蛋白质组学分析提供重要的技术参考。     

白桦木质部蛋白提取方法的建立1）

以白桦（ Betula platyphylla Suks．）木质部为试验材料,分别采用TCA—丙酮提取、酚提取和试剂盒提取3种方法提取白桦木质部总蛋白。利用试剂盒定量和聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳技术比较3种提取方法的蛋白质提取效率、提取质量。同时对酚提取法进行改良,建立适用于白桦木质部蛋白的提取方法。研究结果表明,改良的酚提取法提取的白桦木质部蛋白提取量最大,电泳条带清晰,丰富,质量较高。2－DE电泳得到的蛋白凝胶背景干净,蛋白质点清晰。因此,改良的酚提取法是较适合于白桦木质部蛋白的提取方法。     

橡胶树C-乳清三种蛋白提取方法双向凝胶电泳分析

摘要：C-乳清是胶乳的主要组分,就双向凝胶电泳技术而言,目前仍无有效的蛋白提取方法,这严重制约了双向凝胶电泳技术在橡胶树蛋白组分析上的应用。本文选取3种方法提取C-乳清蛋白,通过对蛋白产量和提取蛋白的双向凝胶电泳图谱分析系统评价3种方法。就蛋白产量而言,三氯乙酸/丙酮沉淀法产量最高（0.86 mg/ml C-乳清）,三氯乙酸沉淀法次之（0.72 mg/ml C-乳清）,酚提取法最低（0. 66 mg/ml C-乳清）。双向凝胶电泳图谱分析表明：酚提取法可检测到447个蛋白点,图谱背景较暗且横纵向纹理多;三氯乙酸沉淀法可检测到821个蛋白点,图谱背景居中;三氯乙酸/丙酮沉淀法可检测到1052个蛋白点,图谱背景清晰且基本无纹理。综上所述,三氯乙酸/丙酮沉淀法最适合C-乳清蛋白提取。本文首次系统评价C-乳清蛋白提取方法,必将推动橡胶树C-乳清蛋白研究发展。     

烟草根系蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

为探索适于烟草根系蛋白质组学研究的样品制备方法,以栽培品种K326生长期根系为材料,比较了常规裂解液法、TCA/丙酮沉淀法、Trizol抽提法和酚法等4种总蛋白质的提取方法。对制备的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)检测。结果表明:酚法最佳,所获蛋白在单向SDS-PAGE中形成条带数目多而清晰;经双向电泳分离用银染显色,可检测约548个蛋白点,图谱分辨率较好,蛋白点清晰,主要集中在等电点pH5～8、相对分子量25.0～70.0kD,可有效解析烟草根系的蛋白质组。     

两种花吊丝竹叶片蛋白提取方法的2-DE比较

以2年生花吊丝竹的扦插苗为研究材料,对2种方法(TCA/酚提结合法和PEG法)提取的蛋白质的2-DE差异进行研究.结果表明:PEG法的5个组分的条带差异明显,全蛋白得到了有效分离,在F3中富集到了2条高丰度蛋白带;2种方法的2-DE图谱的均一性分析发现,PEG法中F3富集了高丰度蛋白,提高了2-DE中蛋白质的检测率和分辨率,PEG法中F1-F5共检测的蛋白总数超过了1700个,但是相邻组存在一定的重叠率,而TCA丙酮/酚提结合法只检测到约571个蛋白点,5个组与NF平均有439个蛋白点匹配,达到77.9%以上;质谱鉴定了5种差异蛋白,生物信息学分析发现这5种蛋白是糖酵解、糖异生和ATP合成的重要辅酶.2种方法的比较发现,PEG法能够将花吊丝竹叶片全蛋白中高丰度蛋白单一富集在16%的组分中,从而显著提高了2-DE的分辨率,再通过质谱技术能够检测到更多的影响生物体生长发育的低丰度蛋白,所以PEG法是一种切实可行的且较为理想的蛋白质提取方法.     

福建柏叶片蛋白质双向电泳技术优化

蛋白质双向电泳是蛋白质组学研究方法之一,但蛋白质双向电泳技术体系却因物种不同而有所差异,因而蛋白质双向电泳体系的建立是进行蛋白质分离、鉴定的首要步骤。本文对福建柏叶片蛋白质提取方法、IPG胶条、等电聚焦参数设定、丙烯酰胺分离胶浓度等因子进行单因素分析,对福建柏双向电泳技术进行优化。结果表明,采用三氯乙酸-丙酮提取福建柏叶片的蛋白点多且图像清晰,p H4~7的IPG胶条最适合福建柏叶片蛋白的分离,等电聚焦参数设定为20 000 Vh,浓度为10%的分离胶进行福建柏双向电泳最好。本研究初步建立了福建柏叶片蛋白质双向电泳体系,为深入研究福建柏蛋白质组学提供依据。     

苹果叶片蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

 为探索适用于苹果叶片蛋白质组学研究的样品制备方法,比较了三氯乙酸/丙酮沉淀法（TCA）、酚-甲醇/醋酸铵沉淀法和Tris-HCl提取法等3种总蛋白质的提取方法。制备的样品经双向电泳分离采用银染显色。结果3种方法分别得到450、374和1032个蛋白质点。认为Tris-HCl提取法为最适方法,所得图谱背景清晰,蛋白质信息量最大。     

青杨双向电泳实验体系的建立

用改良丙酮沉淀法、三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法和酚抽法抽提青杨Populuscathayana的蛋白质,分别获得了437,603和721个蛋白斑点,以酚抽法提取的分离纯化方法效果最佳,不仅能很好地提取蛋白,而且能有效去除样品中的盐分。通过比较,分析了双向电泳不同条件对电泳结果的影响,确立了300μg·IPG胶条^-1的最佳上样量、90000V·h的聚焦时间以及20min平衡时间的双向电泳条件。研究还比较了氯化钠胁迫前后双向电泳图谱差异,发现有46个蛋白点存在差异,其中10个下调,36个上调（4个新诱导表达）。     

红树叶蛋白质样品制备方法的比较及其双向电泳分析

采用水溶液提取法(磷酸盐缓冲液系统)、三氯乙酸-丙酮沉淀法和Phenol改良提取法,对红树叶进行蛋白质提取,并比较分析了这3种方法的蛋白质提取率、完整性、溶解性等。结果表明:水溶液提取法得到的是胶状沉淀,基本为多糖类物质,蛋白质含量很低;三氯乙酸-丙酮沉淀法提取的蛋白质纯度较高,但双向电泳背景最低,提取率较低,蛋白质的完整性差;Phenol改良提取法的蛋白质提取率高,约为三氯乙酸-丙酮法的10倍,双向电泳凝胶背景比三氯乙酸-丙酮沉淀法要深,蛋白质的完整性好,能够被电泳分离的蛋白质点是三氯乙酸-丙酮沉淀法的7倍左右。Phenol改良提取法在蛋白质的提取率以及完整性方面远远高于其他2种蛋白质提取方法。     

叶用莴苣叶片总蛋白质双向电泳影响因素的研究

以叶用莴苣叶片为试材,研究17cm固相pH梯度胶条(pH 4～7)体系下双向电泳不同的提取方法、上样体积、定量方法等影响因素,力求确定其理想的双向电泳条件。结果表明,酚-甲醇/醋酸铵沉淀法对蛋白质提取更彻底,效果更好。对于蛋白质定量的试验,相比于常规的Bradford方法,利用无干扰蛋白质定量试剂盒具有更好的准确性。考虑叶片总蛋白质中大量Rubisco的存在,应相对增加上样量,采用考马斯亮蓝染色时取800μg到1 100μg蛋白质进行双向电泳比较合理。     

龙眼种子蛋白质组双向电泳技术的优化

为建立适用于龙眼(Dimdcarpus longanaLour.)种子蛋白质组研究的双向电泳技术,对龙眼种子蛋白质的IEF、平衡时间及染色方法等关键步骤进行了优化。结果显示,龙眼种子蛋白质主要分布在pH4-7范围内,采用酚抽法,在聚焦达到50000 W.h的情况下能充分地聚焦,等电聚焦后经平衡缓冲液Ⅰ还原15 min,再经平衡缓冲液Ⅱ二次平衡20 min,考马斯亮蓝染色,24 cm IPG胶条上样量为1.2 mg时,在龙眼种子双向电泳图谱上检测到1000个多个蛋白点,蛋白点清晰,分辨率较好。本研究所建立的一套适用于龙眼种子蛋白质组分析的双向电泳方法分辨率和重复性较高,重复样品图谱间的相关系数在0.88-0.945之间。